专利名称：一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种试剂盒，特别是涉及一种人血管生长素酶联免疫分析试 剂盒。
背景技术：
血管生长素(以下简称ANG)是存在于正常血浆及实体肿瘤组织中的一种分 子量为14. lkDa、 p19. 5的蛋白质，基因定位于染色体14qll。 ANG是一种能有效 促进新生血管形成的刺激因子，具有很强的促血管生成作用。ANG被认为是促进 血管生成的最主要的细胞因子之一。ANG最初是于1985年从人结肠癌细胞株 HT-29的培养液中分离而得，随后在人血浆和牛乳中检测到它的存在。ANG属于 核糖核酸酶超家族， 一级结构与人的胰核糖核酸酶有35%相同，有微弱的核糖核 酸酶活性。ANG是通过与血管内皮细胞表面的受体结合，激活胞内的第二信使而 发挥一系列生物学作用(如介导细胞粘连、诱导细胞入侵、组织新生管状结构的 形成等)，从而达到促进新生血管形成的作用。
ANG促进新生血管形成的研究意义主要体现在三个方面(1)改善局部微循 环，在血循环较差的半月板纤维软骨的修复以及梗塞或创伤、烧伤等损伤组织中 重建侧枝循环等过程中发挥着重要的作用。(2)实体肿瘤的生长依赖于肿瘤内部 血管的快速生长，因此可以通过抑制ANG的生物学活性，阻止新生血管的形成从 而达到治疗肿瘤的目的。(3)已有研究表明，胰腺癌、乳腺癌等患者的外周血血 清中，ANG的水平明显升高。血清ANG的水平与这些肿瘤的发展及转移呈显著正 相关。另外，有研究表明，胃癌、肺癌、大肠癌及乳腺癌患者血清中ANG水平较 正常对照明显增高，因此，可以检测血清及肿瘤组织中ANG的水平来预测肿瘤的 发生与发展情况。
目前，对于肿瘤的早期筛查仅有甲胎蛋白、癌胚抗原、乳头瘤病毒等为数很 少且很局限的几个检测指标，很难满足市场和临床的需要。本专利拟建立快速检 测人血清ANG的肿瘤筛査试剂盒，确定正常人群体的ANG水平参考值及肿瘤发生 和转移的预警值，优化试剂盒的各项参数，为ANG相关肿瘤的筛查提供一种新的、 费用低、覆盖面广的快速检测手段。
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种快速检测人血清ANG的肿瘤筛査人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，以确定正常人群体的ANG水平参考值及肿瘤发生和转 移的预警值，优化试剂盒的各项参数，为ANG相关肿瘤的筛査提供一种新的、费 用低、覆盖面广的快速检测手段。
本实用新型的目的通过以下技术方案予以实现。
一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，它包括酶联板和标准 品，所述的酶联板的微孔上包被了纯化的鼠抗人ANG单克隆抗体；所述标准品为 抗重组人血管生长素标准品(以下简称rhANG)。
进一步的它还包括样品稀释液、检测溶液A、检测溶液B、检测稀释液、洗 涤原液、底物溶液和终止液。
所述的样品稀释液包含磷酸盐缓冲液；
所述检测溶液A是兔抗人ANG多克隆抗体；
所述检测溶液B是辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔IgG抗体；
所述洗涤原液包含磷酸盐缓冲液；
所述底物溶液是四甲基联苯胺溶液(简称TMB);
所述终止液是硫酸溶液。
所述酶联板是96孔酶联板。
本实用新型的一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，具有以下优点(1)
本基于ANG检测的肿瘤筛查试剂盒，填补了目前此项研究的空白，可作为肿瘤转 移、复发及预后的一种新的检测方法，为肿瘤的早期防治提供了一种有效的手段；
(2)国内最先进行重组人ANG的原核表达，建立了 ANG的高效表达系统和简便 高效的纯化技术；(3)在国内独家制备了高效价的抗人ANG单克隆抗体和多克隆 抗体等，解决了试剂盒研发的知识产权问题，并最大限度的降低了试剂盒的制作 成本；(4)系统地对各类肿瘤患者外周血血清及肿瘤组织进行了 ANG检测，建立 了 ANG相关肿瘤的全新的监测方法，建立了试剂盒初步的操作条件和技术参数；
(5)本试剂盒检出限可以达到ng级，4XM呆存稳定性在1年以上，特异性好无 交叉反应，重复性偏差小于5%。
图l是本实用新型的示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例和实验例对本实用新型的试剂盒作进一步的说
明。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒它包括96 孔酶联板l、标准品2、样品稀释液3、检测溶液A4、检测溶液B5、检测稀释 液6、洗涤原液7、底物溶液8和终止液9，所述的酶联板1的微孔上包被了纯 化的鼠抗人ANG单克隆抗体；所述标准品2为抗重组人血管生长素标准品2;所 述的样品稀释液3包含磷酸盐缓冲液；所述检测溶液A 4是兔抗人ANG多克隆 抗体；所述检测溶液B 5是辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔IgG抗体；所述 洗涤原液7包含磷酸盐缓冲液；所述底物溶液8是四甲基联苯胺溶液；所述终止 液9是硫酸溶液。
实验例1
实验原理本试剂盒应用双抗夹心酶标免疫分析法测定标本中ANG水平。 用纯化的鼠抗人ANG单克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中 依次加入ANG抗原、兔抗人ANG多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG，经过 彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下变成蓝色，并在酸的 作用下变成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ANG呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板l: 一块(96孔，可拆卸)。
2. 标准品2 (冻干品)2瓶，每瓶临用前以样品稀释液3稀释至lml，充 分溶解，其浓度为lmg/L，做系列倍比稀释，分别稀释为1000ug/L， 500Pg/L， 250ug/L， 125ug/L， 62.5ug/L， 31.2lig/L, 15.6ug/L， 0 yg/L，原液直接作为标准浓度1000wg/L，样品稀释液3直接作为标准 浓度0ug/L。
3. 样品稀释液3: l瓶，20ml/瓶。
4. 检测溶液A4: l瓶，100ul/瓶。临用前以检测稀释液6按1: IOOO稀 释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需总量配置。
5. 检测溶液B5: l瓶，100ul/瓶。临用前以检测稀释液6按1: 1000稀 释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需总量配置。
6. 检测稀释液6: 2瓶，10ml/瓶。
7. 洗漆原液7: l瓶，30ml/瓶。使用时用蒸馏水稀释25倍。
8. 底物溶液8: 1瓶，10ml/瓶。
9. 终止液9: l瓶，10ml/瓶。 标本的采集及保存-
采集外周血lml，干燥管(非抗凝)中室温放置2小时后于1000g离心10 分钟，取上清即可检测，或将血清标本-2(TC保存以后检测，但应避免反复冻融。 操作步骤
各种试剂在使用前平衡至室温。
1. 加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加
标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上 盖，37。C反应120分钟。
2. 弃去液体，甩干，不用洗漆。
3. 每孔加检测溶液A 4工作液100ul， 37°C， 60分钟。洗板3次，350ul/ 每孔，甩干。
4. 每孔加检测溶液B5工作液100ul， 37°C， 60分钟，洗板5次，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液890ul， 37°C避光显色30分钟(以肉眼可见标准 品2的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显的时间为准)。
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联仪 在450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。
特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的人ANG，且与其他相关蛋白无 交叉反应。
计算以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)， 在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线査出相应的浓 度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方 程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样 品的实际浓度。
检测范围15.6 ug/L 1000ug/L
本实用新型并不限于以上实施方式，只要是本说明书及权利要求书中提及的 方案均是可以实施的。
权利要求1.一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，它包括酶联板和标准品，所述的酶联板的微孔上包被了纯化的鼠抗人ANG单克隆抗体；所述标准品为抗重组人血管生长素标准品。
2. 根据权利要求1所述的一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，其特征在于， 它还包括样品稀释液、检测溶液A、检测溶液B、检测稀释液、洗涤原液、 底物溶液和终止液。
3. 根据权利要求2所述的一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，其特征在于， 其中的检测溶液A是兔抗人ANG多克隆抗体；检测溶液B是辣根过氧化物 酶HRP标记的羊抗兔IgG抗体。
4. 根据权利要求1所述的一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，其特征在于， 所述酶联板是96孔酶联板。
专利摘要本实用新型公开了一种人血管生长素酶联免疫分析试剂盒，它包括酶联板、标准品、样品稀释液、检测溶液A、检测溶液B、检测稀释液、洗涤原液、底物溶液和终止液，所述的酶联板的微孔上包被了纯化的鼠抗人ANG单克隆抗体；所述标准品为抗重组人血管生长素标准品；所述检测溶液A是兔抗人ANG多克隆抗体；所述检测溶液B是辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔IgG抗体。本基于ANG检测的肿瘤筛查试剂盒，填补了目前此项研究的空白，可作为肿瘤转移、复发及预后的一种新的检测方法，为肿瘤的早期防治提供了一种有效的手段；本试剂盒检出限可以达到ng级，4℃保存稳定性在1年以上，特异性好无交叉反应，重复性偏差小于5％。
文档编号G01N33/577GK201199243SQ200820047508
公开日2009年2月25日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者张宏斌 申请人:张宏斌