专利名称：针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用，所述抗体广泛用于包括 小细胞肺癌在内的各种疾病的早期发现和治疗监测、复发监测等。
背景技术：
在日本，死因的第1位是恶性肿瘤，其中肺癌死亡率呈逐年上升趋势，在男性中超 过胃癌成为死因的第1位，在女性中也占第3位。肺癌在病理组织学上主要分为以下4种 组织类型，即发生于肺门部的肺鳞状上皮细胞癌(squamous-cell carcinoma)和小细胞 肺癌(small-cell lungcarcinoma :SCLC)、发生于肺野部的肺腺癌(adenocarcinoma)和大 细胞月市癌(Large-cell lung carcinoma)。尤其是小细胞肺癌，由于增殖快速，早期即发生远处转移，因此初诊时发现大多已 是全身性转移的进行性癌。关于该类型癌的治愈率，对于病变局限于一侧肺野的小细胞肺 癌的局限型(Limited disease :LD)患者，其治愈率为约20%；对于已经转移至两肺和其他 脏器的扩散型(extensive disease :ED)患者，可以说事实上难以治愈。此外，由于小细胞肺癌对抗癌剂的敏感性高，因此，化学疗法是首选的治疗方法， 相反，对于非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma :non_SCLC)，由于化学疗法的 疗效差，因此外科疗法是首选的治疗方法。因此，小细胞肺癌是肺癌中特别需要早期发现、早期治疗的癌症，所以，将小细胞 肺癌和非小细胞肺癌进行鉴别诊断，对于确定治疗方案极其重要。发现肺癌的方法之一是痰液检查。然而，痰液检查主要适于肺鳞状上皮细胞癌的 检查，对小细胞肺癌而言，存在阳性率低的问题。此外，X射线摄影法也是广泛使用的发现 肺癌的方法，但是对于发生于肺门部的肺鳞状上皮细胞癌和小细胞肺癌，肺门部由于受到 心脏的影响，存在癌组织的阴影非常难以拍到的问题。此外，关于小细胞肺癌，对肺野呈现 异常阴影的患者，即使使用痰液细胞学诊断、胸部X射线普通摄影、CT扫描、支气管内窥镜 等，也难以早期发现该类肺癌。此外，用于诊断癌症的一些检查方法，例如放射线照射、活组织检查或支气管内窥 镜等，会对患者造成痛苦，且需要昂贵的仪器和熟练的技术等。因此，正在进行肿瘤标志物的研究，以便通过更简便的血液检查，在能够治愈的时 期可高效诊断出癌症。目前，在癌症的发现、诊断、病情监测指标、复发诊断等中使用了 30 种以上的肿瘤标志物。由于肺癌组织类型多样，所以还没有报道过对所有类型肺癌的发现或诊断均有效 的肿瘤标志物。因此，目前根据肺癌的组织类型来选择和使用有效的标志物。例如，对于肺腺癌，主要选择使用癌胚抗原(carcinoembryonicantigen :CEA)或 唾液酸化Lex-i抗原；对于肺鳞状上皮细胞癌，主要选择使用鳞状上皮细胞癌相关抗原 (squamous-cell carcinoma relatedantigen :SCC)；对于小细胞肺癌,主要选择使用神经 元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase :NSE)等。
然而，NSE存在如下缺点(1)针对可治愈的早期癌的阳性率低；( 治疗引起测定 值出现暂时性上升；C3)采血时的溶血引起测定值上升；(4)小细胞肺癌患者与正常健康者 的测定差值小等。因此，对于小细胞肺癌来说，NSE未必是有效的肿瘤标志物。胃泌素释放肽(Gastrin-Releasing Peptide :GRP)是 McDonald 等在 1978 年 从猪的胃组织中分离出的一种具有促进胃泌素分泌作用的、由27个氨基酸组成的脑肠肽 (brain-gut peptide) 0已证实人类也存在GRP，并于1984年克隆出编码人类GRP的基因。日本国立癌中心的山口等，在认为是来自神经内分泌细胞的小细胞肺癌的生物学 特性的研究过程中，测定了包括促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone =ACTH) 和降钙素等15种以上的脑肠激素，发现在培养的小细胞肺癌株中，GRP以最高频率且高浓 度地得到积极分泌(非专利文献1)。并且，建立了组合有血中GRP浓缩法的放射免疫测 定法(RIA)，发现小细胞肺癌患者与健康人相比，呈现出高的血中GRP浓度。然而，由于GRP 在血中会快速降解，因此血中浓度低，此外，由于上述测定需要复杂的浓缩操作，因此临床 应用困难。根据此后的研究可知，在各种细胞中，通过选择性RNA剪接(alternative RNA splicing)，产生3种GRP前体(ProGRP)(非专利文献2)。这3种ProGRP，其第1-98位氨 基酸序列是相同的，而第99位以后，通过选择性RNA剪接，变成互不相同的氨基酸序列。该 相同的第1-98位氨基酸序列在序列编号1中示出。下文只要没有特别说明，本发明中的 ftx)GRP、其部分序列、降解物等氨基酸残基的编号均用序列编号1的氨基酸序列的编号表
7J\ ο3种ftx)GRP的第1-27位氨基酸序列，与具有促胃泌素分泌活性的成熟GRP的该部 分氨基酸序列相同。这3种前体均通过激素前体切断酶，降解为由第1-27位氨基酸序列构 成的成熟型GRP;以及由第31位以后的氨基酸序列构成的、不具有促胃泌素分泌活性的、作 为ftOGRP降解物的C末端片段(ftOGRP-Cfrag)。Holst等(非专利文献3)报道通过对由ftx)GRP的第42_53位氨基酸序列构成 的肽(以下称为ft~oGRPG2-53))使用抗血清进行放射免疫测定(RIA)，发现小细胞肺癌患 者血浆中的ftx)GRP或ftOGRP-Cfrag水平高。然而，该方法需要沉淀萃取操作，灵敏度也不 足。三宅等着眼于ftx)GRP与GRP相比在血中的稳定性高、以及作为3种ftx)GRP共同 部分的第31-98位氨基酸序列对其他蛋白质的氨基酸序列没有显示出相同性，使用由该氨 基酸序列构成的重组肽(以下称为ft~oGRP(31-98))作为抗原得到的高效价抗血清，建立了 无需沉淀萃取操作的高灵敏度RIA法(非专利文献1)。通过该方法，使ftx)GRP成为与GRP 同样优异的肿瘤标志物。该方法在无需萃取操作方面是有利的，但是测定需要4天时间，且灵敏度不足，为 IOpM(77. 3pg抗原/mL)，因此不能测定健康人血清中的ftx)GRP值，尚未得到临床应用。此外，上述Holst等和三宅等的RIA法是抑制法，因此，虽然只要ftx)GRP片段的一 部分具有抗原性就能进行测定，但是其灵敏度比夹心(sandwich)法低，因此难以实现需要 高灵敏度的ftx)GRP测定法的临床应用。即为了在临床上进行ftx)GRP检测，必须提高检测 灵敏度，尤其需要能在夹心法中使用的抗体。山口、青柳等以ftx)GRP的小细胞肺癌用肿瘤标志物的临床应用为目的，开发了以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay =ELISA)为原理、使用夹心法的简 便且高灵敏度的ftx)GRP测定试剂(专利文献1)。该方法在约2小时内获得结果，并且具有 高灵敏度Opg/mL)，因此目前在临床上得到广泛应用，发现与NSE相比，该方法对于小细胞 肺癌的灵敏度高并具有特异性。此外，发现使用该测定法，除了小细胞肺癌以外，在神经内分泌肿瘤(甲状腺髓样 癌等)、显示神经内分泌肿瘤特征的癌(小细胞食道癌、小细胞胰腺癌、小细胞前列腺癌等) 中，血清ftx)GRP值也上升，认为今后也可以应用于这些肿瘤的早期发现和治疗监测等中。然而，虽然ftx)GRP比GRP在血中的稳定性高，但是与其他通常的肿瘤标志物相比， 却发现测定值分散。因此，以ftx)GRP为检测对象的方法，存在下述制约，即测定用样品必须 在采血后迅速冷冻保存直至测定时为止(非专利文献4)。青柳开发了使用识别作为ftx)GRP(31-98)内部区域的ftx)GRP的第40_75位的氨 基酸残基或ftx)GRP的第40-79位的氨基酸残基的2种以上的抗体的夹心测定法(专利文 献3)。该方法在测定于4°C保存的样品时获得比较稳定的结果，并且显示与专利文献2记 载的方法大致相同的检测灵敏度。然而，该方法如专利文献3的实施例4所示的那样，需要 100 μ L样品量，该量比通常的免疫测定法多。专利文献1 专利第3210994号公报专利文献2 特开平6-98794号专利文献3 国际专利公开W02006/117994号小册子非专利文献1 =Cancer Research, 1994 年，第 M 卷，第 2136-2140 页非专利文献2 =Spindel 等，Mol. Endocrinol.，1987 年，第 1 卷，第 224-232 页非专利文献3 =Holst 等，J. Clin. Oncol.，1989 年，第 7 卷，第 1831-1838 页非专利文献4:临床检查(日文原文臨床検查)，1995年，第39卷，第981-986页
发明内容
在专利文献3记载的方法中，如果在维持检测灵敏度的同时，能够进一步减少所 需要的样品量，则在临床上能够削减测定所需的成本，减轻患者的负担。此外，由样品保存 引起的测定灵敏度下降更小的测定方法，能够更加简便地进行样品的处理。本发明提供一 种新的ftx)GRP的测定方法，该测定方法中，由样品保存引起的检测灵敏度下降小，能够用 更少量的样品量进行测定。本发明发现，使用针对ftx)GRP的特定区域的抗体的免疫测定法能够解决上述课 题，从而完成了以下各发明。(1) 一种测定胃泌素释放肽前体和/或其降解物的方法，所述方法使用2种以上的 不同抗体，所述的抗体识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈 示的抗原表位。(2)如⑴所述的方法，其中，该方法为夹心免疫测定法。(3) 一种识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的 抗原表位的单克隆抗体。(4)如(3)所述的单克隆抗体，其中，该抗体由按照保藏编号FERMP-21308保藏的 杂交瘤(hybridoma)GCY9 产生。
(5)如(3)所述的单克隆抗体，其中，该抗体由按照保藏编号FERMP-21309保藏的 杂交瘤GCY17产生。(6)按照保藏编号FERM P-21308保藏的杂交瘤GCY9。(7)按照保藏编号FERM P-21309保藏的杂交瘤GCY17。(8)如⑴所述的方法，其中，所述的2种以上的不同抗体的至少一种是⑷或 (5)中任一项所述的抗体。(9) 一种用于测定胃泌素释放肽前体或其降解物的试剂盒，所述试剂盒含有 (3) (5)中任一项所述的抗体。(10)如(9)所述的试剂盒，所述试剂盒是用于癌诊断或用于治疗效果监测的试剂
品.ο本发明的方法以在样品中也能稳定保存的ftx)GRP的降解物为测定对象，除了能 获得与现有的测定方法相同的检测灵敏度，还具有采取后的样品的处理方法不易受到影 响、能够获得再现性高的测定值等效果。据此，为了诊断小细胞肺癌等疾病，在采血样品的 临床现场，采血后的样品的处理变得更加容易，ProGRP的测定值没有因样品的处理而分散， 能够获得更稳定的结果，测定值的可靠性提高。此外，根据临床表现，在要求追加试验或需 要再检查等时，可以使用冷藏保存的样品而不是冷冻保存的样品进行测定，从而可削减测 定所需的成本。而且，本发明的方法在维持高检测灵敏度的同时，能够减少测定样品量及缩 短测定时间，在临床上能够削减成本，减轻患者的负担。
图1是表示单克隆抗体PGCY9对由用多中心肽合成法(multipinp印tide)合成的 8个连续氨基酸序列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨 基酸残基的编号，纵轴表示吸光度。图2是表示单克隆抗体PGCY17对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序 列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号， 纵轴表示吸光度。图3是表示单克隆抗体PGCYM对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序 列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号， 纵轴表示吸光度。图4是表示单克隆抗体PGCY12对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序 列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号， 纵轴表示吸光度。图5是表示单克隆抗体PGCY5对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序列 构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号，纵 轴表示吸光度。图6是表示ftx)GRP (31-98)与各种单克隆抗体所识别的抗原表位的位置关系的模 式图。图7是表示使用与氨基酸编号第47-68位的部分肽结合的抗体PGCY9与PGCY17 的测定法的标准曲线图。横轴表示ftx)GRP的浓度，纵轴表示吸光度。
图8是表示针对在微量板(microplate)的固相上通过抗小鼠IgG(Fc)抗体结合 的ftx)GRP的各单克隆抗体与生物素化ftx)GRP的反应性的图。横轴表示各单克隆抗体，纵 轴表示吸光度。
具体实施例方式本发明是一种使用能够识别ftx)GRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表 位的2种以上的不同抗体，通过夹心免疫测定法检测ftx)GRP或ftx)GRP的降解物的方法，所 述ftx)GRP的降解物具有ftx)GRP的第47-68位的氨基酸残基。该免疫测定法具有如下特征 即使在将采取的样品进行冷藏保存的情况下，其检测灵敏度也不下降。由此推测这意味着 具有ftx)GRP的第47-68位的氨基酸残基的ftx)GRP的降解物对样品中含有的蛋白酶或其他 原因引起的样品保存中的进一步降解反应比较稳定。本发明的方法中可以使用的抗体为能够识别ftx)GRP的第47-68位的氨基酸序列 所呈示的抗原表位的抗体，据此能够与具有ftx)GRP的第47-68位的氨基酸残基的ftx)GRP 的降解物结合。这种抗体优选为单克隆抗体。本发明的方法中可以使用的抗体，优选为能够识别ftx)GRP的第47-68位的氨 基酸序列中的N末端部分所呈示的抗原表位和C末端部分所呈示的抗原表位的2种以 上的不同单克隆抗体。特别优选使用单克隆抗体PGCY9和PGCY17，所述的单克隆抗体分 别由杂交瘤GCY9和杂交瘤GCY17产生，所述杂交瘤GCY9和杂交瘤GCY17分别以保藏编 号FERM P-21308和FERM P-21309保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保 藏中心。这2种杂交瘤细胞是以利用大肠杆菌生产的重组ftx)GRP的第31-98位的氨基 酸序列构成的多肽(以下表示为ftx)GRP(31-98))作为抗原，由免疫小鼠的抗体产生细胞 (antibody-producingcell)按通常的方法制备的杂交瘤细胞。这2种杂交瘤细胞是通过使 用ftx)GRP (31-98)内部的肽的筛选而进行挑选的、产生识别ftx)GRP的第47-68位的氨基酸 所呈示的抗原表位的抗体的细胞。这样，本发明中可以使用的抗体可以通过下述方法得到以ft~oGRP(31-98)作为 抗原，由将小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、鸡、山羊、绵羊、牛等实验动物免疫后回收的抗体产生细 胞，按通常的方法制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，使用ftx)GRP的第47-68位的氨基酸 残基构成的多肽(以下表示为ftx)GRPG7-68))可以筛选产生所需抗体的杂交瘤细胞。此 外，也可以将ftx)GRPG7-68)作为抗原使用。另外，上述多肽也可以与甲状腺球蛋白或匙孔 血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体结合后使用。以小鼠为例来说明对动物进行免疫的方法。将ft~oGRP(31-98)等多肽与弗氏完全 佐剂、TiterMax Gold(CytRx公司)等佐剂以1 1混合，使用互相流通的接头连接的两个 注射器，使其反复通过接头，或通过超声波处理等方法制备乳剂。在皮下、皮内、肌肉内、腹 腔内的任一部位或多个部位注入制备的含有抗原的乳剂。第一次免疫结束后，间隔1 4 周，以同样的方式进行第二次免疫。然后，同样继续免疫，直至抗体对血中的ftx)GRP的抗体 效价上升。抗体效价的测定可以按照以下方式进行。以IP g/mL的浓度在PBS中溶解 ProGRP (31-98)，以每孔50 μ L的容量添加到96孔微量滴定板(micro-titer plate)的 各孔中，于4°C下吸附过夜。用含0.05%吐温20的PBS(PBS-T)将各孔洗涤后，用于测
7定。测定前，也可以用含BSA的PBS等进行封闭。从眼窝静脉丛、尾静脉或尾动脉等 处采血，用PBS-T稀释到30倍后进行离心。将所得上清液用PBS-T进行系列稀释，涂覆 ProGRP (31-98)，在微量滴定板的各孔中分别添加50 μ L。在室温下反应30分钟后，用PBS-T 洗涤，在各孔中分别添加50 μ L辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG溶液，该溶液使 用PBS-T等进行过适当稀释。再在室温下反应30分钟后，添加过氧化氢、邻苯二胺底物溶 液进行反应30分钟，添加50 μ L 2Ν H2SO4,使反应停止，测定各孔的吸光度。在免疫过的小鼠中，证实对所给予的抗原的抗体效价充分上升后，取出脾脏，分离 脾脏细胞。使用另外培养的小鼠骨髓瘤(例如SP2/0-Agl4等)和聚乙二醇等进行融合。将 融合成功的细胞用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基进行选择培养。7 14天左 右，每隔几天半量交换培养基并继续培养后，测定培养上清液的抗体效价。通过有限稀释法 克隆阳性孔的细胞，得到产生目标抗体的杂交瘤。通过分析上述方法所得抗体的抗原表位，可以获得识别ftx)GRP的第47-68位的氨 基酸序列所呈示的抗原表位的抗体。抗原表位分析可以通过研究抗体对使用多中心肽合成 法合成的ftx)GRP (31-98)的连续8-12个氨基酸序列构成的多肽或ftx)GRP 07-68)的反应 来进行。例如，可以通过在微量滴定板上涂覆用重组体表达的ftx)GRP (47-68)、或用Fmoc法 或Boc法进行化学合成的ftx)GRP (47-68)，使用上述免疫测定法研究抗体对各肽的反应性 来确定。根据使用多中心肽合成法合成的ftx)GRP(31-98)的连续8_12个氨基酸序列构成 的多肽的抗原表位的分析结果，证实本发明特别优选的抗体之一 PGCY9为识别ftx)GRP的第 47-68位的氨基酸所呈示的抗原表位中第55-66位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克 隆抗体。此外，证实本发明特别优选的另一抗体PGCY17为至少识别第45-57位的氨基酸序 列所呈示的抗原表位的单克隆抗体。本发明中使用的抗体还可以在载体或微量板(microplate)上固相化、或用生物 素等适当的标记试剂进行标记。可以根据各实验方法的说明书中记载的方法进行固相化或 标记的各种操作，本发明中使用的抗体并不特别需要特殊的操作。本发明的方法为使用上述抗体的夹心免疫测定法，具体地说，是夹心ELISA法。夹 心ELISA法的基本操作可以根据《超高灵敏度免疫测定法》(日文原文超高感度免疫测定 法)(石川栄治，1993年，学会出版力 >々一)或其它各种实验方法的说明书中记载的方法 进行，本发明的实施中并不特别需要特殊的操作，可以按下述工序进行。S卩，ProGRP和/或其降解物可以通过包括如下工序的测定法检测(1)使识别 ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的第一抗体与样品中的ProGRP和/ 或其降解物反应的工序；(2)由该抗体捕捉的ftx)GRP和/或其降解物与不同于⑴的抗体 的、识别ftx)GRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的第二抗体反应的工序；以 及C3)检测由( 产生的免疫复合物的工序。本发明方法的操作法的例子可以表示如下。将以1 10μ g/mL的浓度溶解于缓 冲液(例如，0. IM碳酸缓冲液(pH 9.6))中的第一抗体的溶液等量添加到微量滴定板的各 孔中，于4°C下培养过夜。用PBS等洗涤用缓冲液将各孔洗涤后，将没有结合第一抗体的各 孔的内壁用含有酪蛋白酸钠等适当的蛋白质的缓冲溶液培养数小时后进行封闭。除去封闭 液后，在各孔中添加含有吐温20等表面活性剂的反应液和样品。样品的添加量根据其测定法的灵敏度进行适当变更。在37°C左右的温度下反应约1小时后，用含有表面活性剂的缓 冲液(例如，含吐温20的PBS-T)将各孔洗涤，在各孔中添加使用适当的标记试剂标记的第 二抗体，反应几十分钟后，将各孔洗涤，使用与标记试剂相适应的方法检测第二抗体。另外， 上述操作法只不过是个例子，各步骤的具体操作，例如缓冲液、标记试剂、添加量等可以适 当调节。本发明使用单克隆抗体PGCY9和PGCY17这2种单克隆抗体的方法的检测灵敏度 为2. 5pg/mL，样品量可以使用25μ L左右。该检测灵敏度几乎能够测定所有健康人血中的 ftx)GRP，这在临床上有助于削减检查成本，减轻患者的负担。本发明除了上述方法以外，还提供用于测定样品中的ftx)GRP或其降解物的试剂 盒，尤其是通过测定ftx)GRP和/或其降解物进行小细胞肺癌诊断或化学疗法监测的诊断药 试剂盒。该试剂盒含有至少2种识别上述ftx)GRP的第47-68位的氨基酸所呈示的抗原表 位的抗体，其他还可以任意地含有反应缓冲液、二抗稀释液、ProGRP标准物质、说明书及其 他组成物。作为试剂盒中含有的抗体的优选例，为识别ftx)GRP的第47-68位的氨基酸所呈 示的抗原表位的2种以上的不同抗体，代表例为单克隆抗体PGCY9和单克隆抗体PGCY17。与ftx)GRP和/或其降解物结合的抗体，虽然优选使用只选择识别ftx)GRP的第 47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的抗体，但是，在可以得到再现性高的测定值的范 围内，测定体系内也可以含有这些抗体以外的抗体。实施例以下列举实施例对本发明作进一步的说明。实施例1根据专利第3210994号的实施例1记载的方法制备重组体，提纯由大肠杆菌表 达的序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽。专利第3210994号的实施例1中，该重 组体记载为GRP (31-98)，正确的是GRP前体(ftx)GRP)的(31-98)部分，因此本文记载为 ProGRP(31-98)。将ft~oGRP(31-98)猪甲状腺球蛋白(TG)以重量比为1 3结合的抗原蛋白质 (表示为ftx)GRP-TG)使用含0. 15M NaCl的IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. 0)稀释，与等量的 TiterMax 混合，制成 ftx)GRP-TG 悬浮液。将配制的 1^061^(31-98)浓度达 0. 05mg/0. ImL 的该悬浮液按约20天的间隔、在4 6周龄的BALB/c系小鼠的腹腔内给药4 6次。再 于约4周后，作为加强免疫，用配制的ftx)GRP (31-98)的浓度达0. lmg/0. ImL的生理盐水给 药2天。最终加强免疫后第3天，从该免疫动物中无菌性摘除脾脏，用手术剪剪成切片，再 用筛孔将脾脏弄成一个个细胞，用RPMI-1640培养基洗涤3次后，用含8-氮鸟嘌呤的相同 培养基培养数天。将完全去除回复突变体的对数增殖期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0-Agl4 用RPMI-1640培养基洗涤后，将该细胞2. 4 X IO7个和上述脾脏细胞2. 0 X IO8个加入离心管 中混合。将混合的2种细胞以200Xg离心分离5分钟，除去上清液后，采用HVJ Envelope Cell Fusion Kit (GenomONE-CF，石原产业株式会社)进行细胞融合。将融合的细胞用含有 次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷(以下将3种化合物合起来表示为HAT)、10%胎牛血清(FCS)及 小鼠白介素-6 (R&D Systems)的RPMI-1640培养基稀释，添加到96孔培养板上培养1 2 周。在培养约1 2周后，进行使用ft~oGRP(31-98)作为抗原的ELISA法，得到杂交瘤，该 杂交瘤产生对ftx)GRP(31-98)具有反应特异性的本发明的单克隆抗体。
关于得到的杂交瘤，通过常用的有限稀释法，使用ft~oGRP(31-98)进行目标抗体 的产生株的检索和单一克隆化，最终得到5株杂交瘤细胞，分别命名为GCY9、GCY17、GCY12、 GCYM及GCY5。GCY9和GCY17于2007年6月22日在位于日本国茨城县筑波市东1 丁目1 番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏(GCY9的保藏 编号FERM P-21308 ；GCY17 的保藏编号FERM P-21309)。另外，GCY9 和 GCY17 于 2008 年 8 月5日分别获得国际保藏(GCY9的国际保藏编号FERM BP-1099UGCY17的国际保藏编号 FERMBP-10992)。实施例2(1)将通过实施例1记载的方法得到的杂交瘤在含有小鼠白介素-6的无血清培养 基(Hybridoma-SFM，hvitrogen公司)中培养，将产生的单克隆抗体用结合了蛋白质A的 琼脂糖凝胶柱(Amersham)提纯回收。将由各杂交瘤GCY9、GCY17、GCY12、GCYM及GCY5产 生的单克隆抗体分别命名为PGCY9、PGCYl7、PGCYl2、PGCYM及PGCY5。对于PGCY9、PGCY17、 PGCY12、PGCYM及PGCY5的亚型(subtype)，根据使用兔抗小鼠Ig各亚型试剂盒(Zymed公 司)的实验,表明 PGCY9、PGCY12、PGCY24 和 PGCY5 为 IgGl，PGCY17 为 IgG2a。(2)基于ftx)GRP(31-98)的氨基酸序列，用多中心肽合成法合成每个氨基酸进行 错位制备的连续8个氨基酸构成的共61种多肽。再在各肽的N末端结合生物素。将各生 物素化多肽溶解于二甲基甲酰胺中，并用PBS稀释成1 μ g/mL的浓度。在抗生物素蛋白 (avidin)固相化的96孔微量滴定板的各孔中分别添加100 μ L稀释过的各生物素化多肽溶 液，于4°C培养过夜。用含0. 05%吐温20的PBS缓冲液(PBS-T)将各孔洗涤后，在各孔中分 别添加100 μ L将各单克隆抗体稀释成1 μ g/mL的溶液。在室温下反应30分钟后，用PBS-T 将各孔洗涤5次，在各孔中分别添加100 μ L辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体 溶液。再在室温下反应30分钟后，用PBS-T将各孔洗涤5次，在各孔中分别添加IOOyL底 物溶液(含ang/mL邻苯二胺、0. 9μ L/mL 30%过氧化氢溶液的0. IM柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，在室温下反应30分钟后，分别添加IOOyL 2N硫酸，立即测定492nm处的吸光度。单 克隆抗体PGCY9、PGCY17、PGCYM、PGCY12及PGCY5对ftx)GRP (31-98)内部各肽的反应如图 1 图5所示。如图1所示，证实单克隆抗体PGCY9与ftx)GRP (57_64)的结合非常弱。此外，如 图2和图3所示，证实单克隆抗体PGCY17及PGCYM与ftx)GRP(31-98)的氨基酸序列中的 8个连续氨基酸构成的多肽不结合。由此推测，PGCY17及PGCYM不能识别8个连续氨基 酸序列，而能识别比8个长的氨基酸序列构成的多肽所呈示的抗原表位。另一方面，如图 4所示，证实单克隆抗体PGCY12与ft~oGRP(34-41)结合强，与其前后的ftx)GRP (33-40)及 ProGRP(35-42)结合弱。因此推测，PGCY12能识别ftx)GRP的第34-41位的氨基酸序列所呈 示的抗原表位。此外，证实单克隆抗体PGCY5与ft~oGRP(69-76)和ftx)GRP (70-77)结合强， 与ft~oGRP(71-78)结合，与ft~oGRP(68-75)结合非常弱。因此推测，单克隆抗体PGCT5能识 别ftx)GRP的第69-76位的氨基酸序列和第70-77位的氨基酸序列所呈示的共同的抗原表 位。(3)通过Fmoc法合成表1所示的ftx)GRP (31-98)的部分氨基酸序列构成的多肽， 进行提纯。在溶解6M尿素的PBS中，以20 μ g/mL的浓度溶解BSA，在96孔微量滴定板 (NUNC、Maxisorp)的各孔中分别添加100 μ L，在室温下培养3小时。用PBS将各孔分别洗涤5次，在各孔中分别添加100 μ L用PBS将N-(3- 二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐 酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)分别以lmg/mL溶解后的溶液，在室温下培养2小 时，将在孔中固定的BSA的羧基活化。用PBS将各孔洗涤3次，将各多肽用0. IM磷酸缓冲 液(pH 6. 0)稀释成5 μ g/mL的浓度，在96孔微量滴定板的各孔中分别添加100 μ L，于4°C 培养过夜。据此，各多肽通过氨基与固定化的BSA结合。用PBS将各孔洗涤2次后，在各孔中分别添加350 μ L含1 % BSA、2%蔗糖的PBS，在 室温下培养3小时，然后吸除。在各孔中分别添加100 μ L稀释成1 μ g/mL浓度的各单克隆 抗体，在室温下反应60分钟后，用含0.05%吐温20的PBS(PBS-T)洗涤5次后，在各孔中分 别添加IOOyL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体溶液，在室温下反应20分钟。 用PBS-T洗涤5次后，在各孔中分别添加100 μ L底物溶液(含ang/mL邻苯二胺、0. 9 μ L/ mL30%过氧化氢溶液的0. IM柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5. 0)，在室温下反应20分钟后，在各孔 中分别添加IOOyL 2N硫酸，使反应停止，立即测定492nm处的吸光度。除了本发明的各单 克隆抗体外，同时还研究了专利文献3中所示的、识别ftx)GRP的40-60位的氨基酸序列构 成的多肽、且与8个连续氨基酸序列构成的多肽不发生反应的单克隆抗体GRP-3D6-2的抗 原表位。其结果如表1所示。表 权利要求
1.一种测定胃泌素释放肽前体和/或其降解物的方法，所述方法使用2种以上的不同 抗体，所述的抗体识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的 抗原表位。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法为夹心免疫测定法。
3.一种识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表 位的单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的单克隆抗体，其中，所述抗体由按照保藏编号FERMP-21308保 藏的杂交瘤GCY9产生。
5.如权利要求2所述的单克隆抗体，其中，所述抗体由按照保藏编号FERMP-21309保 藏的杂交瘤GCY17产生。
6.按照保藏编号FERMP-21308保藏的杂交瘤GCY9。
7.按照保藏编号FERMP-21309保藏的杂交瘤GCY17。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述的2种以上的不同抗体的至少一种是权利 要求4或5中任一项所述的抗体。
9.一种含有权利要求3 5中任一项所述的抗体、并用于测定胃泌素释放肽前体或其 降解物的试剂盒。
10.如权利要求9所述的试剂盒，所述试剂盒是用于癌诊断或用于治疗效果监测的试剂盒。
全文摘要
本发明提供一种不存在测定值分散和样品处理等操作上的制约等问题的、高灵敏度的新的ProGRP测定方法。特别是，本发明提供一种使用2种以上的不同抗体测定胃泌素释放肽前体和/或其降解物的方法，所述的抗体识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。本发明的方法与现有的测定方法相比，能够以冷藏保存的样品为对象，在短时间内从更少量的样品试样中以更高的检测灵敏度检测ProGRP或其降解物。
文档编号G01N33/574GK102084249SQ20088011172
公开日2011年6月1日 申请日期2008年9月29日 优先权日2007年10月26日
发明者井泽雪路, 青柳克己 申请人:株式会社先端生命科学研究所