用于制备粪便样品的方法、制备粪便样品用溶液和采集粪便用试剂盒的制作方法

专利名称：用于制备粪便样品的方法、制备粪便样品用溶液和采集粪便用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备粪便样品以便从粪便样品中有效回收核酸的方法、制备粪便 样品用溶液、采集粪便用试剂盒、上述制备方法制备的粪便样品、用于从上述粪便样品中回 收核酸的方法和利用由上述核酸回收方法回收的核酸来分析核酸的方法。
背景技术：
如在欧洲和美国发现的情况一样，在日本结肠癌病人的数量正在逐年迅速增加， 并且结肠癌占由癌症引起的死亡的主要部分。认为正如西方世界的人一样，这是由于日本 人的摄食习惯变为食用较多的肉引起的。更具体地说，每年有约6万人发展为结肠癌，并且 在由不同器官中的癌症引起的死亡数方面，结肠癌也继胃癌和肺癌之后达到第三位，并预 计这个数目在将来更进一步增加。另一方面，不同于其它癌症，如果在发病初期治疗，几乎 100%的结肠癌可以得到治愈。因此，选择结肠癌作为早期癌症筛选的对像极其有意义，并 且已深入进行了用于发展结肠癌早期检测的检查方法的研究。关于结肠癌早期检测的检查方法，已进行例如灌肠检查和结肠镜(colonoscopic) 检查等。灌肠检查涉及以下检查方法将钡注入大肠并附着于其粘膜表面，并将其用X射线 照射以进行表面凹凸的放射显影，由此观察大肠表面。另一方面，结肠镜检查是涉及用内窥 镜直接观察大肠内部的检查方法。特别地，结肠镜检查是高度灵敏和特异的，并且在息肉或 早期癌症的切除中也是有益的。然而，这些检查方法成本高并给受试者带来沉重负担，并且它们还与并发症的风 险有关。例如，灌肠检查与X射线暴露和肠梗阻的风险有关。另外，结肠镜检查由于内窥镜 直接插入大肠内部因此是一种侵入性方法，并且内窥镜操作也要求熟练的技巧，因此能提 供此类检查的设备数量有限，因为该原因，这些检查方法不适于在常规检查等情况下无症 状的一般公众的结肠癌筛选。近年来，作为用于结肠癌的一次筛选方法，已广泛实行了粪便的潜血试验，该试验 是一种非侵入方法并能以低成本进行。粪便潜血试验是用于检查包含于粪便并来自于血红 细胞的血红蛋白的存在与否，由此间接预测结肠癌存在的方法。因为如下原因粪便潜血试 验被广泛使用即，可在常温下进行粪便的采集和保存；不需要如冷藏和冷冻的特殊保存 条件；并且可以在一般家庭中简单的进行该试验，因此操作非常简易。然而，粪便潜血试验 的灵敏度低，约为25%，这意味着有比较高的漏检结肠癌存在的风险。另外，其阳性预测值 也低，并且在粪便潜血试验中被测定为阳性的受试者中，实际结肠癌病人的百分数为10% 以下。因而，该试验含有许多假阳性。因此，存在开发更可靠的新检查方法的强烈需要。作为适于常规检查等的非侵入、简易以及更可靠的新检查方法，用于检查粪便中 癌细胞或源自癌细胞的基因的有无的试验得到关注。与潜血试验相比(由该潜血试验检测 和结肠癌发病相关联而间接导致的消化道出血的存在)，期望该方法构成更可靠地检查方 法，这是因为其包含关于癌细胞或源自癌细胞的基因的有无的直接检查。
为了高准确度地检出粪便样品中的癌细胞等，重要的是有效地回收源自粪便样品 中癌细胞的核酸。由于粪便中含有大量的消化残余或细菌细胞，所以源自癌细胞的核酸的 量特别低，并且核酸也极易于降解。因此，为了从粪便样品中有效地回收核酸，特别是源自 如人类细胞的哺乳动物细胞的核酸，重要的是制备粪便样品以便防止粪便中核酸的降解并 直到检查操作时也能稳定地保存样品。关于用于制备粪便样品的这些方法，存在以下方法 从采集的粪便中分离从如大肠的消化道脱落的癌细胞的方法。通过分离来自粪便的癌细 胞，可以抑制由源自细菌等的降解酶，如蛋白酶、DNA酶(DNases)和RNA酶(RNases)引起 的不良影响。作为从粪便中分离癌细胞的方法，如已公开以下方法它是分离细胞并且特征 在于包括以下步骤的方法a)将粪便冷却至低于其凝胶凝固点(gel freezing point)的 步骤和b)从粪便中采集细胞同时保持粪便温度低于其凝胶凝固点的步骤，从而使粪便基 本保持完好(例如，参见专利文献1)。作为选择，已公开以下方法其中在通常周围温度下 将粪便分散于含有蛋白酶抑制物质、胶浆溶解剂和杀细菌剂的运输介质中，随后分离从大 肠脱落的细胞(例如，参见专利文献2)。另一方面，在组织学和细胞学观察细胞形态的情况下，为了使采集的细胞形态保 持到观察时，已经常规地实行了各种固定方法如福尔马林固定法和醇固定法。作为利用上 述固定方法优点的保存溶液(其能使哺乳动物细胞样品长期保存以及继保存之后的细胞 观察)，例如，已公开一种细胞溶液保存剂，该细胞溶液保存剂包含以足以固定哺乳动物细 胞的量的可与水混合的醇、以足以防止溶液中哺乳动物细胞凝集的量的抗凝剂和保持溶液 PH在4至7范围的缓冲剂(例如，参见专利文献3)。另外，作为不仅赋予细胞组织学和细胞学观察能力，而且还赋予继保存之后细胞 中蛋白质和核酸等的分子生物分析能力的保存溶液，例如，已公开以下溶液普通采集介质 (其含有缓冲组分、至少一种醇组分、固定组分和抑制选自由RNA、DNA和蛋白质组成的组中 的至少一种分子降解的化学剂(例如，参见专利文献4))或非水溶液(其含有5至20%的 聚乙二醇和80至95%的甲醇(例如，参见专利文献5))等。另外，还公开了一种组合物 它是稳定细胞结构和核酸并含有(a)第一物质和(b)第二促进物质的组合物，其中第一物 质含有至少一种醇或酮并能够沉淀或变性蛋白质，第二促进物质促进第一物质融合于至少 一个细胞中(例如，参见专利文献6)。[专利文献1]PCT国际公开的特表平11-511982号公报[专利文献2]PCT国际公开的特表2004-519202号公报[专利文献3]特开2003-153688号公报[专利文献4]PCT国际公开的特表2004-500897号公报[专利文献5]PCT国际公开的特表2005-532824号公报[专利文献6]特开2001-128662号公报[专利文献7]特公平6-72837号公报

发明内容
发明要解决的问题在如上述专利文献1所公开的从粪便中分离癌细胞的方法中，细胞在冷却粪便样 品时分离。如果没有冷却过程而实施该分离步骤，由于粪便样品变质等不能得到准确的检查结果。因此，为了有效地防止粪便样品的降解，在粪便采集后立即冷却粪便样品是重要 的。然而，当在一般家庭进行粪便采集以用于常规检查等时，将粪便样品采集后快速冷却很 难，因此不现实。另外，虽然，为了防止其劣化，可以冻结粪便样品，但检查前必需融解冻结的粪便 样品，因此使操作变得复杂。在上述专利文献2公开的将粪便分散于运输介质的方法中，虽然由于添加杀细菌 剂等可能在室温下制备和保存粪便样品而不包括任何冷却操作，但从粪便中分离从大肠脱 落的细胞是复杂的步骤。另外，从大肠脱落的细胞和源自从大肠脱落的细胞的核酸等还有 可能通过源自被杀细菌剂等破坏的细菌细胞的核酸酶和蛋白水解酶而降解，其结果是结肠 癌检查的准确性可能降低。另外，由于在保持存活时保存细胞，所以其分子谱(molecular profiling)如从大肠脱落的细胞中的基因表达也可能由于如抗生素等介质中组分引起的 不良影响而随时间改变。另一方面，通过使用上述专利文献3、4和5中公开的方法中描述的保存溶液，可以 在室温下稳定地保存细胞。然而，这些保存溶液通常通过靶向经分离的细胞来使用。因此， 很难将它们直接用于含有各种物质的生物样品，例如粪便。通过向分离自粪便的从大肠脱 落的细胞使用该保存溶液，可以使细胞长时间保存，而不改变其分子谱如细胞的基因表达。 然而，由于粪便中从大肠脱落的细胞数量不足，难以从细胞中提取用于分析的足量核酸。另 外，在上述专利文献6中公开的稳定细胞结构和核酸的组合物能稳定地保存主要源自阴道 拭子(vaginal swab)中的细菌的核酸。然而，绝没有描述该组合物是否能稳定地保存源自 哺乳动物细胞的核酸，该哺乳动物细胞具有不同于细菌的结构并且还以远小于细菌核酸的 量获得。此外，绝没有描述当将组合物用于不同于阴道拭子样品的含有大量消化残余等的 粪便时，是否可以稳定地保存核酸。本发明的目的是提供不需要任何复杂操作的用于制备粪便样品的方法，其能够从 粪便中有效地回收源自哺乳动物细胞，如从大肠脱落的细胞的核酸等；用于制备粪便样品 的溶液和上述方法中使用的粪便采集试剂盒；以及利用由上述方法制备的粪便样品来回收 和分析粪便中的核酸的方法。用于解决问题的方案作为为了解决上述问题而进行的广泛而深入研究的结果，本发明的发明人发 现通过将采集的粪便与具有水溶性有机溶剂作为活性成分的制备粪便样品用溶液混 合，可以制备能够有效回收包含于粪便的核酸的粪便样品；并且通过回收源自除了常居 (indigenous)肠细菌外的生物，如哺乳动物细胞(为检测靶标)的核酸，在粪便中大量含有 源自常居肠细菌的核酸的同时，可以高效地回收以痕量包含的并源自除了常居肠细菌外的 生物的核酸，由此导致本发明的完成。换言之，本发明包括以下方面。(1) 一种用于制备粪便样品的方法，它是用于制备粪便样品以便有效回收来自粪 便样品的核酸的方法，该方法的特征在于将从受试者采集的粪便与具有水溶性有机溶剂作 为活性成分的溶液混合。(2)根据第(1)项的用于制备粪便样品的方法，其特征在于在粪便和溶液的混合 比方面，相对于1体积粪便，溶液体积为1以上。
(3)根据第(1)或(2)项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于水溶性有机 溶剂为水溶性醇和/或酮。(4)根据第(1)至(3)项中任一项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于溶 液中的水溶性有机溶剂的浓度在30%至100%的范围。(5)根据第(3)或(4)项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于水溶性醇为 选自由乙醇、丙醇和甲醇组成的组中的至少一种醇。(6)根据第(5)项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于水溶性醇是乙醇。(7)根据第(3)或(4)项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于所述酮为丙
酮和/或甲基乙基酮。(8)根据第(1)或(2)项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于水溶性有机 溶剂为醛。(9)根据第(8)项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于溶液中醛的浓度 为0.01至30%的范围。(10)根据第⑴至(9)项中任一项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于 溶液进一步包含表面活性剂。(11)根据第(1)至(10)项中任一项所述的用于制备粪便样品的方法，其特征在于 溶液进一步包含着色剂。(12) 一种制备粪便样品用溶液，该溶液用于有效地回收来自粪便样品的核酸，该 溶液的特征在于具有水溶性有机溶剂作为活性成分。(13) 一种制备粪便样品用溶液，该溶液是用来有效回收来自粪便样品的核酸的溶 液，该溶液的特征在于包含具有30%至100%范围的浓度的水溶性有机溶剂。(14) 一种采集粪便用试剂盒，其特征在于该试剂盒包含粪便采集容器和具有水溶 性有机溶剂作为活性成分的溶液，其中所述粪便采集容器包含上述制备粪便样品用溶液。(15)根据第(14)项所述的采集粪便用试剂盒，其特征在于溶液中水溶性有机溶 剂的浓度为30%至100%的范围。(16) 一种通过第⑴至(11)项中任一项所述的用于制备粪便样品的方法制备的
粪便样品。(17) 一种用于回收核酸的方法，其特征在于该方法包括用于将从受试者采集的粪 便与具有水溶性有机溶剂作为活性成分的溶液混合以便制备混合物的步骤；和从混合物中 同时回收源自常居肠细菌的核酸和源自除了常居肠细菌外的生物的核酸的步骤。(18)根据第(17)项所述的用于回收核酸的方法，其特征在于源自除了常居肠细 菌外的生物的核酸是源自哺乳动物细胞的核酸。(19)根据第(17)或(18)项所述的用于回收核酸的方法，其中用于回收核酸的步 骤包括(a)在粪便样品中变性蛋白质并由此从粪便样品的常居肠细菌和除了常居肠细菌 外的生物中溶出核酸的步骤；和(b)回收上述步骤(a)溶出的核酸的步骤。(20)根据第(19)项所述的用于回收核酸的方法，其进一步包括，在上述步骤(a) 之后并在上述步骤(b)之前的(c)除去上述步骤(a)中变性的蛋白质的步骤。(21)根据第(19)或(20)项所述的用于回收核酸的方法，其中在步骤(a)中使用 选自由离液序列高的(Chaotropic)盐、有机溶剂和表面活性剂组成的组中至少一种材料进行蛋白质的变性。(22)根据第(21)项所述的用于回收核酸的方法，其中有机溶剂为酚。(23)根据第(20)_(22)项中任一项所述的用于回收核酸的方法，其中使用氯仿进 行步骤(iii)中的变性蛋白质的去除。(24)根据第(19)至(23)项中任一项所述的用于回收核酸的方法，其中步骤(b) 中核酸的回收包括(bl)使步骤(a)中溶出的核酸吸附至无机基体的步骤；和(b2)从无机 基体溶出在上述步骤(bl)中被吸附的核酸的步骤。(25)根据第(19)至(24)项中任一项所述的用于回收核酸的方法，其中在步骤 (i)之前进一步包括(iv)从粪便样品中回收固体组分。(26) 一种用于分析核酸的方法，其包括利用通过使用第(17)至(25)项中任一项 所述的用于回收核酸的方法从粪便样品中回收的核酸，进行源自哺乳动物细胞的核酸的分 析。(27)根据第(26)项所述的用于分析核酸的方法，其中哺乳动物细胞是消化道细 胞。(28)根据第(27)项所述的用于分析核酸的方法，其中消化道细胞是从大肠脱落 的细胞。(29)根据第(26)至(28)项中任一项所述的用于分析核酸的方法，其中源自哺乳 动物细胞的核酸是指示致瘤性转化的标记物。(30)根据第(26)至(28)项中任一项所述的用于分析核酸的方法，其中源自哺乳 动物细胞的核酸是指示炎症性胃肠疾病的标记物。(31)根据第(26)项所述的用于分析核酸的方法，其中所述分析为RNA分析和/或 DNA分析。(32)根据第(31)项所述的用于分析核酸的方法，其中所述RNA分析为RNA碱基的 插入、缺失、置换、重复或倒置分析，或剪接变体、mRNA表达分析和功能性RNA分析中的至少 一种分析。(33)根据第(31)项所述的用于分析核酸的方法，其中所述DNA分析为选自突变分 析和表观基因变化分析中至少一种的分析。(34)根据第(33)项所述的用于分析核酸的方法，其中所述突变分析为碱基插入、 缺失、置换、重复或倒置中至少一种突变的分析。(35)根据第(33)项所述的用于分析核酸的方法，其中所述突变分析为K-ras基因 的突变分析。(36)根据第(33)项所述的用于分析核酸的方法，其中所述表观基因改变分析为 DNA甲基化分析和DNA去甲基化分析中的至少一种分析。发明的效果通过使用根据本发明的用于制备粪便样品的方法，可以制备从其中能有效回收核 酸的粪便样品。另外，通过使用根据本发明的用于制备粪便样品的方法，可以稳定地保持以 相对少量包含于粪便样品中的源自除了常居肠细菌外的生物如哺乳动物细胞的核酸，从而 在室温下长时间保存。特别地，由于从粪便采集到粪便样品的制备、保存和运输过程可以在 室温下以简易的方式进行，该方法非常适于在常规检查等中进行的筛选试验的粪便样品的制备。而且，由于该方法不需要从粪便样品中分离为检测靶的生物或细胞，例如哺乳动物细 胞的复杂操作，因此即便当处理大量样品时，也可有效的降低所需劳动和成本的水平。特别 地，通过使用根据本发明的采集粪便用试剂盒，使更容易地制备粪便样品变为可能。此外，根据本发明的用于回收核酸的方法中，从通过根据本发明的制备粪便样品 的方法制备的粪便样品中，同时回收源自除了常居肠细菌外的生物的核酸以及源自常居肠 细菌的核酸。因此，可以相当高效地回收源自哺乳动物细胞等的以远小于源自常居肠细菌 获得的核酸量而获得的核酸，并且通过使用以该方式回收的核酸进行核酸分析，可以相当 高的灵敏度和准确性检测出特定疾病如结肠癌的标记物。如上所述，通过使用根据本发明的用于制备粪便样品的方法，从通过上述制备方 法制备的粪便样品中回收核酸的方法，以及使用经由上述核酸回收方法回收的核酸来分析 核酸的方法，可以高灵敏度和高准确度的分析粪便中的核酸。因此，期望对以结肠癌为代表 的各种症状和疾病的早期检查或诊断、治疗过程的观察或病人其它非正常情况的病理性研 究等做出巨大贡献。


图1为显示根据本发明的可用作采集粪便用试剂盒的粪便采集容器的一种形态 的图。图2为显示根据本发明的可用作采集粪便用试剂盒的粪便采集容器的另一种形 态的图。图3为显示实施例5中从使用各浓度的乙醇溶液制备的粪便样品中回收的RNA的 量的图。图4是实施例3中琼脂糖凝胶电泳后所得PCR产物用溴化3，8- 二氨基_5_乙 基-6-苯基菲啶鐺染色的图像。此图中，“3A”表示源自粪便样品(3A)的PCR产物移动的 泳道，“对照”表示源自对照样品的PCR产物移动的泳道，“M”和“M梯状条带”表示标记物 移动的泳道。此外，箭头指示233bp的带。图5为显示从各粪便样品回收的RNA的量的图。附图标记说明1 容器本体；Ia 隆起部；2 盖；3 粪便采集棒；3a 杯状体；S 制备粪便样品用 溶液；11 容器本体；12 盖；13 粪便采集棒；13a 孔；13b 可动盖；15 袋；E 粪便
具体实施例方式根据本发明的用于制备粪便样品的方法是为了有效回收来自粪便样品的核酸的 粪便样品制备方法，其特征在于将从受试者采集的粪便与具有水溶性有机溶剂作为活性成 分的溶液混合。通过将粪便与水溶性有机溶剂混合，可以将由于分解等产生的包含于粪便 的核酸的损失抑制降低到最低水平。因此，能够从粪便样品中有效回收核酸。认为由于以 下原因得到水溶性有机溶剂如此高效的核酸回收效果，即，防止核酸分解和以高效率稳定 地维持并回收核酸的效果。由水溶性有机溶剂组分引起的脱水作用相当大地降低作为检测 靶的除肠内固有细菌以外活细胞如哺乳动物细胞和病毒的细胞活性，以及肠内固有细菌的 细胞活性，由此抑制核酸随时间的降解。此外，由水溶性有机溶剂组分引起的蛋白质变性相当大地降低粪便中各种降解酶例如蛋白酶、DNA酶和RNA酶的活性。上述溶液，即根据本发明的制备粪便样品用溶液(其用于根据本发明的制备粪便 样品的方法中)包含水溶性有机溶剂作为活性成分。生物样品如粪便通常包含大量水。因 此，通过包含能以给定比例与高水溶性溶剂或水混合的水溶性有机溶剂作为活性成分，能 够将根据本发明的制备粪便样品用溶液与粪便样品快速混合，从而进一步提高核酸回收效 率。本发明中，术语“水溶性有机溶剂”意指醇、酮、醛和这此溶剂的组合物，并且这些 溶剂具有直链结构且在接近于室温的温度，例如从15°C至40°C下为液体状态。注意本发明 中“水溶性有机溶剂”不包括有机酸。通过包含具有直链结构的水溶性有机溶剂作为活性 成分，而不是包含具有环状结构，如苯环的水溶性有机溶剂作为活性成分，能够快速实施与 粪便样品的混合过程。通常，其中具有环状结构的有机溶剂容易与水分离，并因此很难与粪 便混合，这样很难实现高效地回收核酸。这是因为即使当使用在水中可溶至一定程度的溶 剂时，为了均勻地在其中分散粪便，多数情况下样品需要激烈地混合或加热。为了使具有环 状结构的有机溶剂与粪便较容易的混合，也可以预先制备有机溶剂和水的混合溶液，随后 将粪便与混合溶液混合。然而，为了制备这样的混合溶液，多数情况下具有环状结构的有机 溶剂和水需要进行激烈混合或加热，而这不是优选的。在根据本发明的制备粪便样品用溶液中，水溶性有机溶剂优选具有12重量％以 上的水溶性，更优选20%重量以上的水溶性，更加优选90重量％以上的水溶性，并最优选 水溶性有机溶剂为能与水以给定比例混合的溶剂。能与水以给定比例混合的水溶性有机溶 剂的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、丙酮和甲醛。并不特别限定包含于根据本发明的制备粪便样品用溶液中的水溶性有机溶剂，只 要它满足上述定义，并且是能够提高核酸回收效率的溶剂即可。水溶性有机溶剂的实例包 括为水溶性醇的醇，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和巯基乙醇；酮如丙酮和甲基乙基酮(具有90 重量％的水溶性)；醛如乙醛(乙酰基醛)、甲醛(福尔马林)、戊二醛、低聚甲醛和乙二醛。 丙醇可以是正丙醇或2-丙醇。另外，丁醇可以是1-丁醇(具有20重量％的水溶性)或 2- 丁醇(具有12. 5重量％的水溶性)。在本发明中使用的水溶性有机溶剂优选水溶性醇、 丙酮、甲基乙基酮或甲醛。这是因为这些溶剂具有足够高的水溶性。水溶性有机溶剂更优 选水溶性醇，并更加优选乙醇、丙醇或甲醇。特别地乙醇是最安全的并能在一般家庭中容易 处理，因此在用于常规检查等的筛选试验中特别有用。并不特别限定在根据本发明的制备粪便样品用溶液中的水溶性有机溶剂的浓度， 只要它是能够提高核酸回收效率的浓度即可，因此能够根据水溶性有机溶剂的类型等合理 的确定。例如，当将水溶性醇或酮用作活性成分时，在根据本发明的制备粪便样品用溶液中 的水溶性有机溶剂的浓度优选至少30%至不高于100%。如果水溶性有机溶剂的浓度足够 高，当将粪便和制备粪便样品用溶液混合时，水溶性有机溶剂组分快速地渗入粪便中的哺 乳动物细胞或常居肠细菌，从而快速提高核酸回收的效率。注意本发明中和本说明书中，除非另作说明，否则“ ％ ”表示“体积％ ”。特别地，当将水溶性醇用作活性成分时，在根据本发明的制备粪便样品用溶液中 水溶性有机溶剂的浓度优选至少30 %，更优选至少50 %，更加优选在50至80 %的范围，并 最优选60至70%的范围。即使当相对于具有高含水量的粪便使用少量制备粪便样品用溶
11液时，由于水溶性有机溶剂浓度增加，也能够得到核酸回收的足够高的效率。另外，当将丙酮或甲基乙基酮用作活性成分时，根据本发明的制备粪便样品用溶 液中水溶性有机溶剂的浓度优选至少30%至不高于100%，并且在该范围内，更优选至少 60%，并更加优选至少80%。可选地，当将乙醛、甲醛、戊二醛、低聚甲醛或乙二醛用作活性 成分时，根据本发明的制备粪便样品用溶液中水溶性有机溶剂的浓度优选为至少0. 01%至 不超过30 %，更优选至少0. 03 %至不超过10 %，并更加优选至少3 %至不超过5 %。与醇和 酮的浓度相比，即使在较低的浓度时，醛也可以提高核酸回收的效率。另外，本发明中使用的水溶性有机溶剂可仅含有单一类型的水溶性有机溶剂或者 可以是两种以上类型水溶性有机溶剂的混合溶液。例如，水溶性有机溶剂可以是两种以上 醇的混合溶液，或者可以是醇和其它类型的水溶性有机溶剂的混合溶液。由于能够更进一 步地提高核酸的回收效率，还优选水溶性有机溶剂是醇和丙酮的混合溶液。虽然并不特别限定与采集的粪便混合的制备粪便样品用溶液的体积，但是在粪便 和制备粪便样品用溶液的混合比方面，相对于1体积粪便，制备粪便样品用溶液的体积优 选为1以上。这是因为当将粪便采集于含有制备粪便样品用溶液的采集容器时，如果制备 粪便样品用溶液的体积等于或比粪便体积大，则粪便可以完全地浸于该溶液中，因此，可以 得到本发明的效果。例如，当粪便体积与制备粪便样品用溶液的体积相等时，可以减少含有 制备粪便样品用溶液的粪便采集容器的重量和尺寸。另一方面，通过将制备粪便样品用溶 液与粪便混合，该溶液为五倍以上体积的粪便，可以将粪便有效地分散于该溶液，并且还能 够抑制由因粪便中所含的水产生的水溶性醇浓度降低引起的不良影响。考虑到在两种效果 之间达到良好平等，即，含有制备粪便样品用溶液的粪便采集容器的重量减少和粪便分散 性的改善，粪便和制备粪便样品用溶液的混合比更优选为从1 1至1 20，更加优选从 1 3至1 10，并最优选约1 5。虽然并不特别限定与采集的粪便混合的制备粪便样品用溶液的体积，但该体积优 选为100μ 1至IOOml的范围，并更优选Iml至IOml的范围。当该溶液的量低于上述体积 时，粪便和溶液不能以有效方式混合。另一方面，当溶液的量大于上述体积时，将增加粪便 采集容器的尺寸，这使得难以处理。应注意，只要提供给根据本发明的制备粪便样品方法的粪便源自动物(受试者)， 则并不对其特别限定，但优选为源自哺乳动物的粪便，并更优选源自人的粪便。例如，粪便 优选为采集用于常规检查或诊断等的人粪便，但可以是家畜或野生动物等的粪便。此外，粪 便可以是其采集后已保存一段时间的那种；但是优选刚采集的那种。此外，优选其排泄后立 即采集的粪便，但粪便可以在其排泄一段时间后采集。并不特别限定提供给根据本发明的用于制备粪便样品的方法的粪便量，但优选 IOmg至Ig的范围。当粪便量过大时，则增加采集操作所需的时间，并且粪便采集容器的尺 寸也变的过大，因此，可能损害处理性能等。另一方面，当粪便量过小时，由于包含于粪便的 哺乳动物细胞，如从大肠脱落的细胞的数量过小，不能回收必需的核酸量，并因此可能降低 目标核酸分析准确度的水平。另外，由于粪便是不均质的，换言之，由于各种组分以非均一 方式存在于其中，为了避免粪便采集时，哺乳动物细胞局部化引起的不利影响，优选从粪便 不同部分采集样品。可以通过适当稀释水溶性有机溶剂以调整至所需浓度来获得制备粪便样品用溶液。并不特别限定用于稀释的溶剂，但是优选水和磷酸缓冲盐(PBS)的缓冲溶液。另外，制 备粪便样品用溶液可包含除水溶性有机溶剂外的任何成分，只要他们不损害由于水溶性有 机溶剂成分达到的核酸回收效率即可。例如，该溶液可包含离液序列高的盐或表面活性剂。 通过包含离液序列高的盐或表面活性剂，可以更有效地抑制粪便中的细胞活性或各种降解 酶的酶活性。包含于制备粪便样品用溶液的离液序列高的盐的实例包括盐酸胍、异硫氰酸 胍、碘化钠、高氯酸钠和三氯醋酸钠。包含于制备粪便样品用溶液的表面活性剂优选为非离子型表面活性剂。非离子 型表面活性剂的实例包括吐温80、CHAPS(3-[3-胆酰胺丙基二甲氨基]_1丙磺酸内盐)、 Triton X-100和吐温20。并不特别限定离液序列高的盐或表面活性剂的类型和浓度，只要 它是具有能够增加核酸回收效率的浓度，因此可以根据粪便量或随后采用的回收和分析核 酸的方法适当地确定的组分即可。另外，可适当地将着色剂添加到制备粪便样品用溶液中，通过对制备粪便样品用 溶液的着色，可实现各种效果，如防止误吞和减轻粪便颜色。着色剂优选为蓝色或绿色等的 用作食品添加剂的着色剂(coloring agent) 0优选实例包括坚牢绿FCF (Green No. 3)、亮 蓝FCF(Blue No. 1)和靛胭脂红(Blue No. 2)。另外，可将多种着色剂作为混合物添加或可 添加单一着色剂。优选快速进行粪便和制备粪便样品用溶液的混合。这是因为通过在制备粪便样品 用溶液中快速分散粪便，使水溶性有机溶剂组分快速渗入粪便中的细胞，从而迅速地增加 核酸回收的效率。注意并不特别限定用于混合粪便和制备粪便样品用溶液的方法，只要它 是涉及物理操作的混合方法即可。例如，可通过将采集的粪便放入预先添加有制备粪便样 品用溶液的可密封容器中进行混合，随后倒置容器或使用摇动器如旋涡混合器震动容器。 另外，粪便和制备粪便样品用溶液可在混合用粒子的存在下混合。由于可以快速地进行混合，优选采用使用摇动器或混合用粒子的混合方法，特别 地，通过使用在其中预先添加有混合用粒子的粪便采集容器，即使在没有专门装置的环境 如一般家庭中也能快速地进行混合。并不特别限定混合用粒子，只要它们由不损害由于水溶性有机溶剂组分而达到的 核酸回收效率的组合物形成，并且是当与粪便碰撞时具有足够硬度和比重以便在制备粪便 样品用溶液中快速分散粪便的粒子即可。该粒子可由一种材料组成或可以由2种以上材料 组成。该混合用粒子的实例包括由玻璃、陶器、塑料、乳胶或金属等组成的粒子。另外，混合 用粒子可为磁性粒子或非磁性粒子。特别地，作为目标核酸，当分析源自除了常居肠细菌以外的生物的核酸(换言之， 与大量包含于其中的源自常居肠细菌的核酸相比，以相对少量的包含于粪便中的核酸) 时，优选使用根据本发明的制备粪便样品用溶液来制备粪便样品。粪便中的核酸由于降解 等在粪便排出后随时间而逐渐地丧失。因为该原因，当目标核酸是粪便中少量存在的核酸 时，如果使用其中已发生核酸降解的粪便样品进行分析，可能不能回收足量的目标核酸用 于分析。因此，即使在粪便排出后即刻在粪便中存在目标核酸时，结果也极有可能将出现阴 性(即，粪便中不存在目标核酸)。通过使用根据本发明的制备粪便样品用溶液来制备粪便 样品，可将粪便中的核酸稳定地保存，结果，即使核酸在粪便中少量存在时，也能有效地回 收粪便中的核酸，从而改善核酸分析的可靠性。
上述源自除了常居肠细菌外的生物的核酸的实例包括源自哺乳动物细胞的核酸， 如源自癌细胞的核酸和源自如肝炎病毒的那些引起传染病的初期或后期感染细胞的核酸。 另外，核酸可源自寄生虫。注意，本发明中，术语“常居肠细菌”意指在粪便中以较大量并通常在如人的动物 肠内生活的细菌细胞。该常居肠细菌的实例包括专性厌氧菌(obligate anaerobe)如属于 拟杆菌(Bacteroides)属、真细菌(Eubacterium)属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和梭 状芽孢杆菌(Clostridium)属的细菌；和兼性厌氧菌(facultative anaerobe)如属于大肠 杆菌(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克霉白杆菌(Klebsiella)属、柠檬酸细菌 (Citrobacter)属禾口肠球菌(Enterococcus)的细菌。另外，只要存在足量的水溶性有机溶剂，对于由于水溶性有机溶剂组分产生的核 酸回收如此高的效果并不特别地受温度条件的不利影响。因此，当在室温(换言之，通常进 行粪便采集的温度)采用根据本发明的用于制备粪便样品的方法时，可以降低粪便中核酸 的损失。另外，即使当将制备的粪便样品在室温保存或运输时，也能稳定地保存粪便中的核 酸。注意粪便样品优选保存在不高于50°C。这是因为高温条件下粪便样品的长期保存由于 挥发等降低了粪便样品中水溶性有机溶剂的浓度，因此浓度可能变为低于用于增加核酸回 收效果的足够浓度。通过根据本发明的制备粪便样品的方法制备的粪便样品，S卩，本发明的粪便样品， 由于通过水溶性有机溶剂的脱水和蛋白质变性，能够更稳定的保存粪便中的核酸，特别是 仅以相对少量存在于粪便的源自哺乳动物细胞的核酸。因此，如果使用本发明的制备方法 制备粪便样品，不仅在当将刚制备后的粪便样品用于核酸分析时，而且还在当将长期保存 或运输的粪便样品用于分析时，期望能获得可靠性高的分析结果。特别地，粪便中的核酸， 尤其源自哺乳动物细胞的核酸能够在室温稳定地长期保存，而将关于包含于粪便中的从大 肠脱落的细胞等哺乳动物细胞的分子谱的随时间的变化抑制到最低水平。因此，通过使用 本发明的制备方法制备采集的粪便，即使在从粪便采集到核酸分析需要一段时间时，或在 粪便采集在某地进行随后核酸分析在另外的地方进行时，如用于常规检查等的筛选试验的 情况下，也有可能保存或运输粪便样品，同时抑制核酸，特别是尤其易于分解的RNA的降 解。另外，可以简易方式低成本保存或运输粪便样品，而无需提供任何专门冷藏或冷冻装置 或设定保存温度条件。正如其它含核酸的生物样品一样，可将本发明的粪便样品提供用于各种核酸分 析。特别优选将粪便样品提供于为了检查其早期发现是极其关键的癌症发展或传染病发生 的核酸分析中。另外，为了检查炎性疾病如结肠炎、肠炎、胃炎和胰腺炎的发展，同样优选提 供该粪便样品。可选择地，还可将粪便样品提供用于隆起性病变如息肉的检查或如胃溃疡 的大肠、小肠、胃、肝脏、胆囊和胆管疾病的检查。例如，通过检测和分析源自癌细胞的核酸，换言之，来自粪便的带有突变的核酸， 可以检查如结肠癌和胰腺癌的癌症的发展。另外，通过检查是否能够从粪便中检测到源自 引起传染病的生物制剂(biological agents)的核酸，如源自病毒的核酸或源自寄生虫的 核酸，可以检查传染病的发展或寄生虫存在与否。特别地，通过使用检测排泄于粪便中的生 物制剂，如A型和E型肝炎病毒用粪便样品，可以用非侵入、简易的方式进行传染病的测试。 另外，通过检查是否能够检测到源自除了常居肠细菌外的病原菌，例如，引起食物中毒的细
14菌如肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli) 0-157株的核酸，也可以测试细菌微生物病的发展。特别优选检测指示致瘤性转化的标记物或指示炎症性胃肠疾病的标记物。指示 致瘤性转化的标记物的实例包括已知的癌症标记物，如癌胚抗原(CEA)和唾液酸Tn抗原 (STN)，以及APC基因、p53基因或K-ras基因等中是否存在突变。另外，基因如pl6、hMLHI、 MGMT、pl4、APC、E-cadherin、ESRl和SFRF2的甲基化检测作为结肠疾病诊断标记物也是有 用的(如，参见Lind等"A CpG island hypermethyIation profile of primarycolorectal carcinomas and colon cancer cell lines"MolecularCancer,2004, Vol. 3, No. 28)。另 外，已报道粪便样品中源自幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)的DNA可用作胃癌的标 记物(例如，参见 Nilsson 等，Journal of Clinical Microbiology, 2004, Vol. 42, No. 8， pp. 3781-3788)。同时，已知如，Cox-2基因等，作为指示炎症性胃肠道疾病的标记物。由于可以从通过本发明制备方法制备的粪便中高效地回收核酸，所以样品非常适 于不仅在粪便中大量存在的源自常居肠细菌的核酸分析，而且还适于以少量存在的源自 哺乳动物细胞的核酸分析。由于样品由粪便形成，优选用于分析源自消化道，如大肠、小肠 和胃的细胞的核酸，并特别优选使用该样品分析源自从大肠脱落的细胞的核酸。在粪便中存在各种各样的物质，并且其中还存在核酸分析中可能变为抑制因素的 大量物质。因此，通过首先从粪便样品中回收核酸，然后使用回收的核酸进行核酸分析，可 能进一步提高分析的准确性。并不特别限定从粪便样品中回收核酸的方法，可采用任何类 型的方法，只要是从样品回收核酸时通常使用的方法即可。本发明的粪便样品包含源自除 了常居肠细菌外的生物，如哺乳动物细胞(下文，可称作“哺乳动物细胞等”)的核酸，和源 自常居肠细菌的核酸。在从粪便中的核酸回收中，虽然可分别回收源自哺乳动物细胞等的 核酸和源自常居肠细菌的核酸，但是特别优选同时回收它们。通过同时回收源自哺乳动物 细胞等的核酸和源自常居肠细菌的核酸，与从粪便中分离出哺乳动物细胞等后，回收核酸 的情况相比，作为粪便中非常丰富的源自常居肠细菌的核酸用作载体的结果，可以更有效 地回收少量存在的源自哺乳动物细胞等的核酸。注意从粪便样品中回收的核酸可以是DNA、 RNA或DNA和RNA的混合物。例如，通过实施以下步骤可以从本发明的粪便样品中同时回收源自哺乳动物细胞 等的核酸和源自常居肠细菌的核酸作为步骤(a)，在本发明的粪便样品中使蛋白质变性， 从而溶出源自粪便样品中哺乳动物细胞等和常居肠细菌的核酸；然后，作为步骤(b)，回收 溶出的核酸。可使用常规已知技术进行步骤(a)的粪便样品中的蛋白质变性。例如，通过向粪 便样品中添加用作蛋白质变性剂的化合物，如离液序列高的盐、有机溶剂或表面活性剂，可 以使粪便样品中的蛋白质变性。作为步骤(a)中向粪便样品中添加的离液序列高的盐或表 面活性剂，可以使用与前述添加到根据本发明的制备粪便样品用溶液中那些相同的离液序 列高的盐和表面活性剂。优选将苯酚作为上述有机溶剂。苯酚可以是中性或酸性。当使用 酸性苯酚时，可以在水层中选择性提取RNA而不是DNA。注意当将离液序列高的盐、有机溶 剂、表面活性剂等添加到步骤(a)中的粪便样品时，可添加一种类型的化合物，或可添加两 种以上类型的化合物。在步骤(a)之后和步骤(b)之前，作为步骤(c)可除去步骤(a)中的变性蛋白质。通过在回收核酸前除去变性的蛋白质，可以改善回收的核酸的品质。步骤(C)中的蛋白质 去除可通过使用已知的常规技术进行。例如，可通过离心法接着单独收集上清液沉淀变性 蛋白质来除去变性蛋白质。另外，不同于简单进行离心分离方法，可通过首先向样品添加氯 仿，并随后使用涡流混合机等将生成物进行充分地搅拌和混合来进一步更彻底地除去变性 的蛋白质，然后通过离心法接着单独收集上清液来沉淀变性的蛋白质。步骤(b)中溶出的核酸的回收可通过已知技术，如乙醇沉淀法和氯化铯超速离心 法进行。而且，可通过以下回收核酸首先作为步骤(bl)，使步骤(a)中溶出的核酸吸附到 无机基体；然后，作为步骤(b2)，使步骤(bl)中吸附的核酸从无机基体中溶出。作为步骤 (bl)中吸附核酸的无机基体，可使用能够吸附核酸的常规已知无机基体。另外，并不特别 限定无机基体的的形状，并且它可以是粒子状或膜状。无机基体的实例包括含二氧化硅的 粒子(珠子)如硅胶、硅基氧化物(siliceous oxide)、玻璃和硅藻土 ；以及由尼龙、聚碳酸 酯、聚丙烯酸酯和硝化纤维制成的多孔膜。作为步骤(b2)中从无机基体溶出吸附的核酸的溶剂，可使用通常用于从常规已 知无机基体溶出核酸的溶剂，这适当地取决于回收的核酸的类型或用于随后的核酸分析的 方法。特别优选将纯化水作为溶出的溶剂。注意在步骤(bl)之后和步骤(b2)之前，优选 用适当的洗涤缓冲液洗涤吸附有核酸的无机基体。应注意，当使用以足以从哺乳动物细胞等中溶出核酸的浓度含有离液序列高的盐 或表面活性剂的制备粪便样品用溶液来制备粪便样品时，从粪便样品回收核酸中可省略步 骤(a)。当使用不含有足以从哺乳动物细胞等中溶出核酸的浓度的离液序列高的盐或表 面活性剂的制备粪便样品用溶液来制备粪便样品时，作为步骤(d)，优选在步骤(a)之前， 从粪便样品中回收固体成分。为了快速混合粪便和制备粪便样品用溶液，相对于粪便中的 固体成分，粪便样品含有较大比例的液体成分。因此，通过从粪便样品中除去制备粪便样品 用溶液，然后仅回收含有哺乳动物细胞等和常居肠细菌的固体成分，可以降低用于回收和 分析核酸的样品的重量。而且，通过从固体成分中除去水溶性有机溶剂，还可以抑制从固体 成分中回收核酸步骤中水溶性有机溶剂的不利影响。例如，通过离心本发明的粪便样品从 而沉淀其中的固体成分，然后除去上清，可单独回收固体成分。可选择地，还可以通过过滤 法等单独回收固体成分。此外，还优选用适当的缓冲液，如磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7. 4)洗 涤回收的固体成分。注意，虽然蛋白质的变性剂，如离液序列高的盐可直接添加到回收的固体成分，但 优选首先在适当介质中悬浮固体成分，然后向其中添加蛋白质的变性剂。当回收DNA时，作 为溶出介质，可使用如磷酸缓冲液或tris缓冲液等。优选将介质中的DNA酶通过高压蒸汽 灭菌等失活，并且更优选介质包含蛋白水解酶，如蛋白酶K。另一方面，当回收RNA时，作为 溶出介质，可使用如柠檬酸缓冲液等。然而，由于RNA是极易降解的物质，优选使用含有RNA 酶抑制剂，如硫氰酸胍和盐酸胍的缓冲液。取决于随后使用的分析方法，可以不需从粪便中回收核酸。更具体地，在从粪便样 品中的哺乳动物细胞等和常居肠细菌中溶出核酸后，可直接将样品用于核酸分析。例如，当 粪便样品中大量存在病原菌等，并且如果要分析来自病原菌的核酸，则可以通过以下检测 源自病原菌的基因等首先从粪便样品中回收固体成分，然后向其中添加含有蛋白水解酶，如蛋白酶K的溶出用介质，如PBS从而混合，最后将得到的粪便样品的均一溶液直接用于核 酸分析。可选择地，还可以通过使用商购可得试剂盒如核酸提取试剂盒或病毒检测试剂盒 进行粪便中核酸的回收。可使用常规已知分析方法分析从本发明的粪便样品回收的核酸。用于分析核酸的 方法的实例包括定量核酸的方法和使用聚合酶链式反应(PCR)等检测特定碱基序列区域 的方法。另外，当回收RNA时，可以通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)首先合成cDNA， 然后以与上述DNA分析相同的方式分析合成的cDNA。例如，通过检测基因突变，如编码癌基 因等的碱基序列区域或含有小随体的碱基序列区域的存在与否，可以检查癌症的发展。例 如当使用从粪便中回收的DNA时，可以进行DNA中突变的分析或表观基因改变的分析。突 变分析的实例包括碱基插入、缺失、置换、重复和倒置分析。另外，表观基因改变分析的实例 包括甲基化和去甲基化分析。另一方面，例如当使用回收的RNA时，可以检测突变，如RNA 碱基中的插入、缺失、置换、重复和倒置以及剪接变体(isoforms)。另外，可以进行功能性 RNA (非编码RNA)的分析，例如，转移RNA (tRNA)、核糖体RNA (rKNA)和微RNA (miRNA)的分 析。此外，还可以检测和分析RNA表达的水平。特别优选进行mRNA表达分析、K-ras基因 的突变分析或DNA甲基化分析等。注意，可使用本领域常规已知方法进行这些分析。而且， 还可以使用商购可得分析试剂盒如K-ras基因突变分析试剂盒和甲基化检测试剂盒。通过在预先添加有根据本发明的制备粪便样品用溶液的粪便采集容器中采集粪 便，可以用更简单和快捷的方式制备采集的粪便。另外，通过使用用于采集粪便的试剂盒， 能够更容易地实现本发明的效果，其中用于采集粪便的试剂盒包括根据本发明的制备粪便 样品用溶液和含有制备粪便样品用溶液的粪便采集容器。注意，用于采集粪便的试剂盒适 当地可包含除了制备粪便样品用溶液和含有该溶液的粪便采集容器以外的构成物，如粪便 采集棒。并不特别限定该粪便采集容器的形式和尺寸，可使用可以包含溶剂的已知粪便采 集容器。由于易于处理，优选整合有粪便采集容器盖和粪便采集棒的粪便采集容器。另外， 因为可以控制粪便采集的量，所以更优选粪便采集棒能采集特定量粪便的容器。该已知的粪便采集容器的实例包括公开于专利文献7中的粪便采集容器。图1和2是显示可用于根据本发明的采集粪便用试剂盒的粪便采集容器的一种形 态的图。应注意可用于根据本发明的采集粪便用试剂盒的粪便采集容器并不限于这些粪便 采集容器。首先，将描述图1中的粪便采集容器。粪便采集容器包含与粪便采集棒3 —体化 的盖2，以及容器本体1，并且其中包含有根据本发明的制备粪便样品用溶液S。可采集特定 量粪便的杯状体(cup) 3a附着于粪便采集棒3的顶端，并且该杯状体3a具有网筛(sieve mesh) 0同时，在容器本体1的底部存在具有与杯状体3a互补形状的隆起部la。通过使杯 状体3a与隆起部Ia相配合，使采集于杯状体3a的粪便机械的从杯状体3a的网筛挤出，从 而可以使粪便快速地分散于制备粪便样品用溶液S中。图2记载的粪便采集容器是包含以下的粪便采集容器与具有尖端的粪便采集棒 13—体化的盖12 ；容器本体11 ；和在容器本体11内部，被密封并含有根据本发明的制备粪 便样品用溶液S的袋15。用于采集特定量粪便E的孔(orifice) 13a设置于粪便采集棒13 中。另外，还附着有通过滑过粪便采集棒13可变为孔13a的盖的可动盖13b。如图2a中所示，可动盖13b首先通过孔13a滑向盖12侧以使孔13a处于完全开放状态，然后，将粪便采 集棒13压向粪便E。然后，如图2b所示，使孔13a填充有粪便E。在该情况下，滑动可动盖 13b以覆盖孔13a，从而准确地采集与孔13a相同体积的粪便(图2c)。随后，将可动盖13b 返回到初始位置，以使孔13a处于完全开放的状态(图2d)，然后将盖12收纳于容器本体 11中(图2e)。当粪便采集棒13收纳于容器本体11中时，由于粪便采集棒13的尖端破坏 含有制备粪便样品用溶液S的袋15，所以混合了该制备粪便样品用溶液S和粪便E。由于 该粪便采集容器只有在粪便采集棒处于容器内部后才充满溶液，即使当使用对人体有害的 制备粪便样品用溶液，如甲醇时，也可避免由于溶液泄漏产生的事故，因此即使在一般家庭 中也可以安全地操作该容器。然后，基于一系列实施例，将更详细地描述本发明，虽然本发明的范围绝不局限于 以下实施例。注意除非别有说明，否则“ ％ ”意指“体积％ ”。另外，Caco-2细胞、SW620细 胞和MKN45细胞(这些为培养细胞)以及产气肠杆菌的细菌细胞通过普通方法培养。实施例1将从一个健康个体采集的粪便分配到三个15mL的聚丙烯管中(每管Ig)。分配后 立即用液氮将一个聚丙烯管迅速地冷冻处理，从而制备粪便样品(IA)。分配后，向其它聚丙 烯管之一添加IOmL 70%的乙醇溶液。在粪便充分分散于溶液后，将试管静置1小时，从而 制备粪便样品(IB)。分配后，将剩余的未向其中添加任何溶液等的一个聚丙烯管迅速转移 到提取步骤，从而制备粪便样品(IC)。之后，从各粪便样品中回收RNA。更具体地，将3mL酚混合物“Trizol”(由 Invitrogen Corporation制造)添加到各粪便样品，并且将样品用均化器充分混合30秒 以上，随后添加3mL氯仿。经涡旋充分混合所得物后，将样品在4°C下离心(12，OOOXg) 20 分钟。将作为离心结果得到的上清液(水层)通过RNeasy midi试剂盒(由Qiagen GmbH 制造)的RNA回收柱，通过洗涤RNA回收柱回收RNA，随后根据试剂盒提供的操作规程提取 RNA。使用 NanoDrop 装置(由 NanoDrop Technologies, Inc.制造)定量化回收的 RNA。图5是显示从各粪便样品回收的RNA量的图。从利用乙醇溶液(是本发明的制备 粪便样品用溶液)制备的粪便样品(IB)中，可以回收与其中粪便采集后立即快速提取核酸 的粪便样品(IC)相比，更大量的RNA，虽然它比从粪便采集后立即进行冷冻处理的粪便样 品(IA)中回收的RNA的量稍微少。但从这些结果，显然即使当制备过程在室温下进行时， 通过制备过程中使用根据本发明的制备粪便样品用溶液，可以得到从其中能高效回收核酸 的粪便样品。在病人在家中采集用于检查等的粪便的情况下，期望能够在接近于室温的温 度下进行粪便样品的制备。根据本发明的制备粪便样品用溶液完全满足该要求。实施例2将0.5g健康个体的粪便与表达高水平MDRl (多药抗性1)基因的5. OX IO5个人 类结肠癌细胞系(Caco-2细胞)的细胞混合以制备结肠癌病人的人工粪便，并且通过根据 本发明的用于制备粪便样品的方法，将该人工粪便用于制备粪便样品。更具体地，将结肠癌病人的人工粪便分配到15mL的聚丙烯管(每管0. 5g)中， 向各管添加表1所示的制备粪便样品用溶液并混合，从而制备粪便样品。注意，表中“普 通采集介质”意指公开于专利文献4的保存介质，该保存介质包含500mL Puck' sSaline G、400mg碳酸氢钠、IOg牛血清白蛋白(BSA) ,500单位/L青霉素G、500mg/L硫酸链霉素、1. 25mg/L两性霉素B和50mg/L庆大霉素。将制备的粪便样品分别保存于设为室温(25°C ) 的恒温培养箱1、3、7和10天。[表1]
制备粪便样品用溶液(2A)5mL70%的甲醇溶液(2B)ImL 100%的甲醇溶液(2C)5mL普通采集介质(2D)5mL PBS保存之后，从各粪便样品回收RNA，并且尝试从回收的RNA中检测MDRl基因的转录 产物(mRNA)。相对于用制备粪便样品用溶液(2C)制备的粪便样品(下文，称为“粪便样品 (2C) ”，首先分离出包含Caco-2的哺乳动物细胞，随后回收RNA。相对于用除制备粪便样品 用溶液(2C)之外的制备粪便样品用溶液制备的粪便样品，在没有分离哺乳动物细胞的情 况下同时回收源自哺乳动物细胞的核酸和源自细菌的核酸。从粪便样品(2C)中分离哺乳 动物细胞的具体实施如下将5mL Histopack 1077溶液(由Sigma-Aldrich Corporation 制造)添加到粪便样品(2C)并混合，然后将混合物在室温下离心(200Xg)30分钟，随后回 收悬浮液和Histopack 1077液之间的界面部分。用PBS洗涤分离的哺乳动物细胞三次。从粪便样品回收RNA的具体实施如下。将3mL酚混合物“Trizol”(由Invltrogen Corporation制造)首先添加到粪便样品(或分离的哺乳动物细胞，仅对于粪便样品(2C) 的情况)，并且用均化器将样品充分混合30秒以上，随后添加3mL氯仿。然后，在12，OOOXg 下将所得物离心10分钟。将作为离心结果得到的上清液(水层)收集于新的聚丙烯管中。 之后，用RNeasy midi试剂盒(由Qiagen Gml3H制造)从收集的上清液中回收RNA。用回收的RNA进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，然后用得到的cDNA作为 模板进行PCR。关于引物，将用于扩增MDRl基因具有序列号1的碱基序列和用于扩增MDRl 基因具有序列号2的碱基序列分别用作正向引物和反向引物。更具体地，向0.2mL PCR管中添加12 μ L的超纯水和2 μ L的缓冲液(10 X )、并 向其中添加IyL cDNA、正向引物、反向引物、氯化镁、dNTP和DNA聚合酶并混合，从而制 备PCR反应溶液。将PCR进行30个循环，各扩增循环由以下组成95°C 30秒、60°C 30秒， 然后在72°C 1分钟条件下培育PCR管。将作为扩增结果得到的PCR产物用Agilent DNA IOOOLabChip (注册商标)试剂盒(由Agilent Technologies，，Inc.制造)进行电泳，测 量得到的带的强度，从而检查由PCR产物指示的扩增程度。[表 2]
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权利要求
一种用于制备粪便样品以便有效回收来自所述粪便样品的核酸的方法，所述方法包括将从受试者采集的粪便与具有水溶性有机溶剂作为活性成分的溶液混合。
2.根据权利要求1所述的用于制备粪便样品的方法，其中在所述粪便和所述溶液的混合比方面，相对于1体积的所述粪便，溶液的体积为1 以上。
3.根据权利要求1或2所述的用于制备粪便样品的方法， 其中所述水溶性有机溶剂为水溶性醇和/或酮。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于制备粪便样品的方法， 其中所述溶液中的所述水溶性有机溶剂的浓度在30%至100%的范围。
5.根据权利要求3或4所述的用于制备粪便样品的方法，其中所述水溶性醇是选自由乙醇、丙醇和甲醇组成的组中的至少一种醇。
6.根据权利要求5所述的用于制备粪便样品的方法，其中所述水溶性醇为乙醇。
7.根据权利要求3或4所述的用于制备粪便样品的方法，其中所述酮为丙酮和/或甲 基乙基酮。
8.根据权利要求1或2所述的用于制备粪便样品的方法，其中所述水溶性有机溶剂为
9.根据权利要求8所述的用于制备粪便样品的方法，其中在所述溶液中的所述醛的浓 度为0.01至30%的范围。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于制备粪便样品的方法，其中所述溶液进一 步包含表面活性剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于制备粪便样品的方法，其中所述溶液进一步包含着色剂。
12.—种制备粪便样品用溶液，所述溶液为用于有效地回收来自粪便样品的核酸的溶液，所述溶液包括水溶性有机溶剂作为活性成分。
13.一种制备粪便样品用溶液，所述溶液为用于有效地回收来自粪便样品的核酸的溶液，所述溶液包括具有浓度在30%至100%的范围的水溶性有机溶剂。
14.一种采集粪便用试剂盒，其包括 粪便采集容器；和具有水溶性有机溶剂作为活性成分的溶液， 其中所述粪便采集容器包含制备粪便样品用溶液。
15.根据权利要求14所述的采集粪便用试剂盒，其中所述溶液中的所述水溶性有机溶剂的浓度在30%至100%的范围。
16.一种粪便样品，其通过权利要求1至11中任一项所述的用于制备粪便样品的方法 制备。
17.一种用于回收核酸的方法，其包括用于将从受试者采集的粪便与具有水溶性有机溶剂作为活性成分的溶液混合的步骤;和用于从所述混合物同时回收源自常居肠细菌的核酸和源自除了常居肠细菌外的生物 的核酸的步骤。
18.根据权利要求17所述的用于回收核酸的方法，其中所述源自除了常居肠细菌以外的生物的核酸为源自哺乳动物细胞的核酸。
19.根据权利要求17或18所述的用于回收核酸的方法， 其中所述用于回收核酸的步骤包括(a)用于使所述粪便样品中的蛋白质变性，并由此从粪便样品中的常居肠细菌和除常 居肠细菌外的生物中溶出核酸的步骤；和(b)用于回收步骤(i)中溶出的核酸的步骤。
20.根据权利要求19所述的用于回收核酸的方法， 其进一步包括，在步骤(i)之后和步骤(ii)之前，(c)用于除去步骤(i)中变性的蛋白质的步骤。
21.根据权利要求19或20所述的用于回收核酸的方法，其中使用选自由离液序列高的盐、有机溶剂和表面活性剂组成的组中的至少一种物质 进行步骤(a)中的蛋白质的变性。
22.根据权利要求21所述的用于回收核酸的方法，其中所述有机溶剂为苯酚。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的用于回收核酸的方法，其中使用氯仿进行步 骤(c)中的变性蛋白质的除去。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的用于回收核酸的方法， 其中所述步骤(b)中的核酸的回收包括(bl)用于使步骤(a)中溶出的核酸吸附到无机基体的步骤；和 (b2)用于从所述无机基体溶出步骤(bl)中吸附的所述核酸的步骤。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的用于回收核酸的方法， 其进一步包括，在步骤(i)之前，(d)用于从所述粪便样品中回收固体成分的步骤。
26.一种用于分析核酸的方法，其包括利用通过使用权利要求17至25中任一项所述的用于回收核酸的方法从粪便样品中回 收的核酸，进行源自哺乳动物细胞的核酸的分析。
27.根据权利要求26所述的用于分析核酸的方法，其中所述哺乳动物细胞为消化道细胞。
28.根据权利要求27所述的用于分析核酸的方法，其中所述消化道细胞为从大肠脱落 的细胞。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的用于分析核酸的方法， 其中所述源自哺乳动物细胞的核酸为指示致瘤性转化的标记物。
30.根据权利要求26至28中任一项所述的用于分析核酸的方法，其中所述的源自哺乳动物细胞的核酸为指示炎症性胃肠疾病的标记物。
31.根据权利要求26所述的用于分析核酸的方法，其中所述分析是RNA分析和/或DNA 分析。
32.根据权利要求31所述的用于分析核酸的方法，其中所述RNA分析为RNA碱基的插入、缺失、置换、重复或倒置，或者剪接变体分析、 mRNA表达分析以及功能性RNA分析中的至少一种分析。
33.根据权利要求31所述的用于分析核酸的方法，其中所述DNA分析为突变分析和表观基因改变分析中的至少一种分析。
34.根据权利要求33所述的用于分析核酸的方法，其中突变分析是碱基插入、缺失、置 换、重复或倒置中的至少一种突变的分析。
35.根据权利要求33所述的用于分析核酸的方法，其中所述突变分析为K-ras基因的 突变分析。
36.根据权利要求33所述的用于分析核酸的方法，其中所述表观基因改变分析为DNA甲基化分析和DNA去甲基化分析中的至少一种分析。
全文摘要
本发明的目的是提供一种通过其可以制备粪便样品，而不需要任何复杂过程的方法，制备的粪便样品例如能将来自粪便的源自哺乳动物细胞如脱落的大肠细胞的核酸有效回收；上述方法采用的制备粪便样品用溶液和采集粪便用试剂盒；以及使用上述方法制备的粪便样品回收和分析粪便中的核酸的方法。更具体地，用于从粪便中有效回收核酸的粪便样品制备方法，其特征在于包括将采集的粪便与含有水溶性有机溶剂作为活性成分的制备粪便样品用溶液混合；上述方法采用制备粪便样品用溶液和粪便采集用试剂盒；回收核酸的方法，其特征在于包括从通过上述方法制备的粪便样品中同时回收源自消化道中常居细菌的核酸和源自消化道中除了常居细菌之外的生物的核酸；以及分析核酸的方法，其特征在于包括分析通过上述回收核酸的方法回收的核酸。
文档编号G01N33/48GK101952460SQ20088012486
公开日2011年1月19日 申请日期2008年11月19日 优先权日2007年11月20日
发明者谷上恭央, 长冈智纪 申请人:奥林巴斯株式会社