专利名称：基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术的制作方法
技术领域：
本发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，具体是指末端有 机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析。
背景技术：
有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的
快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具
有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离
子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术灵敏度不高、可靠性
差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于单链核酸外切酶 末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，它可实现多目标同时检测， 并且操作简便、快速、灵敏。
本发明的技术方案是，所述基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相 互作用的生物传感技术为利用末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白相互作用后 的核酸外切酶I的保护分析，通过被保护的单链寡核苷酸探针的定量分析来检测小分子与蛋 白的相互作用以及小分子或其结合蛋白。
以下对本发明做出进一步说明。
所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分 析为
对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是取所述有机小分子修饰寡核苷酸 DNA单链的储备液置于微量管中；再于微量管中加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；然后 加入核酸外切酶I反应，得末端保护反应的产物；
对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤取所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA 单链的储备液置于微量管中；再加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入小分子结 合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保护反应的产物；本发明中，末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链可以经现有的交联反应技术实现。 例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥
珀酰亚胺交联反应技术与3'端NH2标记的寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机 小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与 与3'端标记有巯基的寡核苷酸DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。
进一步地，本发明中，末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核 酸外切酶I保护分析为
对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是取5ul所述有机小分子修饰寡核 苷酸DNA单链的储备液置于微量管中，加入1.5ul IOX核酸外切酶I反应缓冲溶液，该缓 冲溶液为67 mM Glycine-K0H, 6. 7 mM MgCL2， 10 mM 2-巯基乙醇pH 9.5;再于微量管中 加入8yl包含小分子结合蛋白的样品溶液，在37。C恒温反应0. 5h;然后加入0.5p1核酸 外切酶I，置于37'C反应5分钟；之后升温至8(TC反应20分钟，进行热灭活以终止酶反应， 得末端保护反应的产物。
对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤取5 !i 1所述有机小分子修饰寡核苷
酸DNA单链的储备液置于微量管中，加入1.5ul IOX核酸外切酶I反应缓冲溶液，该缓冲 溶液为67 mM Glycine-KOH, 6. 7 mM MgCL2， 10 mM 2-巯基乙醇pH 9. 5;再加入5u 1包 含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆 抗体溶液3w 1，该单克隆抗体溶液终当量浓度为加入的有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链 的储备液浓度的5倍；在37'C恒温反应0. 5小时；再加入0. 5u 1核酸外切酶I ，置于37 ""C反应5分钟后，升温至8(TC反应20分钟进行热灭活以终止酶反应，得末端保护反应的产 物。
注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比 例或试剂加入顺序可使有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的保护效率在5% 100%内变化。
本发明中，所述末端保护的寡核苷酸DNA单链的定量检测可釆用现有的各种核酸定量分 析技术进行，如印迹法、夹心式杂交酶标检测、基因芯片或定量聚合酶链反应(PCR)法进 行检测。以下为采用定量聚合酶链反应(PCR)法对末端保护的寡核苷酸DNA单链实施定量
检测的步骤
a. 根据定量聚合酶链反应法检测的标准程序，针对寡核苷酸DNA单链设计出前向引物
与反向引物，即引物对；
b. 取所述末端保护反应的产物lyL于定量聚合酶链反应试管中，加入适量的所述引物对及定量聚合酶链反应试剂混合物，使最终体积为25uL;定量聚合酶链反应试剂混合物为0. Ill Taq polymerase/ii L, 500 dNTP each, 20mM Tris-HCL, 3mM MgCL2, 1:103稀释的SY服-Green I;
c. 将定量聚合酶链反应试管放入定量聚合酶链反应仪中，94"C变性15秒后经历如下40个循环检测62。C退火延伸30秒，94 'C变性解链5秒；实时记录荧光值，并根据一定阈值确定样品对应的循环数Ct.
d. 根据标准曲线与待测样品对应的Ct值计算待测样品中分析物的量(标准曲线根据已
知浓度的分析物样品按上述步骤绘制)。
本发明利用单链寡核苷酸探针末端修饰的小分子和其结合蛋白或抗体的特异性结合，基
于所发现的核酸外切酶末端保护作用，通过被保护的单链寡核苷酸探针的定量分析来检测小分子与蛋白的相互作用以及小分子或其结合蛋白，即本发明所述方法可直接用于小分子结合蛋白的检测，也可通过样品溶液中小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA单链竞争与抗体结合间接检测有机小分子。该方法对DNA序列没有依赖性，可针对不同小分子设计不同寡核苷酸序列，可实现多目标同时检测，并且操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，可望成为生物医学中信号传导与分子调控机理研究、临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境毒物检测、食品与农产品安全检测的通用技术。
具体实施例方式
实施例l:基于核酸外切酶末端保护分析检测生物素1)3'端NH2标记的寡核苷酸DNA单链和生物素(biotin)的交联称取6. lmg的生物素溶于2. 5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1 M NaH2P04， pH 7.4)，再加入lmg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2. 8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260u 1活化后的生物素溶液加入到260 y 1浓度为lyM的3，端NH2标记的寡核苷酸DNA单链(序列为TTA CAT CGC CCT TGG ACT ACG ACTGAA ACC GCT TTG CCT GAT CGC TAA ACT AAA GTC CGT TAC CTT GAT TCC CTT)的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3. 6mg盐酸羟胺终止反应。
把交联反应产物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0. 1 M NaH2P04， pH 7. 4)中在4'C透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-2(TC的冰箱中备用。上述的-2(TC保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4'C冰箱中作为次级储备液备用。
2)生物素的检测
取5ul上述生物素标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中，加入1.5yl的IOX核酸外切酶I反应缓冲溶液(67 mM Glycine-K0H， 6. 7 mM MgCL2， 10 mM 2-巯基乙醇pH9. 5),再加入1待检测的生物素样品溶液，混合均匀后加入1浓度为640nM的链霉亲和素(str印tavidin)，室温反应15min，反应后加入0. 5u 1核酸外切酶I (NEB公司产品)在37'C酶切5min后，升温至8(TC反应20min进行热灭活以终止酶反应。
取上述酶切产物1 " L加入到PCR管中，加入PCR引物(前向引物ACATCGCCCTTGGACTACG;反向引物GGGAATCAAGGTAACGGACTTTAG)和定量PCR试剂混合物(0. 1U Taq polymerase/UL， 500 yM dNTP each, 20mM Tris-HCL， 3mM MgCL2. 1:103稀释的SYBR-Green 1)，使最终体积为25nL。 PCR管放入PCR仪中。94'C变性15s后经历如下40个循环62。C退火延伸30s， 94 T变性解链5s。实时记录荧光值，并根据一定阈值确定样品对应的循环数Ct。则根据如下标准曲线即可测定待测样品溶液中生物素浓度。
按上述l)、 2)步骤对9个配制的生物素标准溶液(浓度从1(T5M到1(TM每隔一个数量级一个)进行检测，记录各标准溶液样品的Ct值，用Ct值对标准溶液中生物素浓度作图获得标准曲线。
实施例2:基于核酸外切酶端点保护分析检测叶酸结合蛋白
1) 3'端NH2标记的寡核苷酸DNA单链和叶酸的交联
称取lOmg的叶酸溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1 M NaH2P04， pH 7.4)，再加入lmg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260 u 1活化后的叶酸溶液加入到260u 1浓度为1 u M的3，端NH2标记的寡核苷酸DNA单链(序列TTA CAT CGC CCT TGG ACT ACG ACT GAA ACC GCTTTG CCT GAT CGC TAA ACT AAA GTC CGT TAC CTT GAT TCC CTT)的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7. 4,在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3. 6mg盐酸羟胺终止反应。
把交联反应产物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1 M NaH2P04， pH 7. 4)中在4。C透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-2(TC的冰箱中备用。上述的-2(TC保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4'C冰箱中作为次级储备液备用。以上所有的反应均在遮光的条件下进行。2)叶酸结合蛋白的检测取5 u 1上述叶酸标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中，加入1. 5 p 1的10X核酸外切酶I反应缓冲溶液(67 mM Glycine-K0H， 6. 7 mM MgCL2， 10 mM 2-巯基乙醇PH9.5)，再加入5ul待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，室温反应15min,反应后加入0.5ul核酸外切酶I (NEB公司产品)在37。C酶切5min后，升温至8(TC反应20min进行热灭活以终止酶反应。
取上述酶切产物1 p L加入到PCR管中，加入PCR引物(前向引物:ACATCGCCCTTGGACTACG;反向引物GGGAATCAAGGTAACGGACTTTAG)和定量PCR试剂混合物(0. 1U Taq polymerase/uL， 500uM dNTP each, 20mM Tris-HCL, 3mM MgCL2, 1:103稀释的SYBR-Green 1)，使最终体积为25 u L。 PCR管放入PCR仪中。94匸变性15s后经历如下40个循环62t)退火延伸30s， 94 i:变性解链5s。实时记录荧光值，并根据一定阈值确定样品对应的循环数Ct。
则根据如下标准曲线即可测定待测样品溶液中叶酸结合蛋白浓度。
按上述l)、 2)步骤对7个配制的叶酸结合蛋白标准溶液(浓度从10"M到1(T M每隔一个数量级一个)进行检测，记录各标准溶液样品的Ct值，用Ct值对标准溶液中叶酸结合蛋白浓度作图获得标准曲线。
权利要求
1、一种基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，其特征是，该技术为利用末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白相互作用后的核酸外切酶I的保护分析，通过被保护的单链寡核苷酸探针的定量分析来检测小分子与蛋白的相互作用以及小分子或其结合蛋白。
2、根据权利要求1所述基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相 互作用的生物传感技术，其特征是，所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋 白的相互作用及核酸外切酶I保护分析为对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是取所述有机小分子修饰寡核苷 酸DNA单链的储备液置于微量管中；再于微量管中加入包含小分子结合蛋白的样品溶液; 然后加入核酸外切酶I反应，得末端保护反应的产物；对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤取所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中；再加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入小 分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保护反应的产物。
全文摘要
本发明公开了一种基于单链核酸外切酶末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，即利用末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白相互作用后的核酸外切酶I的保护分析，通过被保护的单链寡核苷酸探针的定量分析来检测小分子与蛋白的相互作用以及小分子或其结合蛋白。该方法灵敏度高、操作简便、特异性强，可望成为一种用于生物医学中信号转导与分子调控机理研究、食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选的通用技术。
文档编号G01N33/566GK101533027SQ200910043129
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者俞汝勤, 战 吴, 霞 楚, 沈国励, 蒋健晖 申请人:湖南大学