一种筛选自身抗原的方法

专利名称：一种筛选自身抗原的方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学和蛋白质领域，具体而言涉及一种快速筛 选自身抗原的方法。本发明的方法可以在几个月内从细胞提取的蛋白 中有效地筛选出自身抗原，而适合为自身免疫病、肺瘤等各种能够产 生自身抗体的疾病的药物制备提供有用的靶标。
背景技术：
生物、物理、化学以及药物等因素作用于机体时，可以使自身抗 原发生改变、免疫隔离部位抗原释放、分子模拟效应产生、表位扩展 以及免疫忽视被打破，这些改变可以引起自身免疫病。二十世纪七十
年代发现肿瘤患者体内可以检测到自身抗体和(或)自身反应性T淋 巴细胞，证实了肿瘤抗原(自身抗原的一种)的存在[1]。目前认为肿
子，^i因突变或重排使正常蛋白分子结构发生改变，糖基化等原因导 致异常的细胞蛋白特殊的降解产物，隐蔽抗原表位的暴露，胚胎抗原 或分化抗原的异常表达等。
自身抗原的鉴定对研究自身免疫病，肺瘤疾病的发病机理，机体
的免疫功能与疾病发生发展和转归的相互关系至关重要；是发展有效 的疫苗，诊断试剂，治疗性抗体，筛选有效药物靶点的必要前提。因 此自身抗原鉴定的新方法不断出现，根据研究目的不同大致可以分为 两大类[2]， 一是以探索新型抗原或抗体为目的方法；二是以评价被报 道过的抗原或重要功能蛋白为目的方法。第一类抗原鉴定的方法应用 比较多的主要有两种，基于cDNA表达文库筛选的血清学分析方法 (serological analysis of recombinant cDNA expression libraries, SEREX )和基于二维凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis, 2-DE ) 、 Western-blot的血清学蛋白质组分析方 法(Serological proteome analysis, SERPA)。 第二大类方法包括 常规免疫检测方法和应用肽序列标签研究抗原的方法，前者包括酶联 免疫吸附测定(enzyme-labeled immunosorbent assay, ELISA )和 蛋白芯片法。
第一大类方法立足于发现新型的自身抗原。cDNA表达文库筛选 的血清学分析方法是目前文献报道比较多的方法，该方法的主要优点 是通量高，应用多个抗原特异的血清在一次实验中可以检测多个肿瘤 相关抗原。用SEREX方法虽然已经鉴定多种肿瘤相关的抗原[3—9]，但该 技术的主要缺点比较明显[6]: l.免疫筛选的原核表达系统不能对外源 表达蛋白进行糖基化修饰，不能保证重组蛋白的正确折叠，因此体液 免疫反应不能检测相应抗原的特定表位甚至所有表位；2. cDNA文库 的建立对高表达水平的抗原有偏好，而相应的低丰度抗原可能被漏掉； 3抗原鉴定需要的时间相当长，工作量很大。SERPA技术是2000年出 现的鉴定自身抗原的一种方法，该方法以2-DE和Western-blot为基 础，联合蛋白质语鉴定策略筛选自身抗原[1°]。与SEREX方法比较，该 方法主要的优点是整个实验耗时较短，避免了构建cDNA文库和预杂交 消除非特异性结合的步骤，可以保持蛋白的转录后修饰，更好地提供
抗原决定簇。
SERPA技术用于自身抗原的筛选研究虽然已有众多报道[1°—21]，但 其主要的不足是2-DE本身的一些缺陷如分离极酸、极碱蛋白和水溶性 差的膜蛋白能力有限，检测灵敏度的限制只能鉴定丰度相对较高的抗 原，另外2-DE是劳动密集型实验，检测的血清越多工作量越大。同时，
所需患者或对照血清量较大。第二大类方法是对现有的抗原进行评价， 而不是探索新型自身抗原的方法。
本发明人在前人工作的基础上，对SERPA技术进行了改进。为提
高低丰度抗原被鉴定的几率，采用亚细胞蛋白提取的方法将体外培养 的疾病细胞蛋白分成若干个组分，如细胞胞浆蛋白组分，细胞核蛋白 组分，膜蛋白组分和/或细胞骨架组份。亚细胞蛋白组分分离的方法可以采用手工的亚细胞组分分离方法，也可以釆用商品化的试剂盒进行
分离。其次在用SERPA技术筛选自身抗原之前将每个蛋白组分用一维 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulf ate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)进行分离，做Western印记实验
(l一Dimensional Western -卩i己， 一维Western -卩i己)4刀篩^玄细胞的 不同蛋白组分中是否存在自身抗原，筛选可能存在自身抗体的疾病血 清。同时对传统的一维Western印记方法进行改进，提高检测的通量， 降低血清用量。最后选择含有自身抗原的蛋白组分用2-DE进行分离， 然后选择几例特定的阳性血清和阴性对照血清进行Western印记实验
(2—Dimensional Western -卩i己，二维Western -卩i己)，在参t匕2—D 凝胶上找到抗原蛋白点，然后质i普鉴定。

发明内容
本发明涉及对现有鉴定自身抗原的方法SERPA技术的改进。主要 改进有四处 一、将细胞蛋白分成亚细胞组分，使得低丰度蛋白在相 应组分富集；二、加入一维Western印记方法初筛抗原库来源是否适 合抗原蛋白的筛选，确定抗原篩选的蛋白来源；三、对传统的一维 Western印记方法进行改进，提高检测的通量以适合大规模的血清筛 选；确定能够产生抗体的血清和候选抗原的分子量；四、降低传统 SERPA技术应用的血清例数，仅需要选择几例阳性血清和阴性血清分 别做二维Western印记实验，在二维凝胶上确定抗原蛋白点的位置即 可。本发明方法可以高通量的筛选自身抗原，更适合鉴定难度大的低 丰度抗原的筛选和血清抗体发生率低的病例筛选。
本发明具体提供了下述筛选自身抗原的方法，包括步骤
1) 选择可能含有抗原的蛋白样品；
2) 将所述可能含有抗原的蛋白样品分成亚蛋白组分；
3) 对每种蛋白组分进行一维Western印记初筛；
4 )根据一维Western印记实验的结果选择阳性率高的亚蛋白组 分作为二维Western印记的可能含有抗原的蛋白样品；5)通过二维Western印记对4)中的可能含有抗原的蛋白样品 进行篩选和质语鉴定。
本发明还提供了下述筛选自身抗原的方法，包括步骤
1) 釆用选择的细胞系作为可能含有抗原的蛋白样品的来源；
2) 将所述细胞系的细胞蛋白分成亚蛋白组分；
3) 以患者或健康人对照血清作为一抗，对每种蛋白组分进行一 维Western印记初篩；
4) 总结实验组和对照組阳性信号的规律，比较分析二者在不同 分子量的信号差异，包括阳性率和信号相对强弱的差异；
5) 根据一维Western印记实验的结果选择可以产生自身抗体的 典型血清为一抗，选择阴性血清为对照，选择阳性率高的亚蛋白组分 作为二维Western印记的可能含有抗原的蛋白样品；
6) 采用5)中选择的一抗、对照，通过二维Western印记对5) 中的可能含有抗原的蛋白样品进行篩选和质语鉴定。
本发明还提供了下述篩选自身抗原的方法，包括步骤
1) 首先确定可能含有抗原的蛋白样品的来源。由于组织难以避 免血清的污染和组织的异质性，建议用细胞系作为蛋白库的来源。用 商品化的试剂盒将细胞蛋白分成亚蛋白组分，即胞浆蛋白组分，膜系 统蛋白组分，细胞核蛋白组分和/或细胞骨架组份。
2) 将每种蛋白组分用一维的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行分离， 将凝胶中的蛋白转到PVDF膜或硝酸纤维素膜上。转有蛋白的PVDF切 成尽量窄的小条，每个PVDF小条做好标记放入8通道或12通道的杂 交盘中，每个通道放一根，然后以患者或健康对照血清为一抗按照 Western印记的程序做后续实验。
3) 总结实验组和对照组阳性信号的规律，比较分析二者在不同 分子量的信号差异，包括阳性率和信号相对强弱的差异。
4) 二维Western印记实验才艮据一维Western印记实验的结果 选择几例可以产生自身抗体的典型血清为一抗，进行二维Western印记实验筛选候选抗原，同时选择阴性血清为对照。在未转膜的2-D聚丙 烯酰胺凝胶上找到对应的蛋白点，然后挖点、酶解、质傳鉴定、生物学 ^i。


图1.本发明的疾病自身抗原鉴定的方法的流程图。
图2.免疫沉淀和Western印记方法IHi食管癌和健康对照血清中
抗enolase-l自身抗体的表达量。C表示食管癌血清，N表示对照血清，
B表示阴性对照。
图3.免疫组化方法验证食管鳞癌候选相关抗原enolase-1在癌 组织和癌旁正常食管上皮中的表达，其中①，②为食管癌组织，③，④ 为食管癌旁正常组织，①，③x 200;②，④x 400。
图4.肿瘤候选相关抗原PGK1在食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常 组织中的表达，其中①，②为食管癌组织，③，④为食管癌旁正常组织， ①，③x 200;②，④x 400。
具体实施例方式
^^明将在下面的实施例中进"^^^ ^i^L明并不局限于实施例。 实施例l:食管鳞癌肿瘤相关抗原的鉴定
细lfe^养^f絲细胞系EC0156和KYSE410 (EC0156细胞系源自中国医学辨 ^Jt瘤舰所，可以参考级Wang Q， Xu Y， Zhao X， Chang Y， Liu Y， Jiang L， Sha簡J， Seo DK ， Yan H. A facile one-step in situ functionalization of quantum dots with preserved photoluminescence for bioconjugation, /血Cta 5bc2007; 129: 6380"6381; KYSE410细胞系是日^:科医学院島田丰t^Hfttt)
1) EC0156和KYSE410细胞分别培养于达尔伯克改良伊格尔培养基 (Dulbecco， s Modified Eagle， s Medium,醒M)和RPMI1640培养基
中，培养基含有10。/。灭活胎牛血清，100U/ml青霉素和100jjg/ml链霉素， 在5%(]02的37X:孵箱(NAPC0, Winchester, VA )中培养。
2) 应用亚细胞蛋白提取试剂盒"ProteoExtract Kits" (Cat-No. 539790， MERCK公司)将EC0156和KYSE410细胞蛋白分成三个或四个亚组分，包括胞浆蛋白，细胞膜系统蛋白、细胞核蛋白组分和细
胞骨架组份。应用Bradford法进行蛋白定量[22]。
3) 用一维SDS聚丙烯酰胺凝胶分离不同蛋白组分采用微型电 泳槽(VE-180型，上海天能科技有限公司;Mini PROTEAN 3， Bio-Rad 公司)，12%的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白。用1. Omm厚含有2个梳齿的 梳子(其中一个梳齿宽约3mm;另外一个梳齿宽约75mm)取代常规的 10或15个梳齿的梳子制作上层积聚胶。将预染蛋白分子量标记加入 到3隱宽的孔中，将要分离的蛋白样品加入到75mm宽的孔中。也可以 选用商品化的预置梯度胶进行蛋白分离。
4) 转膜用小型转印i殳备(Mini Trans-Blot转印槽，Bio-Rad 公司)将聚丙烯酰胺凝胶釆用湿转法转移到PVDF膜上，转膜条件为4 。C110V电压1. 5小时。
5) 分割PVDF膜将转有蛋白的PVDF膜夹入两层干净的玻璃纸 中间，玻璃纸下面垫一块儿干净的玻璃板，用一次性手术刀片沿与预 染蛋白分子量标记平行的方向将膜切成3-4mm宽的小条，将每个小条 做好标记后放入8通道的杂交盘中，每条通道放一个。
6) —维Western印记实验每个通道加入lml的TBST (20mM Tris-HCl， pH7.5; 50mMNaCl; 0. l%Tween-20)配置的5°/。脱脂牛奶室 温封闭3小时或4匸封闭过夜；吸出封闭液，加入lml 5%脱脂牛奶稀 释的食管癌或健康对照血清(稀释比例1: 200 )，室温孵育3小时或 4匸孵育过夜；用洗膜緩沖液(20mMTris-HCl， pH7. 5; 200mMNaCl; 0. l°/。Tween-20)洗10次，每次5min;然后加入辣纟艮过氧化物酶标记 的山羊抗人IgG的二抗，室温孵育1小时，用洗膜緩冲液洗10次，每 次5min。将每个PVDF膜小条重新拼接在一起，等比例混合ECL超敏 化学发光试剂盒(Cat.No.P1020，北京普利莱基因科技有限公司)的 A液和B液，均匀地加到膜上，暗室曝光、显影、定影。
7) 阳性信号规律总结确定肿瘤相关抗原可能存在的蛋白组分 和相对分子量的大小，总结食管癌和健康对照血清中自身抗体发生的 阳性率，相对信号强弱的规律。本实例发现EC0156胞浆蛋白组分中肿瘤候选相关抗原有明显的规律分布，主要集中在50, 43， 37， 110， 82, 105， 70, 25kDa的蛋白条带上；细胞膜系统蛋白组分无明显肿瘤 相关抗原规律分布。KYSE410胞浆蛋白组分中肿瘤候选相关抗原主要 集中在53, 45和37kDa的蛋白条带上；而细胞膜系统蛋白组分无明显 肿瘤相关抗原规律分布。
8 ) 2-D电泳首先将EC0156和KYSE41Q细胞的胞浆组分蛋白分 别用微型的等电聚焦设备(ZOOM IPG Runner System ， Invitrogen 公司)按照蛋白的等电点不同进行分离。具体操作步骤如下将lOOjjg 的蛋白加入到155pl水化液(8M脲，2% CHAPS, 65mM DTT， 0. 5% IPG 緩沖液，痕量的溴酚蓝)，蛋白充分溶解后，緩慢加入到暗盒(Cat. No. ZM0003, Invitrogen公司)的IPG沟槽内，将7cmpH3-10的线性IPG 胶条(Cat. No. 163-2000, Bio-Rad公司)胶面朝上緩慢插入到IPG 沟槽内，注意避免气泡产生，用胶带封闭上样孔，室温水化过夜，然 后进行等电聚焦。等电聚焦的条件200V 20min, 450V 15min, 750V 15min， 2000V lOOmin。从暗盒中取出IPG胶条在平衡緩冲液(50 mM Tris-CI pH8. 8， 6M脲，30%甘油，2% SDS， 65mM DTT，痕量的溴酚 蓝)中进行平衡15min,然后向不含DTT的平衡緩冲液中加入碘乙酰 胺(终浓度140niM)进行蛋白烷化，15min。最后进行二维的SDS聚丙 烯酰胺凝胶电泳实验。
9 ) 二维Western印记实验将2-D聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白 转到PVDF膜上，根据一维Western印记实验结果总结的规律有目的的 选择疾病血清和对照血清进行二维Western印记实验。
10) 在未转膜的2-D凝胶上找到候选抗原蛋白点，进行挖点、酶 解、质镨鉴定。本实例用MALDI-T0F/T0F (Ultraflex III TOF/TOF, Bruker公司)进行鉴定，用Mascot搜索引擎搜索NCBI数据库，Mascot score>65， p<0. 05。
11) 鉴定结果和生物学验证本实例在EC0156细胞中首次鉴定了 食管癌相关的候选肿瘤抗原enolase-l， phosphoglycerate kinase 1
(PGK1 ) , heat shock protein 105kDa ( HSP105 ) ， vi画lin，phosphoglycerate mutase 1和triosephosphate isomerase 1; 在 KYSE410细胞中鉴定到两个肿瘤相关抗原P53和MBP-1。众所周知P53 是比较常见的肿瘤相关抗原，而MBP-1是enolase-l的截短表达形式， 是癌基因c-/z7/c P2启动子的负调控蛋白。目前对enolase-l和PGK1 进行了生物学验证。免疫沉淀和Western印记的方法验证了食管癌血 清中存在高滴度的抗enolase-l的自身抗体，免疫组化结果显示 enolase-l在食管癌组织中明显高表达，且亚细胞定位发生了异常改 变。免疫組化结果显示PGK1在食管癌组织中表达明显高于癌旁正常组 织，且细胞定位也发生了异常改变。其余候选抗原正在验证过程中。
根据上述实施例，本领域的技术人员完全可以想到将本发明的方 法应用到其他细胞系中，对自身抗原进行篩选。对于本发明的方法的 变形、改良都包括在本发明的范围内。
技术效果
通过本发明的方法可以避免传统的SERPA技术篩选疾病抗原的盲 目性直接用二维Western印记去筛选自身抗原，存在某种程度的盲 目性。抗原来源(如细胞系)和血清的选择虽然具有一定的随机性， 但同时具有一定的偏见性和盲目性，如初选的抗原来源可能不一定适 合自身抗原的筛选或所选的血清可能根本没有抗体的产生。而本发明 的方法中加入了一维Western印记实验初筛抗原库，同时随才几的大量 篩选疾病血清，既保证了实验的随机性又避免了盲目性，可以避免浪 费大量珍贵的血清标本和宝贵的时间。
此外，通过本发明的方法，对一维Western印记本身的改进可以 明显提高血清筛选的速度，传统的一维Western印记方法一周内只能 篩选十几例血清，而本发明中改进一维Western印记方法一周内可以 篩选上百例血清，适合大规模的筛选实验。改进的一维Western印记 实验明显提高了抗原抗体结合的效率，血清和抗原库蛋白需要量明显 减少。显改善低丰度抗原在某一组分的富集程度，提高了这类抗原被鉴定的
可能性；另外亚组分的分离可以优先筛选抗原存在概率大的组分，如 自身免疫性疾病中抗原主要集中在胞浆和胞核蛋白组分，实际操作中 可以对这两个组分进行优先筛选。
通过本发明的方法用一维Western印记实验初筛抗原后，明确了 典型病例血清和候选抗原的分子量大小，因此在做二维Western印记 实验时可以做到有的放矢，仅需要用几例典型患者血清和对照血清为 一抗，在2-D凝胶上确定抗原蛋白点即可，明显降低了传统SERPA技 术的工作量。
通过本发明的方法采用微型电泳及转膜系统较传统SERPA技术中 应用的大型电泳转膜设备可操作性更强。参考文献 Shiku H， Takahashi T， Resnick LA， et al. Cell surface antigens of human malignant melanoma. III. Recognition of autoantibodies with unusual characteristics [J]. J Exp Med， 1977， 145: 784-789 Caron M， Choquet-Kastylevsky G, Joubert-Caron R. Cancer immunomics using autoantibody signatures for biomarker discovery[J]. Mol Cell Proteomics， 2007， 6: 1115-1122 Sahin U， Tureci 0, Schmitt H， et al. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995， 92: 11810-11813 Chen YT， Scanlan MJ， Sahin U, et al. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening [J], Proc Natl Acad Sci U S A， 1997， 94: 1914-1918 Diesinger I， Bauer C， Brass N， et al. Toward a more complete recognition of immunoreactive antigens in squamous cell lung carcinoma[J]. Int J Cancer, 2002， 102: 372-378 Wang X， Yu J， Sreekumar A， et al. Autoantibody signatures in prostate cancer [J〗.N Engl J Med， 2005， 353: 1224-1235 Fernandez Madrid F， Tang N， Alansari H， et al. Improved approach to identify cancer—associated autoantigens[J], Autoimmun Rev, 2005， 4: 230-235 Shimada H， Kuboshima M， Shiratori T， et al. Serum anti-myomegalin antibodies in patients with esophageal squamous cell carcinoma [J〗.Int J Oncol， 2007， 30: 97-103 Nesslinger NJ， Sahota RA， Stone B， et al. Standard treatments induce antigen-specific immune responses in prostate cancer [J〗.Clin Cancer Res, 2007， 13: 1493-1502[10] Prasannan L， Misek DE， Hinderer R， et al. Identification of beta-tubulin isoforms as tumor antigens in neuroblastoma [J]. Clin Cancer Res， 2000， 6: 3949-3956 Klade CS， Voss T， Krystek E， et al. Ident if icat ion of tumor antigens in renal cell carcinoma by serological proteome analysis [J]. Proteomics, 2001， 1: 890-898 Brichory FM， Misek DE， Yim AM, et al. An immune response manifested by the common occurrence of annexins I and II autoantibodies and high circulating levels of IL-6 in lung cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98: 9824-9829 Brichory F， Beer D， Le Naour F， et al. Proteomics-based identification of protein gene product 9.5 as a tumor antigen that induces a humoral immune response in lung cancer[J]. Cancer Res, 2001， 61: 7908-7912 Le Naour F， Misek DE， Krause MC， et al. Proteomics-based identification of RS/DJ-1 as a novel circulating tumor antigen in breast cancer [J]. Clin Cancer Res， 2001， 7: 3328-3335 Le Naour F, Brichory F， Misek DE， et al. A distinct repertoire of autoantibodies in hepatocellular carcinoma identified by proteomic analysis[J]. Mol Cell Proteomics, 2002， 1: 197-203 Kellner R， Lichtenfels R， Atkins D， et al. Targeting of tumor associated antigens in renal cell carcinoma using proteome-based analysis and their clinical significance [J]. Proteomics, 2002, 2: 1743-1751 Seliger B， Menig M， Lichtenfels R， et al. Identification of markers for the selection of patients undergoing renal cell carcinoma-specific immunotherapy [J]. Proteomics,2003， 3: 979-990 Hong SH， Misek DE， Wang H， et al. An autoant ibody-mediated immune response to calreticulin isoforms in pancreatic cancer [J]. Cancer Res， 2004， 64: 5504-5510 Canelle L， Bousquet J， Pionneau C， et al. An efficient proteomics—based approach for the screening of autoantibodies [J〗.J Immunol Methods, 2005， 299: 77-89 Cui JW，Li WH，Wang J，et al. Proteomics-based identification of human acute leukemia antigens that induce humoral immune response"]. Mol Cell Proteomics, 2005， 4: 1718-1724 Li C， Xiao Z， Chen Z， et al. Proteome analysis of human lung squamous carcinoma [J]. Proteomics, 2006， 6: 547-558 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem, 1976， 72: 248-25权利要求
1.筛选自身抗原的方法，包括步骤1)选择可能含有抗原的蛋白样品；2)将所述可能含有抗原的蛋白样品分成亚蛋白组分；3)对每种蛋白组分进行一维Western印记初筛；4)根据一维Western印记实验的结果选择阳性率高的亚蛋白组分作为二维Western印记的可能含有抗原的蛋白样品；5)通过二维Western印记对4)中的可能含有抗原的蛋白样品进行筛选和质谱鉴定。
2. 权利要求1中的筛选自身抗原的方法，包括步骤1) 釆用选择的细胞系作为可能含有抗原的蛋白样品的来源； 2 ) 将所述细胞系的细胞蛋白分成亚蛋白组分；3) 以患者或健康人对照血清作为一抗，对每种蛋白组分进行 一维Western印记初篩；4) 总结实验组和对照组阳性信号的规律，比较分析二者在不 同分子量的印记信号差异，包括阳性率和信号相对强弱的差异；5 ) 根据一维Western印记实验的结果选择可以产生自身抗体 的典型血清为一抗，选择阴性血清为对照，选择阳性率高的亚蛋白组 分作为二维Western印记的可能含有抗原的蛋白样品；6) 釆用5)中选择的一抗、对照，通过二维Western印记对 5)中的可能含有抗原的蛋白样品进行筛选和质谱鉴定。
3. 权利要求2的方法，其中步骤l)中的细胞系选自人的肿瘤细 胞或者其他疾病相关细胞。
4. 权利要求2的方法，其中步骤2)中的亚蛋白组分包括胞浆蛋 白组分，膜系统蛋白组分，细胞骨架组份和/或细胞核蛋白组分。
5. 权利要求2的方法，其中步骤2)中的分成亚蛋白组分的方法 包括釆用商品化的试剂盒。
6. 权利要求1的筛选自身抗原的方法，其中含有抗原的蛋白样品 是EC0156和KYSE410细胞。
7. 权利要求1的筛选自身抗原的方法，其中筛选到的抗原是 enolase-l、 PGK1、 HSP105、 vinculin、 phosphoglycerate mutase 1、 triosephosphate isomerase 1、 P53和MBP-1。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体而言涉及一种改进的筛选自身抗原的方法。本发明通过提供下述方法将细胞蛋白分成亚细胞组分；进行改良的一维Western印记方法初筛；进行二维Western印记的确定性筛选。解决了常规筛选方法流失低丰度组分，筛选效率低的问题，所述方法可以全面高效地从细胞提取的蛋白中筛选出自身抗原，为自身免疫病、肿瘤等各种能够产生自身抗体的疾病的药物制备提供有用的靶标。
文档编号G01N33/53GK101556278SQ20081008958
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月8日 优先权日2008年4月8日
发明者乔媛媛, 赵晓航, 高红军 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所;中国人民解放军海军总医院