血管扩张刺激磷蛋白在防治消化系统肿瘤药物中的应用的制作方法

专利名称：：血管扩张刺激磷蛋白在防治消化系统肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及一种血管扩张刺激磷蛋白(VASP)在防治消化系统恶性肿瘤药物中的应用，早期预测胃癌、直肠癌、结肠癌的诊断标志物以及治疗肿瘤药物中的蛋白靶标的用途。
背景技术：
：肿瘤转移是恶性肿瘤的生物学特征之一，也是肿瘤临床治疗的难题。据报道，60%以上的肿瘤患者在初诊时已经发现有转移。在临床肿瘤患者中，约有80%—90%的患者，最终死于侵袭和转移，也就是说肿瘤的转移最终成为大多数患者死亡的主要原因。根据卫生部"2008年中国卫生统计提要"公布的"2007年前十位疾病死亡专率及死因构成"，城市居民中，肿瘤死亡专率为176.23/10万，占死亡构成28.53%，成为危害人群健康的"头号杀手"，与2005年相比，城市居民、农村居民恶性肿瘤的死亡率分别上升18.6个百分点、23.l个百分点，这意味着中国每年癌症新发病例220万人，因癌症死亡人数为160万人，每4-5个死亡者中就有一个死于癌症。随着我们中国人口自然增长率和人口老龄化趋势加剧，随着我们城市现代化、城市信息化进程加快，不良生活方式不断增加，特别是农村城市化、环境污染化加剧，恶性肿瘤发病率持续上升的趋势还在加剧。而肿瘤转移也具有特异性癌症的细胞分化程度越低，浸润性越明显，转移发生也越早。VASP(Vasodilator-stimulatedphosphoprotein)基因位于人类染色体19q13.213.3区域，编码一种肌动蛋白相关蛋白。它最初是在血小板中发现的肌动蛋白调节蛋白，Ena/VASP蛋白家族是一组和肌动蛋白调节相关的多功能蛋白。该家族成员包括Mena(ma隨alianEna)、VASP、EVL(Ena/VASP-likeprotion)、Erm(D.rosophilaEnabled)、C.elegansUnc34(Caenorhabditiseleganshomologeofenabled)，以及DdVASP(DictyosteliumdiscoideumVASP)。其中，Mena、VASP、EVL存在于脊椎动物中，Ena、C.elegansUnc234Ena存在于无脊椎动物中；MVASP存在于网柱菌属(Dictyostelium)中。Ena是唯一存在于果蝇中的该家族成员，是Abelson酪氨酸酶(Abl)的作用底物；VASP最初在血小板中发现，是PKG和PKA的作用底物；而Mena和EVL是哺乳动物细胞内的Ena同系物。Ena/VASP蛋白家族的成员具有60%70%的同源性结构，由三个共同的结构区域组成氨基末端是EVH1区域、中心区域是富含脯氨酸的区域PRR、羧基末端是EVH2区域。该家族主要与细胞活动中的肌动蛋白解聚/聚合密切相关，如神经细胞轴突的形成、血小板的聚集、成纤维细胞的移动。根据氨基酸的序列及其功能分析可将VASP分为EVH1、PRR、EVH2三个功能区。EVH1区位于VASP的氨基末端，含112个氨基酸，由两个反向的e-sheet形成一个P-sandwich结构来提供一个可与蛋白质结合沟即V型结合界面。富含脯氨酸区域的蛋白质即在此结合形成PPII型构象体(polyprolineconformation)。可与EVH1区域结合的富含脯氨酸结构的蛋白质有几种，其中主要的包括在Listeria菌表面蛋白ActA中的FP4元件；位于粘附斑(focaladhesion)复合体中的vinculin和zyxin蛋白；T细胞受体信号通路的成分Fyb/SLAP(Fyb—bindingprotein/SLP76—associatedprotein)、神经车由突的弓l导蛋白R0B0/Semaphorin-6A-l及SAX-3/Robo(Ro-undabout)等。PREL1(prolinerichEVH1ligand)也是一种富含脯氨酸结构的蛋白质，在细胞迁移和伸展过程中，它一方面直接与VASP的EVH1区结合，另一方面与Ras结合，从而激活Ras信号通路发挥细胞骨架重排的作用。PRR区该区含有(GPs):,多肽链。由于该区域在Listeria等细菌的基于肌动蛋白的移动中起着重要作用，因此也被称为ABM2-(actin-basedraotility)序列，其序列可用XPPPPP表示，X可为G、A、L、S、P。此区域可与SH3片段、WW片段及另一种重要的肌动蛋白调节蛋白profilin结合。VASP的三个磷酸化位点之一的Serl57(serine157)位点位于此区域内。EVH2区位于VASP的羧基末端，由160190个氨基酸构成,其中含三个高保守性a螺旋，被两个含几十个氨基酸的非保守序列分隔开。EVH2区域从氨基末端到羧基末端可进一步划分为A(225245)、B(259278)、C(343377)三个部分。A区域中有磷酸化位点Ser239(serine239);B区域是VASP与肌动蛋白丝结合的区域，肌动蛋白丝也可使VASP形成二聚体，此区域含磷酸化位点Thr278(threonine278);C区域为形成VASP四聚体所必需。人类VASP的四聚体结构域是一个由45个氨基酸残基组成的右手a螺旋结构，该右手螺旋结构的形成基础是15个氨基酸残基的重复序列。总之，EVH2的功能主要是与肌动蛋白丝结合以及自身形成四聚体，以利于肌动蛋白形成束状结构和调节VASP与粘附斑的结合。VASP整个蛋白序列由380个氨基酸组成，其中含有三个磷酸化位点，两个为丝氨酸位点(Serl57、Ser239)，一个为苏氨酸位点(Thr278)，这三个位点的磷酸化直接受PKG、PKA的调控。最新研究表明，在人胚肾细胞中，由诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)产生的NO可以激活内源性NO敏感性鸟苷酸环化酶，并导致VASP磷酸化在平滑肌细中，VASPSerl57位点的磷酸化可以发挥刺激生长的效应，而其Ser239位点的磷酸化却与NO介导的生长抑制效应有关。VASP对细胞骨架有调节作用。细胞骨架不仅可以维持细胞形态，在细胞与细胞之间、细胞与基质之间的连接中同样发挥作用，VASP直接与肌动蛋白的结合也说明VASP参与细胞骨架的重构。在调控细胞迁移和细胞骨架动力学方面发挥着重要作用。在细胞内，VASP主要聚集在与细胞粘附和细胞移动相关的区域，包括细胞迁移的前沿、局部粘附斑、细胞间粘附连接处及细胞膜上具高动态变化的区域(leadingedge),参与调节细胞粘附和伸展过程中肌动蛋白细胞骨架的重排，在细胞迁移过程中起着重要作用1999年KELILIU等人发现VASP蛋白的缺失可以导致肿瘤细胞的产生，同时他们还提出VASP蛋白过表达和低水平表达均可导致肿瘤细胞的转型。最近，Dertsiz等还发现肺腺癌组织中VASP的表达明显高于正常水平，且随着肿瘤分化程度的降低其表达水平逐渐升高。另外VASP在体内分布广泛，在体内，它主要在肺、胃、大肠、及平滑肌中含量丰富；脑、心脏、肾、小肠中也存在；只有肝脏和骨骼肌中检测不到VASP。在这些组织中VASP的表达可以见于内皮细胞，淋巴细胞，血管平滑肌细胞，成纤维细胞，肾小球系膜细胞，心肌细胞，巨核细胞，浦肯野纤维中。在细胞内，VASP主要存在于应激纤维、粘附斑上应激纤维的末端，细胞间连接及细胞膜上具有高度动态性变化的区域。目前，恶性肿瘤病人在来医院就诊时，大多数恶性肿瘤已经有不同程度的肿瘤的浸润或转移，肿瘤浸润过程中往往缺乏很好的指标对肿瘤侵袭性强弱判断的指标，进而，对肿瘤病人预后的评估常常不准确。因此，我们目前发现研究的VASP与肿瘤的侵袭和迁移有着密切的联系，VASP在侵袭力强的肿瘤细胞中高表达，同时，抑制VASP也会抑制肿瘤细胞的迁移。癌细胞的转移是一个多基因参与通过多步骤完成的复杂过程，涉及肿瘤细胞自身生长优势的获得，细胞间黏附能力的降低，癌细胞对细胞外间质和基底膜的降解与破坏，细胞骨架重构引起细胞运动与迁移，以及肿瘤血管和淋巴管生成，癌细胞逃逸凋亡和免疫杀伤等诸多因素，而且这些因素是互相关联和相互影响的。目前，DertsizL等人在对正常肺组织和肺腺癌组织以及不同分化层次的癌组织VASP表达的差异的研究中已经证实，与正常肺组织相比，VASP在肺腺癌组织中是高表达的，而且VASP的表达和肺癌组织的分化程度、病理分期密切相关。KeyiLiu等人研究也发现，在野生型的NIH3T3细胞中过表达VASP能导致其向肿瘤转化。这些提示VASP在肿瘤的发生发展和侵袭转移中的可能作用。我们通过大量实验研究揭示VASP在多种常见恶性肿瘤细胞迁移中的正性调控作用及其上游调控机制涉及采取siRNA技术特异性沉默人乳腺癌MCF-7等各种恶性肿瘤细胞株中VASP、Racl的表达水平，并进而抑制肿瘤细胞的迁移能力，这表明抑制Racl活化、下调VASP基因可以显著抑制恶性肿瘤的转移；免疫组化检测临床胃癌、肺癌等组织中VASP的表达水平，结合病理分期分级，结果显示，VASP在多种常见恶性肿瘤组织中高表达，并且与高转移有正相关。以上结果表明VASP可以作为早期预测肺癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、黑色素瘤等恶性肿瘤转移能力、侵袭性的诊断标志物，并且成为治疗这些恶性肿瘤的靶向蛋白。
发明内容本发明的目的在于提供一种血管扩张刺激磷蛋白(VASP)在防治消化系统肿瘤药物中的应用，VASP作为早期预测胃癌、直肠癌、结肠癌转移能力、侵袭性的诊断标志物及治疗胃癌、直肠癌、结肠癌药物中的新蛋白耙标。siRNA-VASP能够使人胃癌BGC-823细胞、直肠癌ColO320细胞、结肠癌SW620细胞株细胞迁移速度分别下降44.4%、38.9%、42.1%。本发明涉及一种早期预测胃癌、直肠癌、结肠癌转移能力、侵袭性的诊断标志物及治疗胃癌、直肠癌、结肠癌药物中的新蛋白靶标的应用。涉及采取siRNA技术特异性沉默人乳腺癌MCF-7等多种恶性肿瘤细胞株中VASP、Racl的表达水平，并进而抑制肿瘤细胞的迁移能力，这表明抑制Racl活化、下调VASP基因可以显著抑制恶性肿瘤的转移；免疫组化检测临床胃癌、肺癌等组织中VASP的表达水平，结合病理分期分级，结果显示，VASP在多种恶性肿瘤组织中高表达，并且与高转移有正相关。以上结果表明VASP可以作为早期预测胃癌、直肠癌、结肠癌转移能力、侵袭性的诊断标志物，并且成为治疗胃癌、直肠癌、结肠癌药物中的新蛋白靶标。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施本发明使用上海吉玛制药技术有限公司化学合成的，针对VASP(Genbankaccessionnumber:BC038224)耙基因的三对siRNA片段VASP-siRNAs(VASP-942、VASP-1002、VASP-1024)、阴性对照siRNA和FAM标记的siRNA，通过脂质体Lipofectamine2000，(购买于美国Invitrogen公司，目录号297975)法，分别转染至常规方法培养的人胃癌BGC-823细胞、直肠癌Colo320细胞、结肠癌SW620细胞株(武汉大学细胞典藏中心提供)，荧光显微镜观察细胞转染情况，转染48h后，RT-PCR检测细胞VASPmRNA水平，WesternBlot检测细胞VASP蛋白水平，二维或三位细胞迁移实验鉴定肿瘤细胞迁移或侵袭能力；同时在武汉大学中南医院肿瘤科收集临床胃癌、直肠癌、结肠癌的组织标本，采用免疫组化的方法检测组织中的VASP的表达水平。具体
发明内容如下A.化学合成VASPsiRNA及RaclsiRNA采用化学方法合成(上海吉玛制药技术有限公司)针对VASP(Genbankaccessionnumber:BC038224)耙基因的三对siRNA片段(VASP-942、VASP-1002、VASP-1024)、阴性对照siRNA和FAM标记的siRNA。合成针对调控VASP的Racl(Genbankaccessionnumber:AF498964)耙基因的三对siRNA片段(Racl-439、Racl-99、Racl-328)、阴性对照siRNA。siRNA用来转染培养的肿瘤细胞，观察通过抑制VASP基因能否到达抑制肿瘤细胞转移的作用及其机制。B.细胞培养及转染VASPsiRNA沉默VASP基因常规方法培养的人胃癌BGC-823细胞、直肠癌Colo320细胞、结肠癌SW620细胞株(武汉大学细胞典藏中心提供)，细胞隔天换液，生长至80%90%融合时传代。转染前一天，胰酶消化细胞并计数、细胞铺于六孔板、使其在转染日密度为90%，用无血清的培养基饥饿细胞12h，Lipofectamine2000分别转染VASP-si腿s(942、1002、1024)、阴性对照siRNA，在37。C、5%〔02及饱和湿度培养箱中孵育，6h后换生长培养液直至48h备用。C.RT-PCR检测细胞中VASPmRNA表达水平脂质体转染siRNAs48h后用RT-PCR测定细胞VASPmRNA表达水平，鉴定在m腦A水平VASPsiRNA抑制VASP表达的效果。D.WesternBlot检测VASP蛋白表达水平脂质体转染siRNAs48h后，裂解细胞提取总蛋白，用WesternBlot检测细胞VASP蛋白表达水平，鉴定在蛋白水平VASPsiRNA抑制VASP表达的效果。E.二维迁移实验检测细胞迁移能力二维迁移实验，即损伤修复实验，用于鉴定细胞二维的迁移能力于六孔板中每孔加入细胞，待细胞长成单层后，用1ml枪头的尖端在孔中央作一垂直的划痕，沿划痕边缘等距离间隔作5-6个标记作为数据测定点，加入含或不含siRNA的无血清培养液，继续培养。分别于培养0h，48h拍照。测量每个时间点所对应的划痕两侧的细胞间距(um)，即以0h划痕边沿距离减去48h划痕边沿距离作为细胞迁移距离，计算单位时间细胞迁移速度，反应细胞二维迁移能力。F.三维迁移/侵袭实验检测细胞迁移/侵袭能力三维侵袭实验，即Transwell法，用于鉴定细胞三维的迁移/侵袭能力采用细胞侵袭小室Transwell(装有聚碳酸酯微孔膜孔径8um，美国Costar公司)，预先侵袭小室上表面没有包被任何材料的用于细胞三维迁移能力检测，而预先用10yg/mLI型胶原(购自美国SIGMA公司)包被Transwell小室底部以模拟细胞外基质用于细胞三维侵袭能力检测。将细胞接种于预处理好的侵袭小室上室内，下室内加入含高血清的培养液诱导，规定时间后计数迁移至下表面的细胞总数，反应细胞三维/侵袭能力。G.免疫组化SP法检测肿瘤组织中VASP的表达临床病理标本按病理检查标准确定分期、分级，VASP表达水平检查采用免疫组化SP法，按照镜下细胞内染色颗粒的有无和细胞染色的深浅对VASP阳性程度进行分类，统计分析恶性肿瘤组织中VASP表达水平与病理分期分级的相关性。本发明与现有恶性肿瘤防治技术相比，具有以下优点和效果1.VASP作为细胞骨架相关蛋白在调节细胞骨架重排、细胞迁移过程中发挥重要作用。2.本发明表明在消化系统恶性肿瘤转移调控过程中VASP蛋白发挥重要的作用。3.本发明表明VASP可以作为一种早期预测胃癌、直肠癌、结肠癌转移能力、侵袭性的诊断标志物来预测肿瘤转移。4.本发明表明VASP可以作为治疗胃癌、直肠癌、结肠癌的新靶标蛋白。图1.胃癌BCG-823细胞VASP-siRNART-PCR结果VASP-942siRNA组的VASPmRNA表达水平较阴性对照组下调，两者差异有显著性(*代0.05)，表明VASPsiRNA显著抑制细胞中VASP表达。图2.VASP-siRNA抑制胃癌BCG-823细胞二维迁移能力VASP-942siRNA组胃癌BCG-823细胞二维迁移速度较对照组低，两者差异有显著性(*代0.05)，表明VASPsiRNA显著抑制胃癌BCG-823细胞二维迁移能力。图3.胃癌组织中VASP的表达(A)高分化腺癌中VASP的表达(B)中分化腺癌中VASP的表达(C)低分化的腺癌中VASP的表达(X200)图4.VASP-siRNA抑制直肠癌Colo320细胞二维迁移能力VASP-942siRNA组细胞二维迁移速度较对照组低，两者差异有显著性(承代O.05)。图5.直肠癌组织中VASP的强表达图6.VASP-siRNA抑制结肠癌SW620细胞二维迁移能力VASP-942siRNA组细胞二维迁移速度较对照组低，两者差异有显著性(*代0.05)。图7.结肠癌组织中VASP的强表达具体实施例方式下面以VASP在胃癌、直肠癌、结肠癌中的作用，说明其用途实施例1:siRNA沉默VASP抑制人胃癌BGC-823细胞迁移及胃癌组织中VASP表达与病理分期关系分析材料与方法一、试剂和仪器1.采用试剂(1)RPMI-1640培养基Sigma(2)小牛血清(calfserum,CS)Hyclone(3)胰蛋白酶Amresco(4)L-谷氨酰胺(L-Glutandne)Gibco(5)EDTA-Na2'2H20Amresco(6)十二烷基磺酸钠(SDS)Sigraa.(7)N，N'-亚甲双丙烯酰胺Fluka(8)丙烯酰胺Amresco(9)TEMEDSigma(10)甘氨酸Amresco(11)过硫酸铵(AP)Sigma(12)二硫苏糖醇(DTT)Amresco(13)硝酸纤维素膜(NC膜)A.P(14)牛血清白蛋白(BSA)Amresco(15)TritonX-100Amresco(16)Tween-20Amresco(17)单克隆鼠抗人VASP抗体(IE273)AlexisBiochemicals(18)辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG北京中杉金桥生物技术有限公司(19)鼠抗人Racl抗体23A8UpstateBiotechnology公司(20)BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术研究所(21)DAB显色试剂盒Piecre(22)RevertAidTMFirstStrandc腿SynthesisKitFermentas(23)琼脂糖Spanish(24)Tris-HClSigma(25)EDTASigma(26)PMSFAmresco(27)EGTASigma(28)P-merc邻toethanolAmresco(29)aprotininSigma(30)le叩印tinSigma(31)RNAi片段上海吉玛制药技术有限公司其余试剂均为国产分析纯。2.试剂的配制2.1细胞培养主要试剂的配制(1)RPMI-1640培养基RPMI-1640干粉一袋溶解于1000ml双蒸水中，振荡使之完全溶解，经孔径为0.22的滤膜过滤除菌后即为基础培养基，分装后冻存于-2(TC。临用前每85ml基础培养基加入10ml小牛血清，0.2mol/L的L-谷氨酰胺1ml，双抗1ml(含青霉素1万单位，链霉素1万单位)，用10%的NaHCO"周pH为7.0-7.2，4。C保存。(2)PBS缓冲液-.NaCl8.0g，KC10.2g，Na2HP0412H202.89g，NaH2P040.2g，加双蒸水至1000ml，高压灭菌后室温(20-25°C，以下相同)保存。(3)细胞传代消化液(0.25%胰蛋白酶-EDTA):胰蛋白酶2.5g，EDTANa22H,00.2g，加PBS缓冲液至1000ml，用NaOH将消化液的pH调至7.2左右，经孔径为0.22um的滤膜过滤除菌，分装后冻存于-20"C备用。(4)青、链霉素双抗溶液青霉素100万单位，链霉素100万单位，溶于100ml灭菌双蒸水中，分装后-2(TC保存。使用时每100ml培养液中加入lml双抗溶液。(5)谷氨酰胺谷氨酰胺粉末2.922g，溶于100tnl双蒸水中，0.22urn的微孔滤膜过滤除菌，分装，-2(TC保存。使用时每100ml培养液中加入lml谷氨酰胺溶液。2.2免疫印迹试剂的配制(1)细胞裂解液20咖ol/LTris-Cl(pH7.5)，150咖ol/LNaCl,1%TritonX-亂(2)1.5mol/LTris-Cl(pH8.8):9.0825gTris碱，40ml双蒸水，调pH至8.8，定容至50ml。(3)1mol/LTris-Cl(pH6.8):6.055gTris碱，40ml双蒸水，调pH至6.8，定容至50ml。(4)30%凝胶储备液29g丙烯酰胺，60ml双蒸水，水浴30-40。C，直至丙烯酰胺溶解。1gN，N，-亚甲双丙烯酰胺，10ral双蒸水，溶解后与丙烯酰胺液混合，定容至IOOml，4'C避光保存。(5)10%SDS:10gSDS，90ml双蒸水，加热助溶，定容至100ml，4'C保存备用。(6)5XSDS-PAGE上样缓冲液250mmol/LTris-Cl(pH6.8)，10%SDS，5%溴酚蓝，50%甘油，DTT临用前加入，终浓度为100mmol/L。(7)10%AP:0.3gAP，3ml双蒸水，4。C保存，隔周配制。(8)15ml10%分离胶:双蒸水5.9ml，30%凝胶储备液5.0ml,1.5mol/LTris-Cl(pH8.8)3.8ml，10%SDS0.15ml，10%AP0.15ml，TEMED0.008ml。(9)4ml5%浓縮胶:双蒸水2.7ml,30%凝胶储备液0.67ml,1.0mol/LTris-Cl(pH8.8)0.5ml，10%SDS0.04ral，10%AP0.04ml,TEMED0.006ml。(10)5X电泳缓冲液7.55gTris碱，47g甘氨酸，25ml10%SDS，450ml双蒸水，调pH至8.3，定容至500ml。(11)转移缓冲液5.81gTris碱，2.93g甘氨酸，0.37gSDS，溶于500ml双蒸水，溶解后加200ml甲醇和250ml双蒸水，调pH至8.3,定容至1000ml。(12)漂洗液(pH7.6):Tris碱2.42g，NaCl8.0g，Tween-201ml,双蒸水溶解后，调pH7.6，定容至1000ml。(13)封闭液2.5gBSA溶于50ml漂洗液(pH7.6)。2.3RT-PCR试剂的配制(1)5XTBE缓冲液:Tris碱10.8g，硼酸5.5g，0.5mol/LE歸4ml,加水至200ml，室温保存。使用时，稀释为0.5XTBE缓冲液。(2)2。/。DNA凝胶制备(20ml):琼脂糖0.4g，5XTBE缓冲液2ml，双蒸水18ml，加热溶解，待温度降至6(TC时加入1iilEB00mg/ml)，混匀后加入预先准备的制胶板中，放置lh后即可进行副A电泳，电泳缓冲液为0.5XTBE。3.采用仪器(1)超净工作台YJ-1450型苏州净化设备公司(2)二氧化碳培养箱SHEL-LAB,USA(3)DMBRI倒置相差荧光显微镜LEICA，Germany(4)电子天平JY型上海精密科学仪器有限公司(5)-90。C冰箱382E型日本三洋(6)-20。C冰箱中国海尔(7)台式低温高速离心机TGL-16G型上海医用分析仪器厂(8)台式离心机TDL-40B型上海安亭科学仪器厂(9)普通恒温摇床HYA型中国科学院武汉科学仪器厂(10)荧光酶标仪TECAN(11)稳压稳流电泳仪DYY-6B型北京市六一仪器厂(12)电泳槽DYPC-24D型北京市六一仪器厂(13)转印槽DYCZ-40D型北京市六一仪器厂(14)水浴锅HH-WZ1-420型北京长源实验设备厂(15)凝胶成像分析系统WD-9413A型北京市六一仪器厂(16)超纯水系统北京市六一仪器厂(17)微型旋涡混合仪WH-2型上海沪西分析仪器厂(18)微量移液器200-1000"1、20-200u1、1-20u1、0.5-10ul大龙(19)制冰机GRANT(20)紫外投射反射检测分析仪上海康华生化仪器制作厂二、实验方法1.化学合成VASPsiRNA和RaclsiRNA采用化学方法合成针对VASP(Genbankaccessionnumber:BC038224)靶基因的三对siRNA片段(VASP-942、VASP-1002、VASP-1024)、阴性对照siRNA和FAM标记的siRNA。合成针对Racl(Genbankaccessionnumber:AF498964)靶基因的三对siRNA片段(Racl-439、Racl-99、Racl-328)、阴性对照siRNA。序列如下VASP942-960bpVASP1002-1020bpVASP1024-1042bpNegativecontrolRacl439-457bpRacl99-117bpRacl328-346bpNegativecontrol2.细胞培养人乳腺癌MCF-7细胞株、MDA-MB-231细胞株(由武汉大学细胞典藏中心提供)用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，于37°C、5%0)2及饱和湿度培养箱中进行培养。细胞隔天换液，生长至80%90%融合时传代。经台盼蓝染色细胞存活率〉95%。3.细胞分组和处理转染前一天，胰酶消化细胞并计数、细胞铺于六孔板、使其在转染日密度为90%，待细胞生长至融合时，用无血清的RPMI-1640培养基饥饿细胞12h，实验分为四组阴性对照siRNA组、VASP-942siRNA组，VASP-1002siRNA组，VASP-1024siRNA组；阴性对照si認A组、Racl-439siRNA组，Racl-99siRNA组，Racl-328siRNA组。对于每组细胞，使用250ul无血清培养液稀释100pmolsiRNA，使15sense5，-CAACCUUGCCAAGGAUGAATT-3'antisense5，-UUCAUCCUUGGCAAGGUUGTG-3，sense5，-CGCCCAGCUCCAGUGAUUATT-3'antisense5，-UAAUCACUGGAGCUGGGCGTG-3'sense5，-GGACCUACAGAGGGUGAAATT-3'antisense5，-UUUCACCCUCUGUAGGUCCGA-3'sense5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，antisense5，-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'sense:5'-GGAGATTGGTGCTGTAAAA-3'antisense:5'-UUUUACAGCACCAAUCUCG-3,sense:5'-CUACUGUCUUUGACAAUUA-3';antisense:5'誦UAAUUGUCAAAGACAGUAG-3'sense:5'-CAUCCUAGUGGGAACUAAA隱3、antisense:5'-UUUAGUUCCCACUAGGAUG3'sense:5'陽UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'用250yl无血清培养液稀释5u1Lipofectamine2000，后者室温孵育5min。混合稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine2000,室温孵育20min。直接将复合物加入每孔中，摇动培养板、轻轻混匀。在37'C、5%0)2及饱和湿度培养箱中孵育，6h后换生长培养液直至48h。4.WesternBlot鉴定VASP蛋白表达的改变4.1细胞总蛋白的提取(1)取各组细胞，用预冷的PBS洗涤后吸净残余的PBS液体。(2)加入细胞裂解液，置冰上裂解15min。(3)裂解结束后，用干净的细胞刮迅速将细胞刮至培养瓶的一侧，然后用移液器将细胞碎片和裂解液移至1.5mlEp管中。(4)4。C，14000rpm离心10min。(5)将离心后的上清液转移到另一Ep管中，-90。C保存。4.2细胞总蛋白的定量(1)配制工作液根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。(2)稀释标准品取10W标准品用适量PBS稀释，使其终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0，1,2，4，8，12，16，20W加到96孔板的蛋白标准品孔中，再分别加适量PBS补足到20W。(3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20W。(4)每孔加入200WBCA工作液，37。C放置30min。(5)冷却到室温，用酶标仪测定0D570nm，根据标准曲线计算出各样本蛋白浓度。4.3SDS-PAGE电泳(1)准备玻璃板、梳子，依次用无水乙醇、自来水、双蒸水洗涤，晾干或用滤纸擦干。(2)将玻璃板固定于垂直电泳槽。(3)配制10%的分离胶，小心地将分离胶缓慢灌入两块玻璃板之间，留出浓縮胶所需空间，然后加适量双蒸水于凝胶表面以隔绝空气，室温下静置30min左右，待分离胶凝固。(4)分离胶凝固后，倒掉凝胶表面的双蒸水，然后将配制好的5%的浓縮胶灌入胶板之间，插入合适的梳子，置室温30min左右，待浓縮胶凝固。(5)在浓縮胶聚合的同时，在上样的蛋白样品中加入适量5XSDS上样缓冲液至终浓度为1X，同时加入适量DTT，其终浓度为100mmol/L,混匀后，于沸水中煮5min使蛋白变性。(6)浓縮胶凝固后，拔去梳子，加入1X电泳缓冲液，将处理好的样品及marker小心上样到凝胶上样孔内。(7)将电泳装置与电源相接，选择稳压模式，出孔电压为40V，当指示剂进入浓縮胶后将电压提高至80V，进入分离胶后将电压提高至150V，电泳34h后关闭电源。(8)电泳结束后，取出玻璃板，小心将其分开，用手指沿边缘小心剥出凝胶。4.4蛋白质的电转移(1)在托盘中倒入转移缓冲液，高度以刚刚浸没转印夹和海绵为宜。浸泡转印夹和海绵。(2)戴手套剪2块Whatman3顧滤纸、1块NC膜(靠胶面的滤纸《胶的大小，靠膜面的滤纸《膜的大小)，浸泡于托盘转移缓冲液中5min。(3)在海绵上从负极到正极依次铺上滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，逐层赶出气泡，盖上海绵，扣好转印夹，放入转印槽。将转印槽置于冰上，接上转印仪，选择稳流模式，电流大小为膜的长(cm)X宽(cm)X2，转印2h后关闭电源。4.5免疫显色(1)转移结束后，取出转印夹，用平头小镊子夹出NC膜，蛋白面朝上，剪去左上角作为标记，浸泡于含有适量新配置的封闭液的平皿中，盖上锡纸，室温轻摇封闭2h。(2)加入用封闭液稀释的I抗(VASP1:800稀释，Racl1:300稀释)，4'C孵育，静置过夜。(3)用漂洗液洗膜3次，每次10min。(4)漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的II抗(1:2000稀释)，置于摇床上室温振荡孵育1h。(5)用漂洗液洗膜3次，每次IOmin。(6)取1ml双蒸水，加入DAB试剂盒中A试剂1滴，混匀后再分别加入B试剂1滴和C试剂1滴，充分混匀后倒在NC膜上，避光显色23min，自来水终止反应，凝胶成像系统拍照。5.RT-PCR鉴定VASPmRNA表达的改变5.1细胞总RNA的提取于鉴定(1)取各处理组细胞，弃培养液，用DEPC水配置并4。C预冷的PBS清洗1次，倒置。(2)每孔细胞加入Trizol试剂1ml，直接裂解细胞，5min后，将充分混匀的细胞裂解液移至EP管中。(3)每mlTrizol加入0.2ml氯仿，vortex混匀15s，室温放至2-3min。(4)12000g4。C离心15min，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每mlTrizol约可吸取0.5-0.55ml。(5)按每ml最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10min。(6)12000g4。C离心10min，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清。(7)每ml最初的Trizol加入1ml75%乙醇，vortex混匀。(8)7500g4。C离心5min，弃上清，再用离心机甩一下，小心吸尽液体。(9)待認A略干后，加入20ulDEPC水溶解，-7(TC保存。5.2逆转录试剂盒样品RNA6n1，下游引物1u1,加入DEPC处理双蒸水至总体积为12Ul，混匀并上下颠倒3-5s，于70。C，孵育5min。立即冰上冷却，加入5Xbuffer4pl，RNA酶抑制剂1y1，10mMdNTPmix2y1，混匀后稍离心，37°C,5min孵育，加入逆转录酶1P1，42°C60min孵育，70°C，10min终止反应，冰上冷却，-20。C保存。5.3PCRIOXPCR缓冲液5ulMg2+3u1dNTPmix(10mM)1y110mM上下游引物各11TaqDNA聚合酶1.5li1逆转录cDNA5u1DEPC处理水32.5"I反应体系50ul轻柔混合反应体系，短暂离心。反应条件VASP:94°C，40s;60。C，30s;72°C，30s;30个循环Racl:94°C，40s;54°C，30s;72°C，30s;30个循环。5.4凝胶的制备(1)将琼脂糖加入50mm/LTris-Cl(pH8.0)中配制成1%琼脂糖凝胶溶液20"1，微波加热至琼脂糖完全溶解。(2)待冷却至60'C左右时，加入EB替代品1"1，将混匀的琼脂糖凝胶溶液倒入插有梳子的水平电泳槽中，约20min后溶液凝固。(3)待溶液凝固后将梳子从凝胶中快速拔出。5.5上样、电泳(1)上样之前加lWLoadingbuffer于各反应体系中。(2)向电泳槽中倒入50隱/LTris-Cl(pH8.0)，缓冲液要将凝胶上样孔完全覆盖。(3)快速将各反应样本上样到凝胶上样孔中。(4)将电泳装置与电源相通，选择稳压模式，145V，电泳40min。5.6拍照在紫外波长下用凝胶成像系统拍照。6.二维迁移速度测定(损伤修复实验)(1)于六孔板中每孔加细胞约4X105，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养。(2)待细胞长成单层后，用含无血清的RPMI-1640培养液使细胞饥饿12(3)用1ml枪头的尖端在孔中央作一垂直的划痕，用PBS将刮掉的细胞冲洗干净。沿划痕边缘等距离间隔作56个标记作为数据测定点，测量时取平均值。(4)加入含或不含siRNA的无血清RPMI-1640培养液，继续培养。(5)分别于培养Oh，48h拍照。(6)测量每个时间点所对应的划痕两侧的细胞间距(！im)，即以Oh划痕边沿距离减去48h划痕边沿距离作为细胞迁移距离。迁移速度=迁移距离/迁移时间7.三维迁移/侵袭能力测定(Transwell)于6孔培养板中放入细胞侵袭小室Transwell(装有聚碳酸酯微孔膜孔径8pm，美国Costar公司)，用10吗/mLI型胶原(购自美国SIGMA公司)包被Tmnswell小室底部(没有包被步骤的为迁移实验，有包被则为侵袭实验)，无菌风干。将细胞悬液加入上室，培养于37'C、5%(302培养箱至设定时间点，取出细胞侵袭小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定于4%多聚甲醛中10min，结晶紫染色。随机计数8个视野，以确定迁移、侵袭细胞数量，对比分析评价。侵袭能力，移动能力表示方法为各组侵入下层的细胞数。8.免疫组化检测胃癌组织中VASP表达及其与病理分期关系分析收集武汉大学中南医院肿瘤科临床胃癌手术切除标本，胃癌组织标本均行常规HE染色供病理诊断。VASP免疫组化检测采用SP法，其操作步骤按试剂盒说明进行。所用VASP单克隆抗体为鼠抗人VASP抗体(IE273)购于AlexisBiochemicals公司。VASP及PCNA染色判断标准按镜下细胞内染色颗粒的有无和细胞染色的深浅分为①阴性(-):阳性细胞数<25%;染色淡；阳性(+++):阳性细胞数25%50%;染色为棕色；③强阳性(+++++++):阳性细胞数>50%;染色为深棕色。免疫组化结果见图9，胃癌组织中VASP表达量与临床病理学分级的关系分析如表l:表1.胃癌组织中VASP表达量与临床病理学分级的关系分析<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例1结果见附图1-3，表l.实施例2:siRNA沉默VASP抑制人直肠癌Colo320细胞迁移及直肠癌组织中VASP表达1.siRNA沉默VASP抑制人直肠癌Colo320细胞迁移能力培养人直肠癌Colo320细胞，细胞迁移能力的检测操作步骤同具体实施例1歩骤6，迁移速度测定(损伤修复实验)结果见图4。2.免疫组化SP法检测直肠癌组织中VASP表达收集武汉大学中南医院肿瘤科临床直肠癌手术切除标本，应用免疫组化SP法检测癌组织中的VASP表达水平，结果见图5:VASP在直肠癌细胞胞膜完全着色，着色深，或异质性着色，极性丧失。操作步骤同具体实施例1歩骤8。实施例3:siRNA沉默VASP抑制人结肠癌SW620细胞迁移及结肠癌组织中VASP表达1.siRNA沉默VASP抑制人结肠癌S怖20细胞迁移能力培养人结肠癌SW620细胞，细胞迁移能力的检测操作步骤同具体实施例1步骤6，迁移速度测定(损伤修复实验)结果见图6。2.免疫组化SP法检测结肠癌中的VASP表达收集武汉大学中南医院肿瘤科临床结肠癌手术切除标本，应用免疫组化SP法检测癌组织中的VASP表达水平，结果见图7，操作步骤同具体实施例1步骤8。权利要求1、一种血管扩张刺激磷蛋白在制备治疗或预防胃癌药物中的蛋白靶标的应用。2、一种血管扩张刺激磷蛋白在制备治疗或预防直肠癌药物中的蛋白耙标的应用。3、一种血管扩张刺激磷蛋白在制备治疗或预防结肠癌药物中的蛋白靶标的应用。全文摘要本发明公开了一种VASP在防治消化系统恶性肿瘤药物中的应用，VASP作为早期预测胃癌、直肠癌、结肠癌转移能力、侵袭性的诊断标志物及治疗胃癌、直肠癌、结肠癌药物中的新蛋白靶标的应用。涉及采取siRNA技术特异性沉默消化系统恶性肿瘤细胞株中VASP、Rac1的表达水平，并进而抑制肿瘤细胞的迁移能力，这表明抑制Rac1活化、下调VASP基因可以显著抑制消化系统恶性肿瘤的转移；免疫组化检测临床胃癌组织中VASP的表达水平，结合病理分期、分级，结果显示，VASP在肿瘤组织中高表达，并且与高转移有正相关。以上结果表明VASP可以作为早期预测胃癌、直肠癌、结肠癌转移能力、侵袭性的诊断标志物，并且成为治疗胃癌、直肠癌、结肠癌药物中的新蛋白靶标。文档编号G01N33/68GK101361965SQ200810197010公开日2009年2月11日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者璇周,张京伟,彭小春,王永平,可苏,董慧敏,蕾魏申请人:武汉大学