专利名称：：H9型禽流感病毒的快速检测技术的制作方法
技术领域：
：本发明属于医学领域，涉及一种从禽病料中检测病毒的方法，以及这种方法的用途。更确切讲，本发明利用环介导等温扩增技术而研发的检测方法，从死禽病料(包括肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝和心等组织)和活禽病料(包括血液、气管拭子、泄殖腔拭子和粪便)中检测H9型禽流感病毒的方法。
背景技术：
：禽流感病毒(AIV)—直是影响养禽业的最主要病原。虽然通过疫苗的广泛使用，使得禽流感的流行得以控制，但近年来，在我国流行的H9型禽流感在高免鸡群中呈现流非典型症状，常以产蛋量大幅度下降，低死亡率，呼吸道症状及后期的神经症状为特征，临床很难区别禽流感病毒的亚型和其他呼吸道病毒病。因此，对禽流感病毒的检验与诊断方面的研究具有重要意义。流感是呈全球分布的传染病，各个国家都有不同程度的发生。流感对人类的危害众所周知，它的发病率和造成的死亡人数至今仍列为传染病之首。在畜牧兽医方面，它也威胁着多种家畜家禽甚至很多珍稀野生动物的繁衍和生存，从而对经济也造成极大的影响。由于流感病毒的毒株众多，毒力差别很大，所以临床症状也千差万别。尤其H9型禽流感和其他呼吸道疾病很难与其他有类似症状的传染病区分，而且临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短、并发感染情况及感染毒株毒力等不同而有所不同，可能缺乏特征性症状和剖检变化，这给H9型流感的诊断和防治带来极大的困难。因此，单靠临床诊断常常难以定性。实验室诊断是确诊流感的惟一有效途径。特别是随着血清学实验技术和分子生物学技术的飞速发展，H9型流感诊断技术的研究也不断取得新的进展。同时，分子生物学的发展为H9型流感病毒核酸序列分析创造了条件。为了确定H9型流感是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还必须通过病原学检查以确诊病原的存在。H9型流感病毒病原学检查，一般用生物学实验、血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。这些技术方法虽然得到承认、采纳和应用，但是它们有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较底、有的检测周期太长、有的费用太大，而且这些方法大多都需动用活病毒，存在向周围环境散毒的隐患。一般基层单位要开展此项工作，存在不少困难，特别是被检材料污染，检出更为困难。因此进行H9型病毒的分离鉴定，不仅需要严格的无菌取材，还需要低温保存，迅速送检，这往往也是一般工作现场难以办到的。因而建立一种快速诊断该病的方法，己成为H9型流感防治技术研究的重要课题。
发明内容本发明的目的之一是提供一种快速、简便、灵敏和经济的用于检测死禽病料(包括肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝和心等组织)和活禽病料(包括血液、气管拭子、泄殖腔拭子和粪便)中间检测H9型禽流感病毒的方法。本发明是利用环介导等温扩增技术，从禽病料中提取核酸，利用所设计的引物进行扩增反应,检测反应产物是否含有特异性的梯状条带，以确定禽是否感染H9型禽流感病毒的快速检测技术。本发明以禽病料核酸提取物为模板，所使用的四条特异性引物为表1.RT-LAMP检测方法所使用的引物引物名称引物序列F5'-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAA丁GGT-3本发明的实现方法如下通过使用特异性引物，利用RT-LAMP技术扩增H9型禽流感病毒基因组上的特定区域，通过检测特定产物的形成与否，从分子水平对血液或组织样品中的H9型禽流感病毒进行筛查。本发明的H9型禽流感病毒的RT-LAMP检测方法是以被检禽病料中的RNA为模板，根据H9型禽流感病毒基因组序列，设计两对针对H9型禽流感病毒的//J基因的特异性引物进行等温扩增反应。环介导等温扩增技术是由日本科学家Notomi发明的一种的迅速、简便、准确、成本低的核酸识别技术。RT-LAMP技术用于H9型禽流感病毒的检测具有如下优点1.对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使耙基因高效扩增，由于其反应是由多个引物共同启动的，所以比RT-PCR更特异。2.RT-LAMP技术比RT-PCR具有更高的灵敏度，但所需设备却十分简单，仅需一台能提供6(TC左右的水浴锅即可，其试验成本可极大降低。3.RT-LAMP技术一般一个小时内即可完成，比RT-PCR节省时间。本发明中所使用的试剂包括病毒RNA提取试剂和RT-LAMP核酸扩增试剂。诊断方法的步骤如下(1)核酸提取无菌取病禽血液、气管和泄殖腔拭子或粪便以及死禽的器官组织，最好是禽的脑、脾和肺等器官组织，用灭菌生理盐水研磨成乳悬液，并每毫升加入青、链霉素各2000IU,分装入小瓶贴好标签-8(TC保存备用；分别按照试剂盒说明采用Trizol方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒，从血液、咽喉和泄殖腔拭子以及组织中提取包括病毒基因在内的全基因组RNA;同时，无菌提取健康咽喉拭子中的RNA，以用作阴性对照。(2)RT-LAMP反应RT-LAMP反应体系如下终浓度分别为2.0|iM的FIP禾PBIP引物，0.2|xM的F禾BB引物，1.0mMdNTP，8U的BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)，lOxbuffer(containing2mMofMgS04，0.8Mbetaine)and1jal提取的模板cDNA，反应终体积为50pl，反应在0.2mlPCR管中进行。RT-LAMP反应程序为恒温水浴锅63。C条件下反应45min，然后在80°C加热lOmin终止反应。RT-LAMP反应产物检测和结果判定反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，10V/cm，30分钟后溴化乙啶染色后260nm波长观察。。图1为H9型禽流感病毒的RT-LAMP和RT-PCR检测方法的敏感性比较的电泳图。从左至右依次为M，DNA分子量标准DL-2000;1-6泳道，不同拷贝数的模板进行的RT-PCR反应，分别为每管1，10,102,103,104,105拷贝。7-12泳道，RT-LAMP反应中每管中含有不同拷贝数的模板，分别为每管1,10，102,103，104，105拷贝。RT-PCR对H9型禽流感病毒的检出限为100拷贝，而RT-LAMP的检出方法为10拷贝。具体实施例方式本发明实施例分成两部分完成，即实施例一H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的建立；实施例二H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的特异性和敏感性试验，下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例<一>H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的建立1、H9型禽流感的核酸提取无菌采集感染H9型禽流感病毒的禽外周血液，加入适量抗凝剂，对禽组织样品加入少量pH7.4，0.05M的磷酸盐缓冲液(PBS)然后用组织粉碎机匀浆处理。处理后的样品按照宝生物工程(大连)有限公司提供的病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。2、H9型禽流感的RT-LAMP反应参照GenBank登录的H9型禽流感的/^基因的序列，设计两对引物。本发明采用引物的序列如下外侧引物上游F:5'-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3'下游B:5'-GAAAGAATGTGTCCATACCA-3'内侧引物以提取的H9型禽流感的RNA为模板，在50pL反应体系中加入H9型禽流感的RNAlpL，1Ojimol/L外侧上、下游引物各lpl，lpmol/L内侧上、下游引物各liil，2.5mmol/LdNTPs2pL，BstDNA聚合酶8U，10x缓冲液5pL，力口ddH2O至50fiL。RT-LAMP反应程序如下63"C45min，然后80。Cl0min。结果检测RT-LAMP结束后取样进行2.5。/。琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为7V/cm，30分钟，结果出现RT-LAMP反应特异的梯状条带，见图l。实施例<二>H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的特异性和敏感性试验1、H9型禽流感病毒的RT-LAMP的敏感性试验1.1H9型禽流感病毒的定量及不同稀释度模板的确定。按照H9型禽流感基因组的大小和提取的病毒RNA的浓度测算，按照RT-LAMP和RT-PCR每管l,10,102，103,104,105拷贝数进行稀释。1.2H9型禽流感病毒的RT-LAMP方法检出限与RT-PCR方法的对比H9型禽流感的RT-LAMP反应组成及反应程序按照实施例〈1〉进行，H9型禽流感的RT-PCR反应组成如下50|il反应体系中包括1.5mM的dNTP,5jil的10xbuffer,5U的Taqpolymerase(NipponGene)，pM上下访字引4勿F禾nB,1.0模板cDNA.扩增程序为94^C,5min，然后是循环程序94^变性1min,55QC退火30s,720C延伸1min,30个循环。最后72叱延伸5min。RT-PCR反应在MJResearchMinicycler扩土曾仪中进行。1.3结果检测RT-PCR产物和RT-LAMP反应产物在同一块上琼脂糖凝胶中进行电泳。然后进行溴化乙啶染色，BIO-RAD凝胶成像仪中照相并分析，电泳结果见图l,从图中可以看出H9型禽流感的RT-LAMP方法的检测限为每个反应10个拷贝，而RT-PCR反应的检出限为每个反应100拷贝，RT-LAMP反应比RT-PCR反应的敏感性高10倍。2、H9型禽流感的RT-LAMP的特异性试验2.1H5N1、H3N2、NDV、H1N1和IBV病毒核酸的提取和RT-LAMP反应分别用经过RT-PCR鉴定过的田间分离株H5N1、H3N2、NDV、H1N1和IBV中提取的RNA后，反转录为cDNA作为的H9型禽流感病毒RT-LAMP反应的模板，以健康禽组织中提取的RNA作为阴性对照模板。然后按照实施例〈一〉中H9型禽流感病毒的RT-LAMP反应体系和条件进行反应,反应产物用琼脂糖凝胶电泳检2.2特异性反应结果分析NDV、H5N1、H3N2、H1N1和IBV均与H9型禽流感病毒的RT-LAMP方法无交叉性反应。健康猪组织中提取的RNA作模板的RT-LAMP反应结果也为阴性。上述结果表明本试验所建立的H9型禽流感病毒的RT-LAMP检测方法与上述四种在临床症状表现相似的病毒无交叉反应。3、H9型禽流感病毒的RT-LAMP的临床样品检测3.1临床样品的准备分别被RT-PCR和测序或病毒分离诊断为H9型禽流感病毒阳性临床样品由外周血、咽喉拭子、泄殖腔拭子和肺所组成。3.2RT-LAMP检测结果对上述H9型禽流感病毒阳性临床样品用所建立的RT-LAMP方法进行检测，检测结果见表2，从表中可以看出，RT-LAMP方法对临床样品的检出率总体上比RT-PCR的检出率高。其中对咽喉拭子、泄殖腔拭子和全血样品适合生前'诊断。4、结论上述试验证明所建立的H9型禽流感病毒的RT-LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速、所需设备简单、操作容易等特点，适合于实验室和田间对H9型禽流感病毒的快速诊断。表2.RT-LAMP和RT-PCR方法对H9型禽流感病毒临床样品的分析样品类型样品数量样品检出的阳性数RT-PCRRT-LAMP咽喉拭子a513135泄殖腔拭子403335肺1067全血1188合计1127885注其中包括IO个健康鸡的咽喉拭子作为阴性对照。附基因序列表<210>1<211>25<212>DNA<213>外侧引物上游引物F<400>ctactgttgggaggaagagaatggt25<210>2<211〉20<212>DNA<213〉外侧引物下游引物B<400>g肌agsatgtgtcc他cc320<210>3<211>44<212>DNA<213>内侧引物FIP<400>ctgtagaatgaatctgaacattttacacaatctggaatgtgtct44<210>4<211>44<212>DNA<213>内侧引物BIP<400>tcaagacgcccaatecacaattttgaaagaatgtgtccatacca4权利要求1.H9型禽流感病毒的快速检测技术，其特征是无菌采集被检死禽的肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝或心等组织，或者无菌采集被检活禽的血液、气管拭子、泄殖腔拭子或粪便，采用Trizol方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒从所采样品中提取RNA，以提取的RNA为模板，以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行RT-LAMP反应，RT-LAMP反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，以是否出现RT-LAMP反应特异的梯状条带来判断被检禽是否感染H9型禽流感病毒，所用的外侧上、下游引物和内侧上、下游引物为<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>2.根据权利要求1所述的H9型禽流感病毒的快速检测技术，其特征是a提取的被检禽样品用灭菌生理盐水研磨成乳悬液，并按1:5稀释，在每毫升样品中加入青、链霉素各2000IU;bRT-LAMP反应体系如下终浓度分别为2.0jiM的FIP禾nBIP引物，0.2(iM的F禾QB引物，1.0mMdNTP，8U的BstDNA聚合酶，lOxbuffer和1pl提取的模板cDNA,反应终体积为50(il，反应在0.2mlPCR管中进行；cRT-LAMP反应程序为恒温水浴锅63"C条件下反应45min，然后在80。C加热10min终止反应；dRT-LAMP反应产物检测和结果判定反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，10V/cm,30分钟后溴化乙啶染色后再在260nm波长下观察。全文摘要本发明公开一种从禽病料中检测病毒的方法，以及这种方法的用途。本发明的方法是无菌采集被检死禽的肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝或心等组织，或者无菌采集被检活禽的血液、气管拭子、泄殖腔拭子或粪便，采用Trizol方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒从所采样品中提取RNA，以提取的RNA为模板，以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行RT-LAMP反应，RT-LAMP反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，以是否出现RT-LAMP反应特异的梯状条带来判断被检禽是否感染H9型禽流感病毒。文档编号G01N33/50GK101575649SQ20081010845公开日2009年11月11日申请日期2008年6月2日优先权日2008年6月2日发明者刘永生,孙德惠,杰张,陈豪泰,马丽娜申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所