专利名称：一种人7号染色体计数探针的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明所涉及一种人7号染色体计数探针的制备方法，，还涉及利用人7号染色体 计数探针制备一种人7号染色体计数试剂盒，应用本发明的人7号染色体计数探针及相应 的试剂盒可以对人7号染色体进行准确、快速的计数。
背景技术：
人7号染色体上含有1亿5千8百万个碱基(约占整个人类基因组的5%)和 1455个基因，其中一些基因与孤独症、囊性纤维化、几种白血病和淋巴瘤有关。有大量研 究表明在许多恶性肿瘤中都有7号染色体三体性出现，如与肾癌相关[Brown JA，Anderl KL，Borell TJ，etc. Simultaneous chromosome 7 and 17 gain and sex chromosome loss provide evidence that renal metanephric adenoma is related to papillary renal cell careinoma. J Urol. 1997 Aug ； 158 (2) :370_4.]；与星状细胞瘤生存期密切相 关[Wessels PH，Twijnstra A，Kessels AG, etc.Gain of chromosome 7，as detected by in situ hybridization,strongly correlates with shorter survival in astrocytoma grade 2，Genes Chromosomes Cancer. 2002Mar ；33 (3) :279_84.]；在膀胱癌中多倍体发 生率大约为13.0% 76. 2% ；是淋巴瘤发展标志物，在B细胞淋巴瘤患者中发生频率 较高[Bernell P ； Jacobsson B ；Liliemark J ；Hjalmar V ；Arvidsson I ；Hast R，Gain of chromosome 7marks the progression from indolent to aggressive follicle centre lymphoma and is a common finding in patients with diffuse large B—cell lymphoma, British journal of haematology 1998 ；101 (3) :487_9L ]；在乳腺癌中 7 号 染色体多体性细胞数与淋巴结转移和进展密切相关，可以作为乳腺癌病人预后指标[Keizo Hirata, Yutaka Tagawa, Kiyotaka Kashima, etc. Frequency of Chromosome 7Gain in Human Breast Cancer Cells Correlation with the Number of Metastatic Lymph Nodes and Prognosis”. Tohoku J. Exp. Med.，Vol. 184，85-97 (1998)]，等等。因此进行该染色体 计数有重要意义。目前常用的染色体组型分析可以确定染色体的非整倍异常，但这需要进行细胞培 养和制备高质量的中期染色体片，而这对于肿瘤细胞来说是极其困难和耗时的。为了解决 这个技术难题，其中一个思路是筛选并制备相应的染色体计数探针，但目前染色体计数探 针制备缺乏一个系统和成熟的方法。本发明人在长期研究的基础上设计及筛选人7号染色体计数探针，并利用荧光原 位杂交技术检测中期或间期细胞中7号染色体数目。它应用荧光物质标记的双链DNA核酸 探针与染色体DNA互补序列杂交，在核中或染色体上显示DNA序列的位置。在此基础上本 发明人还开发人7号染色体计数试剂盒，该试剂盒具有快速、无创性、敏感度高和特异性强 等优点，无需进行细胞培养，就能够在中期和间期细胞中检测7号染色体的数量。由于本发明提供了这种7号染色体计数探针的制备方法，并在此基础上自主研制 开发7号染色体计数试剂盒，对摆脱对进口试剂的依赖，填补国内该检测领域的空白具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种人7号染色体计数探针的制备方法。根据本发明一个优选的实施方案人7号染色体计数探针的制备步骤包括(1)引物设计人7号染色体着丝粒区域PCR扩增引物设计和验证。(2)克隆质粒制备配制PCR反应体系，以人基因组为模板进行PCR扩增，将纯化 后的目的产物与载体PMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒PMD18-T-C7。(3)C7探针制备可采用以下两种方法进行制备。方法一以包含目的片段的质粒pMD18-T-C7DNA为模板，进行PCR扩增，通过PCR 反应将氨基修饰的dUTP掺入到目的产物中，然后经过PCR产物纯化、浓缩、定量；对纯化后 的PCR产物进行荧光标记、纯化、计算标记效率、定量，而获得C7探针，避光、-20°C储存。方法二 以包含目的片段的质粒PMD18-T-C7DNA为模板，使用荧光素标记的dUTP 直接进行PCR扩增，将PCR产物标记荧光，然后进行纯化、计算标记效率、定量，定量，而获得 C7探针，避光、-20°C储存。(4)C7探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。根据本发明一个优选的实施方案，设计的PCR扩增引物序列分别为上游引物 5，-AGCGATTTGAGGACAATTGC-3，和下游引物 5，-CCACCTGAAAATGCCACAGC-3，。根据本发明一个优选的实施方案，克隆质粒制备步骤和C7探针制备步骤中PCR扩 增条件均为为95°C 5分钟；(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒)X40循环；72°C 10分钟。根据本发明一个优选的实施方案，C7探针制备步骤中纯化可使用市售的DNA纯化 试剂盒，优选 Qiagen 公司的 MinElute PCR Purification Kit。根据本发明一个优选的实施方案，C7探针制备步骤中浓缩方法为乙醇沉淀浓缩。根据本发明一个优选的实施方案，C7探针制备步骤中PCR产物的定量是将PCR产 物稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。根据本发明一个优选的实施方案，C7探针制备步骤中PCR产物进行荧光标记使用 市售的DNA标记试剂盒，优选Invitrogen公司的ARES DNA Labeling Kit。根据本发明一个优选的实施方案，C7探针标记的荧光素包括活化的荧光染料和/ 或荧光素标记的dUTP，并优选Alexa Fluor系列、Spectrum dUTP。本发明的另一个目的是利用人7号染色体计数探针制备一种人7号染色体计数试 剂盒。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案(1)样本处理和制片按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。(2)杂交配制杂交液，主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行8 16 小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，对7号染色体进行计数。基于以上技术方案发明的试剂盒包括1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中 包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记的C7探针、未标记的竞争性DNA和H20配制成杂交液，其中每人份杂交液中使用C7探针的量为40 60ng，杂交 缓冲液为7ul，未标记的竞争性DNA为1. 5ug，用H20补至10ul。根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫 酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50% 70%，硫酸葡聚糖浓度为0. lg/ml。根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50 250ng DAPI 溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行 7号染色体计数。本发明与现有技术相比，具有下列优点(1)可以对人7号染色体进行准确、快速的计数、且结果重复性好；(2)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞7 号染色体计数，操作相对简单；(3)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学、产前诊断等领域的 应用，了解7号染色体与肿瘤发生等的联系。
图1显示人基因组PCR扩增产物电泳结果。目的产物340bp。图2显示人类正常分裂中期淋巴细胞7号染色体计数结果。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 人7号染色体计数探针的制备方法(1)引物设计和合成人7号染色体着丝粒区域PCR扩增引物设计和验证弓丨物对分另ij 为，F :5，-AGCGATTTGAGGACAATTGC-3，禾口 R: 5’ -CCACCTGAAAATGCCACAGC-3’，由中山大学达安基因股份有限公司合成。配制反应体系10X Buffer5ul
MgCl2(25mmol/L)2ul
人基因组DNA(5pg/ul)2ul
F(10umol/L)2ul
R(10umol/L)2ul
d3TPs(10mmol/L)lul
dTTP(lmmol/L)2ul
aa-dUTP(lmmol/L)16ulTaKaRa Taq Hot Start Version (5U/ul)0. 5ulH2017. 5ul总体积为50ul。使用ABI9700PCR仪或类似反应仪器，设置循环参数为95°C 5分 钟；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 45 秒)X40 循环；72°C 10 分钟。反应结束后，取5ul产物2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果在300bp左右具有明亮 的条带(参见附图1)。
(2)克隆质粒制备将纯化后的目的产物与载体pMDIS-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒 PMD18-T-C7。(3)C7探针制备C7F1克隆培养、DNA提取按照《分子克隆实验指南》所述经典方法，加有氨苄青 霉素的LB培养基中添加克隆质粒pMD18-T-C7的大肠杆菌菌种，37°C摇床中摇菌过夜；使用 TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 或类似试剂盒，按照说明书要求的 操作方法进行质粒DNA提取。计算0D260/0D280，要求结果在在1. 6 2. 2之间，计算质粒 DNA浓度。C7扩增以包含目的片段的质粒pMD18-T-C7DNA为模板，设置循环参数为95°C 5 分钟；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 45 秒)X40 循环；72°C 10 分钟。10 X Buffer5ulMgCl2(25mmol/L)2ulpMD18-T-C7 质粒 DNA(5pg/ul)2ulF(10umol/L)2ulR(10umol/L)2uld3TPs(10mmol/L)luldTTP(lmmol/L)2ulaa-dUTP(lmmol/L)16ulTaKaRa Taq HotStart Version (5U/ul) 0. 5ulH2017. 5ul总体积为50ul。通过PCR反应将氨基修饰的dUTP掺入到目的产物中，然后经过PCR产物纯 化、浓缩、定量后，稀释为lug/ul ；Pacific Blue标记采用Invitrogen的ARES Alexa Fluor 488DNALabeling Kit中的成份D(成分碳酸氢钠水溶液)，以及单独的Pacific Blue(20ug/ul)染料，按照说明书要求进行探针标记，活化的荧光素会与氨基修饰的dUTP 发生反应从而将产物标记荧光，尽量在干燥避光的环境下操作。按照说明书所述方法采用 Qiagen的MinElute PCR Purification Kit试剂盒进行纯化。分别测定260和416nm处 的吸收峰值，采用公式(660000 X0D416)/(0D260X 46000)计算荧光标记率，要求标记率在 1 9/100碱基范围内。按探针浓度(ng/ul) =0D260X50计算荧光探针浓度，避光、-20°C 储存。(4)C7探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证，包含中期或间期染色体DNA， 荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。实施例2 人7号染色体计数试剂盒制备以10人份/盒为例。(1)杂交液配制取少量C7探针稀释成40ng/ul，按下表配制杂交液
(2)DAPI复染剂配制抗褪色液全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，加入9ml甘油， 反复震荡混勻，调节PH为9.0，-20°C储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现 黄色或者橙色则需废弃并重新配制。用去离子水配制lmg/ml DAPI储存液。取2. 5ul的DAPI溶液(lmg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混 勻，-20°C避光密闭保存。(3)成品组装 实施例3 人7号染色体计数试剂盒的使用方法以人类正常分裂中期淋巴细胞为例。(1)人外周血培养及染色体制备采血用肝素润湿注射针筒(0. 2ml)后，常规取静脉血1 2ml，转动针筒混勻肝 素。接种(在超净工作台中无菌操作)在每个培养瓶中(含20%血清的1640培养液5ml， pH7. 2)，加入全血0.25 0.30ml (7号针头13 15滴)、PHA 5mg，盖紧胶塞，轻轻摇勻。培 养将培养瓶放在37°C恒温培养箱内培养72h。终止培养前2 4h，加入0. 01%秋水仙素 溶液(100 u g/ml) 1 2滴(7号针头)，使终浓度为0. 2 u g/ml培养液。轻轻摇勻后，放回 培养箱继续培养2 4h。收获将培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后lOOOr/min离 心8min，弃去上清。(2)样品处理低渗向离心管中加入37°C 0. O75mol/LKC1溶液至8ml，用吸管轻轻吹打混勻细 胞，置于37°C水浴箱温育15min。预固定向离心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液 1 2ml，用吸管轻轻吹打混勻后lOOOr/min离心8min，弃去上清。固定加入新配制的固 定液至8ml，室温静置30min。3000r/min离心8min，弃去上清。可再重复固定1次。制片 根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(0. 5 1ml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管 吸取少量细胞悬液，滴至载玻片上，镜检。(3)制片
取干净载玻片，重悬细胞后分别取3ul，10ul和30ul悬液滴加到载玻片上的不同 位置，注意不要重叠；室温下晾干；用20X物镜在相差显微镜下观察三个区域的细胞密度， 记录细胞没有明显重叠，且数量在100 200个以上所加的细胞悬液量；如果细胞密度及数 目合适，另取一张干净的载玻片，滴加适量的细胞悬液；如果滴加30ul悬液的区域仍然细 胞数目太少，另取30ul悬液重复滴到该区域，晾干，观察；如果滴加3ul悬液的区域仍然细 胞数目太多，用新鲜固定液稀释细胞悬液，重复步骤滴片观察。(4)玻片乙醇老化将热台加热到95度；取出盖玻片，擦干备用；一块折叠为方形的4 8层纱布，浸 透无水乙醇；在载玻片的杂交区域上各滴加160ul的无水乙醇；轻轻盖上24 X 24mm的盖玻 片，轻压紧；将载玻片置于95度预热的热台上，盖上浸透了无水乙醇的纱布(完全覆盖载玻 片)，再盖上事先准备好的方形盖子(完全覆盖载玻片)，计时2分钟；从热台上去除盖子、 纱布，取下载玻片，轻轻去除盖玻片，继续预处理步骤。(5)玻片预处理玻片放入37士 1°C的1XPBS中孵育5分钟，胃蛋白酶溶液中消化15分钟；1XPBS 室温洗涤3分钟；多聚甲醛/PBS室温固定10分钟；1XPBS室温洗涤3分钟；70%、85%、 100%梯度乙醇脱水各3分钟；室温晾干玻片；继续杂交过程。(6)样品和探针同时变性从试剂盒中取出杂交液，震荡混勻，瞬时离心；加8ul的杂交液到杂交区域，迅速 盖上盖玻片，轻压使杂交液均勻分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆 盖盖玻片与载玻片接触的边缘；78士 1°C的热台上变性2分钟30秒；将玻片放入预热的杂 交盒中，避光，37士 1°C孵育过夜(约16小时)；继续杂交后洗涤步骤。(7)杂交后洗涤及复染一般洗涤方法(推荐使用)取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻 片；将玻片放入37 士 1 °C的50 %甲酰胺/2 X SSC洗涤15分钟；再将其放入2 X SSC的染色缸 中，37 士 1°C洗涤15分钟；再将其放入盛有0. 1% NP40/2XSSC的染色缸中，37 士 1°C洗涤5 分钟；室温70%、85%、100%梯度乙醇依次脱水各3分钟；暗处晾干。快洗方法取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入 73 士 1°C的0. 3 % NP40/0. 4 X SSC中，洗涤2分钟；再将其放入0. 1 % NP40/2 X SSC中，室温 洗涤2分钟；室温70%、85%、100%梯度乙醇依次脱水各3分钟；暗处晾干。复染滴加10ul DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗 处存放，待观察。(8)结果分析在Olympus BX60荧光显微镜下，用WU、AQUA滤镜组分别观察DAPI复染的分裂相 和杂交的荧光信号，用C⑶照相记录。在40X物镜下寻找，在100X物镜下计数；调整合适 的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时， 要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到 信号点；记录观察的细胞总数和7号染色体数。(9)结果判定按处理方法要求进行操作，记录7号染色体数(参见附图2)。荧光原位杂交结果显示，中期染色体上可见两个信号点，未见其它荧光信号；间期细胞核中仅见两个信号点， 未见其它荧光信号。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120> 一种人7号染色体计数探针的制备方法及其应用<140><141><160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>1agcgatttgaggacaattgc<210>2
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>2ccacctgaaaatgccacagc
权利要求
一种人7号染色体计数探针的制备方法，其特征在于制备步骤包括(1)引物设计人7号染色体着丝粒区域PCR扩增引物设计和验证；(2)克隆质粒制备配制PCR反应体系，以人基因组为模板进行PCR扩增，将纯化后的目的产物与载体pMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒pMD18-T-C7；(3)C7探针制备可采用以下两种方法进行制备方法一以包含目的片段的质粒pMD18-T-C7DNA为模板，进行PCR扩增，通过PCR反应将氨基修饰的dUTP掺入到目的产物中，然后经过PCR产物纯化、浓缩、定量；对纯化后的PCR产物进行荧光标记、纯化、计算标记效率、定量，而获得C7探针，避光、-20℃储存；方法二以包含目的片段的质粒pMD18-T-C7DNA为模板，使用荧光素标记的dUTP直接进行PCR扩增，将PCR产物标记荧光，然后进行纯化、计算标记效率、定量，定量，而获得C7探针，避光、-20℃储存；(4)C7探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。
2.根据权利要求1的方法，其特征还在于其中PCR扩增引物序列分别为上游引物 5，-AGCGATTTGAGGACAATTGC-3，和下游引物 5，-CCACCTGAAAATGCCACAGC-3，。
3.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆质粒制备步骤和C7探针制备步骤中PCR 扩增条件均为为95°C 5分钟；(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒)X40循环；72°C 10分 钟。
4.根据权利要求1的方法，其特征还在于其中C7探针标记的荧光素包括活化的荧光染 料和/或荧光素标记的dUTP。
5.一种人7号染色体计数试剂盒，包括1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包 装这些试剂瓶或管的包装盒，其中杂交液由杂交缓冲液、荧光标记的C7探针、未标记的竞 争性DNA和H20配制而成，其特征在于每人份杂交液中使用C7探针的量为40 60ng，杂交 缓冲液为7ul，未标记的竞争性DNA为1.5ug。
6.根据权利要求5的试剂盒，其特征还在于杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度为50% 70%。
全文摘要
本发明所涉及一种人7号染色体计数探针的制备方法，还涉及利用人7号染色体计数探针制备一种人7号染色体计数试剂盒，应用本发明的人7号染色体计数探针及相应的试剂盒可以对人7号染色体进行准确、快速的计数。
文档编号G01N21/64GK101886102SQ200910039408
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者何瑰, 李明, 陈娟 申请人:中山大学达安基因股份有限公司