专利名称：：甲型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种曱型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：甲型肝炎是由曱型肝炎病毒(HAV)通过粪-口途径传播引起的一种以肝脏损害为主的传染性疾病。是一种RNA病毒，属微小核糖核酸病毒科，为肠道病毒72型，呈球形直径约27nm,由32个壳微粒组成对称20面体核衣壳，内含线型单股RM。HAV具有4个主要多肽，为构成病毒壳蛋白的主要抗原多肽，诱生中和抗体。HAV存在于患者的血液、粪便及肝胞浆中。感染后血清中抗-HAVIgM抗体很快出现，在2周左右达高峰。然后逐渐下降，在8周之内消失，是HAV近期感染的血清学证据；抗-HAVIgG抗体产生较晚，在急性期后期和恢复期早期出现(IgM开始下降时，IgG逐渐上升)属保护性抗体，在恢复期达高峰，可持久存在，可保护人体不再次感染；对曱肝流行病学调查、健康体检、了解易感人群有重要意义。曱型肝炎病毒(HAV)IgG抗体实验室检测方法主要为免疫分析，常用检测方法为放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)、胶体金免疫层析、斑点免疫渗透分析、血凝抑制试验测抗体。目前使用最广的为酶免疫分析(EIA)。随着标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟，具有先进性且实用性强，易于推广的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。化学发光免疫分析技术，既具有不输于放射免疫分析、时间分辨荧光免疫分析等方法的高度灵敏性，又克服了放射免疫分析的放射性污染、半衰期短及时间分辨荧光免疫分析稳定性差、仪器昂贵等缺点，可广泛应用于生物医学研究和临床医学检验。更能适合中国国情，便于在大、中、小医院推广应用。目前，化学发光免疫分析技术在曱型肝炎病毒IgG抗体免疫分析产品的应用方面仍未见。本发明的试剂盒采用微孔板化学发光免疫分析技术，是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度高；特异性好，减少灰区样品的判定，降低了假阳、阴性结果出现的几率。既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。
发明内容本发明很好地解决了上述问题，即将化学发光技术与曱型肝炎病毒IgG抗体的免疫分析学有效地结合,提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测曱型肝炎病毒IgG抗体的试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。本发明的目的是提供一种甲型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括1)曱型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品；2)曱型肝炎病毒抗原包被的固相载体；3)酶标记结合物；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)浓缩洗涤液。根据本发明的试剂盒，其中，所述包被固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或^兹性颗粒；根据本发明的试剂盒，其中，所述酶标记结合物为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的曱肝病毒抗体(多抗或单抗)；根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。进一步，本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤1)以曱型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性血清制备对照品；2)以曱型肝炎病毒抗原直接包被载体；3)以酶标记曱型肝炎病毒抗体(多抗或单抗)；4)配制发光底物液5)配制浓缩洗涤液6)分装上述曱型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品、酶标记结合物和酶所作用的化学发光底物；以及7)组装为成品。根据本发明的方法，优选，所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤1)包被用0.1MpH值为9.0的磷酸氢二钾緩冲液配制成所需浓度的曱型肝炎病毒抗原包被液，并将包被液负载于固相载体上；2)封闭用含2%BSA，0.015%明胶，pH值为6.8~7.3,浓度为0.01M的磷酸盐緩冲液作为封闭液封闭上述的固相载体。在上述方法中，优选，所述抗原包被的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述结合物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述l,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。具体的上述试剂盒可以包括曱型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品、直接包被曱型肝炎病毒抗原微孔板、酶标记结合物与化学发光底物液、浓缩洗涤液等。其中，所述曱型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品为经HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗体测定均为阴性的多份混合血清，6(TC灭活1小时，适度稀释配制(抗-HAVIgG抗体阳性效价〉l:1000);直接包被的微孔板为48或96孔的微孔板条，标记抗体的酶为偶联辣根过氧化物酶(HRP),化学发光底物液为鲁米诺，浓缩洗涤液为PBST。本发明"甲型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒"可以非常专一地4企测出感染甲型肝炎病毒后人体中的甲型肝炎病毒IgG抗体，可以才艮据曱型肝炎病毒IgG抗体变化情况判断治疗效果及其病情的变化。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。且根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，更能适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的抗体和被测样品的曱型肝炎病毒IgG抗体与载体上的抗原竟争结合，因此本发明采用的"竟争结合法"反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理，又确保了检测的灵敏度。另外，这种模式还便于操作和生产。本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而具有与酶免疫分析同等的特异性，而灵敏度高于现今的酶免疫分析的灵敏度，可为曱型肝炎病毒IgG抗体的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。具体实施例方式实施例1制备本发明的甲型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被緩冲液和保护液，通过抗原不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。一、酶标抗体制备曱型肝炎病毒的抗体(ELIAS效价〉1:4000)用戊二醛法与辣根过氧化物酶偶联，用PBS充分透析，加等体积甘油，-20。C以下保存。二、曱型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品的制备混合6份以上经ELISA试剂盒检测曱型肝炎病毒IgG抗体阳性血清或阴性血清，经HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗体测定均为阴性血清，60。C灭活1小时，过滤除菌、适度稀释、分装，低温冻存。三、酶标抗体浓度选定酶标抗体稀释液为硼砂L4304g、硼酸5.2564g、小牛血清200ml、甘油20ml、Proclin300lml,双蒸水溶解，定溶1000ml。采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度。1:6000四、固相包被板的制备(1)包被称取22.823g的磷酸氢二钾双蒸水解定溶1000ml，调整PH至9.0,加入适量曱型肝炎病毒抗原混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔100inL,4'C过夜。(2)封闭称取O.6944gNaH2P04.2H20、2.1851gNaH2P0412H20、20gBSA、0.15g明胶、8.5gNaCL放入洁净容器中，加双蒸水溶解后加Proclin300lml定溶1000ml，，测定pH值为6.8~7.3。每孔分别加入封闭液15(VL，吸附24。C小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2~8'C保存。五、化学发光底物A液称取1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂、双蒸水溶解，定溶1000ml,测pH8.0~10.0;六、化学发光底物B液称取O.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04线0、8.74gNaH2P04.2H20双蒸水溶解，定溶1000ml，测pH值为7.0-7.6。使用时A液与B液等比例混合。七、20倍浓缩洗涤液称取58gNa2HP0412H20、2gNaH2P042H20、160gNaCl、lmLTween-20、lmLProclin300双蒸水溶解定溶1000ml，测pH7.2-7.4。八、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成甲型肝炎病毒IgG抗体测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。综上，本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了竟争法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实验表明在加入化学发光底物液后5-25分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。实施例2~3制备本发明的甲型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除以碱性磷酸酶标记曱型肝炎病毒抗体、以AMPPD作为化学发光底物、以塑料珠、塑料管作为固相载体、包被液的pH值为4.5、封闭液的pH值为7.5夕卜，其余均以与实施例1相同的方法制备曱型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例4制备本发明的曱型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除以磁性颗粒作为固相载体，采用EDC偶联法制备磁颗粒抗原固相载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备曱型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例5本发明的试剂盒的使用方法以上实施例1制备的曱型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒的具体操作如下1)自4'C冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。2)取出包被板条，插入板架上。3)除空白孔外，反应孔中分别加阴、阳对照品各两孔，每孔50ul，各孔加待检样本50ul，然后加酶标记物50(uL,用微量震荡器充分振荡混匀，37。C温育0.5小时。4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。5)各孔加化学发光底物液A、B各50uL,用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20~25°C)避光反应5分钟。6)必须于加化学发光底物液后的第5~25分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间l秒/孔。7)Cutoff值=0.5^,RLU值>Cutoff值则样本判定为阴性样本;RLU值〈Cutoff值则样本判定为阳性样本。实施例6本发明的试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，见下表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>说明"曱型肝炎病毒IgG抗体(抗-HAVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"的灵敏度、特异性、精密性以及稳定性完全符合检定要求。实施例7本发明的甲型肝炎病毒IgG抗体(抗-HAVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒的临床应用与ELISA试剂盒比较三家临床医院使用实施例1的曱型肝炎病毒IgG抗体(抗-HAVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒和ELISA试剂盒(该试剂盒为获得国家食品药品监督管理局生产批件的检测抗-HAVIgG的ELISA产品)检测临床样本1201份，以对比两种试剂盒检测的符合率。一、临床血清标本的来源各医院临床收集的曱型肝炎病毒及非曱型肝炎病毒患者及正常人的样本。二、使用曱型肝炎病毒IgG抗体(抗-HAVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒与ELISA试剂盒比较1、方法三家医院分别使用本发明实施例1制备的"曱型肝炎病毒IgG抗体(抗-HAVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"(按其说明书操作)和ELISA试剂盒(按其说明书操作)检测临床样本1201份，以对比两种试剂盒检测的符合率。2、结果三家医院使用实施例1的"曱型肝炎病毒IgG抗体(抗-HAVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"和ELISA试剂盒对比检测结果(见表2)表2.三家医院对比两种方法比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>三家医院使用"曱型肝炎病毒IgG抗体(抗-HAVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"与ELISA试剂盒对比检测结果表明本发明试剂盒的各项指标均达到或超过了ELISA法，其特异性100%,明显高于ELISA试剂；敏感性100。/。且与ELISA法高度相符，明显避免了灰区血清样品的结果的判定，减少了所测血清样品假阳性结果的出现。本发明的曱型肝炎病毒IgG抗体(抗_HAVIgG)化学发光免疫分析测定试剂盒，可以应用于临床曱型肝炎疾病诊断。权利要求1、一种甲型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)甲型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品；2)甲型肝炎病毒抗原包被的固相载体；3)酶标记结合物；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)浓缩洗涤液。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为甲型肝炎病毒抗原包被的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记结合物为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的曱肝病毒抗体(多抗或单抗)。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。5、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括A液和B液，其中，所述化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘代苯基硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8.0-10.0;所述化学发光底物B液，包括3.5mM过氧化脲、0.l%Tween20、0.2MpH7.2磷酸盐緩沖液，其pH值为7.0-7.6。6、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)以曱型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性血清制备对照品；2)以曱型肝炎病毒抗原包被固相载体；3)以酶标记曱型肝炎病毒抗体(多抗或单抗)；4)配制发光底物液；5)配制浓缩洗涤液；6)分装上述甲型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品、酶标记结合物、酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤2)采用以下方法1)包被用0.1MpH值为9.0的磷酸氢二钾緩冲液配制成所需浓度的曱型肝炎病毒抗原包被液，并将包被液负载于固相载体上；2)封闭用含2y。BSA,0.015。/。明胶pH值为6.8-7.3，浓度为0.01M的磷酸盐緩冲液作为封闭液封闭上述的固相载体。8、如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述包被曱型肝炎病毒抗原的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的甲肝病毒抗体(多抗或单抗)；所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'_螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种甲型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括1)甲型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品；2)甲型肝炎病毒抗原包被的固相载体；3)酶标记结合物；4)化学发光底物；以及5)浓缩洗涤液。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)以甲型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性血清制备对照品；2)以甲型肝炎病毒抗原包被固相载体；3)以酶标记甲型肝炎病毒抗体(多抗或单抗)；4)配制发光底物液；5)配制浓缩洗涤液；6)分装上述甲型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品、酶标记结合物、化学发光底物及浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。文档编号G01N33/576GK101533026SQ20081010200公开日2009年9月16日申请日期2008年3月14日优先权日2008年3月14日发明者唐宝军,应希堂,杨俊峰,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司