专利名称：：抗心磷脂抗体检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗心磷脂抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：抗心磷脂抗体(ACL)属于是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体。常见于系统性红斑狼疮(SLE)及其他自身免疫性疾病。该抗体与血栓形成、血小板、自然流产或宫内死胎关系密切。研究证实，许多因素与ACA产生密切相关，常见的原因有(1)自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)的硬皮病等；(2)病毒感染如腺病毒、风疹病毒、水痏病毒、腮腺炎病毒等感染；(3)其它疾病如支原体系统疾病等；(4)口服某些药物如氯丙嗪、吩噻嗪等；心磷脂是pangbom1941年从牛的心肌中分离出来的一种具有抗原性的磷脂，并加以命名，其在哺乳动物肌中含量最高，每个心磷脂分子包含4个不饱和的脂肪酸，极易氧化。ACA是与心磷脂分子中带负电荷的磷酸二酯基团结合，但这种结合必须要有心磷脂分子中的甘油酯部分，如果以节环取代引甘油酯部分，心磷脂的抗原性则消失。ACA分子中的脂肪酸部分为其抗原性的必需成分；ACA与其它分子中带负荷的磷酸二酯基团并不结合，而只与磷脂分子中的该成分起反应。近年Hotkko等研究发现，ACA仅与己氧化的心磷脂结合，而并不能与进行氧化的还原性的心磷脂类似物结合。自1983年Harris等建立了测ACA(抗心磷脂抗体)的方法以来，有关该抗体的研究在世界范围内得到广泛重视并迅速发展。Koike认为心磷脂与ACA的IgG结合需ACA的辅因子卩2糖蛋白I(P2—GPI)的存在;。Harris建立的ACA向相放射免疫法(RLA)所检出的ACA现认为是针对心磷脂与P2—GPI的复合体该法具有较高的敏感性，以后经Loizou等改良成与放射免疫法效果相同而更为方便的ELISA法。目前现有检测抗心磷脂抗体的方法有金标和化学发光检测抗体，只能作简单的定性，而化学发光法需用专门的专用仪器，而对于血清中游离抗体的检测现大多用酶联免疫吸附法(ELISA)，这种方法的特异性和敏感性均较高且无须特殊仪器，既可定性又可定量，可检测抗体类及亚类，易于标准化，具有操作简单、结果正确、省时等优点，现已被医院普遍所采用，成为定量测定ACA的世界性标准。心磷脂抗体ELISA检测试剂盒定量检测ACA结果的可靠性直接与其质量相关，如何保证ELISA抗心磷脂抗体检测试剂盒中试剂的特异性和灵敏度，提高试剂的稳定性，排除非特异性干扰因子的干扰成为进一步提高ELISA抗心磷脂抗体检测试剂盒质量的主要研究方向。
发明内容本发明的目的是提供一种心磷脂抗体检测试剂盒及其制备方法与使用，本发明提供的试剂盒特异性与灵敏度高，试剂稳定性好，可定性与定量检测ACA，为临床诊断提供强有力的可靠检测依据。本发明的抗心磷脂抗体检测试剂盒包括(1)、用ACA抗原包被的预包被酶联板；(2)、用酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体溶液；(3)、洗涤液；(4)、样品稀释液；(5)、阴性对照；(6)、阳性对照；(7)、显色液；(8)、终止液。本发明的试剂盒采用间接法来检测心磷脂抗体，将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原；加受检标本，标本中的抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物；在待测抗体与特异性抗原结合后，将酶标抗体进一步与之反应，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗体的量相关；固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗体的量。试剂盒中的ACA抗原为由牛心中提取的心磷脂抗原，纯度需达到质量百分比98%以上。试剂盒中的IgG酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体，IgG抗体可以是各种类型的IgG抗体，如鼠抗人IgG、羊抗人IgG或兔抗人IgG。酶标抗体原液用酶标抗体稀释液稀释的重量比例为1:4000-1:5000。为了使得试剂盒具有更佳的特异性与灵敏度，本发明在酶标抗体稀释液上进行了改进，本发明的酶标抗体稀释液包括下列组分C6H1G04《P04)2'HNa、Na2HP04、NaCl和NaH2P04，且上述各物质的总浓度为2—9g/L，溶液的pH值为7.2—7.6。5较佳的，各组分的浓度为:C6Hl0O4-(PO4)2-HNa0.5-3g/LNa2HP040.5-3g/LNaCl0.1-3g/LNaH2P040.05-2g/L上述酶标抗体稀释液的溶剂为水。本发明中，洗涤液可采用常规的ELISA洗涤液，如含有吐温的磷酸盐缓冲液；样品稀释液也可采用常规的ELISA样品稀释液，如含有磷酸盐缓冲液的样品稀释液；阴性对照为正常人血清；阳性对照为含有ACA抗体的人血清；显色液可采用常规的ELISA显色液，如含有过氧化氢的显色液和/或含有四甲基联苯胺的显色液等。本发明的试剂盒中除包括上述物质外，还可包括常规ELISA测试时所需要的试剂、工具或容器，如蒸馏水或去离子水、洗液滴瓶或试管等。本发明还进一步公开了的抗心磷脂抗体检测试剂盒的制备方法，其中ACA抗原包被的预包被酶联板的制备包括下列步骤A.ACA抗原包被酶联板；B.封闭液封闭。ACA抗原包被酶联板采用常规的包被方式制备，并经封闭液封闭。为进一步提高试剂盒的灵敏度与特异性，本发明还对封闭液进行了改进，改进的封闭液包括下列组分Tirs、BSA、NaN3和胶原蛋白，且上述各物质的总浓度为4一10g/L。较佳的，上述封闭液中，各组分的浓度为Tirs0.5—3gZLBSA0.5—5g/LNaN30.001—1.5g/L胶原蛋白0.5—5g/L上述封闭液的溶剂为水。本发明的抗心磷脂抗体检测试剂盒的使用包括如下步骤a、加样取用ACA抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔和阳性对照孔，在各孔先加样品稀释液，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照和样品，混匀，置37"C温育15-30分钟；b、洗板弃取各孔内液体，采用洗涤液洗涤加样孔；c、加酶在各孔加酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体溶液，空白对照孔不加，置37'C温育15-30分钟；d、洗板弃取各孔内液体，采用洗涤液洗涤加样孔；e、显色依次在各孔加显色剂，混匀，置室温18。C-25°C，10-15分钟；f、终止；依次在各孔加终止液，混匀；g、测定用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的吸光度值(OD值)。如定性检测样本中的抗心磷脂抗体，可根据测定OD值与Cutoff值(阴性对照平均吸光度(OD值)+3SD)的比较，得知血清样本抗心磷脂抗体为阴性还是阳性。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度。在这种半定量测定中，将标本作一系例稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度，根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，通过实验求出P/N的阈值。试验证实，本发明的抗心磷脂抗体检测试剂盒特异性与灵敏度高，试剂盒稳定性好，可用于定性与定量检测ACA。具体实施例方式以下列举具体实施例以进一步说明本发明，应理解实施例并非用于限制本发明的保护范围。实施例1试剂盒的制备1.心磷脂抗原(来源Sigma公司)，经薄层层析和高效液相色谱分析比较，其RF值和峰形与标准品心磷脂符合一致，纯度〉98%。心磷脂抗原的保存将纯度己鉴定符合标准的心磷脂抗原置-20。C保存备用。2.用心磷脂抗原包被的预包被酶联板的制备2.1包被将步骤1制得的心磷脂抗原至碳酸盐缓冲液(pH9.6，Na2C031.6g/L，NaHC03H203.2g/L酉己方)中混匀，加至酶联板孔内，每孔100微升，孵育过夜，用含有吐温的磷酸盐缓冲液(20X，Nacl85g/L,T-200.5ml/L,配方)洗涤酶联板，完成用ACA抗原包被的预包被酶联板的制备；2.2封闭将预包被酶联板每孔加封闭液150微升，孵育过夜，弃封闭液，吹干。采用下表配方中所列封闭液封闭配方1#(g/L)2#(g/L)3#(g/L)4#(g/L)Tirs1.830.50.9BSA(牛血清白蛋白)2.00.551NaN30,00110.51.5胶原蛋白2.050.51对比封闭液l:5%脱脂奶粉对不同封闭液的比较(只改变封闭液配方，其它试剂及检测方法均相同)选择相同血清的标本，以1:100稀释，采用不同的封闭液包被的板条进行对比检测；比较其阳性标本、阴性标本、空白孔的吸光度值(OD值)的差异；阳性标本1阳性标本2阴性标本1阴性标本2空白孔l空白孔21#封闭液1.2351.2310.0480.0420.0320.028均值1,2330.0450.030对比封闭液10.9581.0210.1190.1240.0920.088均值1,0030.1220細通过实验结果数据显示:本发明封闭液空白孔的平均OD值0.03，而对比封闭液1空白孔的平均OD值0.09要高出3倍，而且本发明封闭液阳性标本的OD值更高，阴性标本的OD值更低，这些进一步说明本发明的封闭液能有效抑制非特异性结合，确保检测试剂的准确性。此外，本试剂盒中的封闭液还可防止细菌的滋生；有效的延长预包被板的使用和保存时间。3.酶标抗体稀释液的配制采用下列配方配制酶标抗体稀释液，溶液的pH值为7.2—7.6:配方5#(g/L)6#(g/L)7#(g/L)8#(g/L)C6H10O4.(PO4)2.HNa20.50.73Na2HP041.20.52.2NaCl0.50.11NaH2P040.220.050.4与常规酶标抗体稀释液的比较:对比酶标抗体稀释液1配方pH7.4;Na2HP04.12H20*2.9g/L;NaCL2g/L克；KCL0.2g/L8KH2P040.2g/L;NaN30.2g/L两种不同稀释液对酶标抗体的活力比较(只改变稀释液配方，其它试剂及检测方法均相同)选择相同血清的标本，以1:100稀释，比较其吸光度值(OD值)结果显示本发明试剂盒的酶标抗体稀释液大大提高了酶活性的释放，提高了酶的作用力。5#酶标抗体稀释液1:5001:10001:20001:30001:40001:50001:60001:70001:8000阳性血清1:1001.2250.9730.8110.5840.4230.2420.1100.0850.030阴性血清1:1000.2100.1540.0830,0560.0590.0480.0330.0050.009对比酶结合物稀释液1阳性血清1:1000.3580.2980.1070.0430細0細0細0細0細阴性血清1:1000.1270.0980.0300.000o細0.000o細0細0細由上表可见，普通酶标抗体稀释液在l:4000以上就无法检测出OD值了，但采用本发明试剂盒的酶标抗体稀释液在l:4000时还能达到0.4以上，也就是说，采用本发明试剂盒的酶标抗体稀释液可以提高酶的作用力，要获得同样的OD值，需要的酶量要少得多，也可以进一步的节约原料成本，在同样酶量的情况下，灵敏度更高。取鼠抗人IgG酶标抗体,用酶标抗体稀释液l:4500稀释，封装。4.其它组份的制备洗涤液为含有吐温的磷酸盐缓冲液，配方NaC1170克;T-2010ml;H2O1000ml，显色液配方底物A:Na2HP04.12H2018.5g/L;柠檬酸5g/L;H202;l.ml/L;底物B:TMB0.2g/L;柠檬酸lg/L;EDTA0.15g/L终止液为2M硫酸样品稀释液10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA阴性对照含有〈0.1。/。NaN3的阴性人血清。阳性对照含有〈0.1。/。NaN3的人抗-心磷脂血清。上述各溶液分别封装，与酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体及酶联板组配制得试剂盒。实施例2ACA的定性检测采用下列方法使用实施例1制备的试剂盒a、加样取用ACA抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照？L、阴性血清对照孔、在各孔先加样品稀释液100微升，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照孔、和样品各100微升，混匀，贴上不干胶条，置37'C温育30分钟；b、洗板弃取各孔内液体，将洗涤液用蒸馏水稀释20倍后，注满各孔，静置30秒，甩9掉洗涤液，重复洗板，最后拍干；c、加酶加用酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体100微升，空白对照孔不加，贴上不干胶条，置37'C温育30分钟；d、洗板方法同be、显色依次在各孔加显色剂A液、B液各50微升，混匀，置室温；f、终止；依次在各孔加50微升终止液，混匀；g、测定用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的吸光度值(OD值)；根据对500个正常人的血样进行检测的结果Cutoff值=阴性对照平均0D值X2.1，血清样本的与阴性对照0D值的比值》2.1为阳性(+);血清样本的与阴性对照0D值的比值〈2.1为阴性(-)。将实施例1的试剂盒(5#酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体及1#封闭液封闭的酶联板)用于检测504个正常人与204个经临床方法确认ACA为阳性的患者，测定结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>采用SPSS统计软件结果分析敏感性200/204=98%特异性500/504=99.2%正确率(200+500)/708=98.87%实施例3试剂盒稳定性试验试剂盒的稳定性实验，选择五批不同批次，每批次2盒作稳定性试验，其中将2批次试剂盒置于37。C-3天，三批次置于4。C-6个月避光保存表一、试剂盒的物理性能检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>合合合合合合合合合合样品稀释液蓝色透明液体符符符符符符符符符符合合合合合合合合合合阳性对照淡黄色透明液体符符符符符符符符符符合合合合合合合合合合阴性对照淡黄色透明液体符符符符符符符符符符合合合合合合合合合合IgG酶标抗体淡红色透明液体符符符符符符竹付符符符合合合合合合合合合底物A无色透明液体符符符符符符符符符符合合合合合合合合pi合底物B无色透明液体符符符符符符竹付符符辨付合合合合合合合合合合浓縮洗涤液(20X)白色透明液体符符符符符符符符符符合合合合合合合合合合终止液无色透明液体竹付符符符符竹付符符符符合合合合合合合合合合表二、主要性能指标检测结果检测项目检测结果(五批次10个试剂盒)空白OD值0,0190.0180,0190.0210.0200.0170.0190.0220.0230.019均数0.0197阴性对照0.0920.0850.0910.0880.0800.0780.0820.0890.0780.087均数0.085阳性对照0.9811.3401.5601.2311.1881.3130.9731.0120.9820.975均数1.156S/N》310.6615.7617.1413.9914.8516.8311.3411.3812.5911.21均数13.575阴性符合率100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%均数100%阳性符合率丽o100%画100%100%100%100%100%100%100%均数100%分析内<15%6.2%13.0%4.1%2.6%7.3%5.8%9.4%6.6%4.2%7.8%均数6.7%实施例4试剂盒分析灵敏度的确定(阈值的确定)定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出、"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度。在这种半定量测定中，11将标本作一系例稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度，根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，通过实验求出P/N的阈值。一.材料(1)同实施例2的试剂盒(2)阳性血清样品来自临床典型患者血清样品。二.检定程序按实施例2的方法1)将血清样品稀释液从1:10开始做对倍稀释至1:2560，每个稀释度做2孔，每孔加样100ul，同时做阳性，阴性对照各2孔，空白孔1孑L，37。C温育30分钟，洗板4次。2)每孔滴加酶结合物(HRP-抗人IgGMcAb)2滴(100ul),37。C温育30分钟，洗板4次。3)每孔滴加底物A、B各l滴(50ul)37'C温育15分钟，每孔滴加终止液1滴(50ul)。4)酶标仪波长450nm处测OD值。.5)结果判定P/N>2.1，判为阳性(N<0.1，按O.l计算，>0.l按实际值计算)。(阳性样品孔OD值/阴性对照孔OD值〉2.1，判为阳性)结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>四、结论:血清稀释至l:1280时，OD值为0.226，大于0.21为阳性，即试剂盒的灵敏度可达1:1280，典型患者血清0.008ul便可测出IgG抗体为阳性。权利要求1.一种抗心磷脂抗体检测试剂盒，包括(a)、用ACA抗原包被的预包被酶联板；(b)、用酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体溶液；(c)、洗涤液；(d)、样品稀释液；(e)、阴性对照；(f)、阳性对照；(g)、显色液；(h)、终止液。2.如权利要求1所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述ACA抗原为心磷脂抗原，纯度达到质量百分比98%以上。3.如权利要求1所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述IgG酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的IgG抗体。4.如权利要求1所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述用酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体溶液中，IgG酶标抗体与酶标抗体稀释液的重量比例为1:4000-1:5000。5.如权利要求1所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体稀释液包括下列组分C6H1()CV(P04)2'HNa、Na2HP04、NaCl和NaH2P04，且上述各组分的总浓度为2—9g/L。6.如权利要求5所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述各组分的浓度为C6H10O4-(PO4)2-HNa0.5-3g/LNa2HP040.5-3g/LNaCl0.1-3g/LNaH2P040.05-2g/L酶标抗体稀释液的溶剂为水。7.如权利要求1所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述ACA抗原包被的预包被酶联板由包括下列步骤的制备方法制得A.ACA抗原包被酶联板；B.封闭液封闭。8.如权利要求7所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述步骤B中的封闭液包括下列组分Tirs、BSA、NaN3和胶原蛋白，且上述各组分的总浓度为4一10g/L。9.如权利要求7所述抗心磷脂抗体检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液中，各组分的浓度为Tirs0.5—3g/LBSA0.5—5g/LNaN30週一1.5g/L胶原蛋白0.5_5g/L封闭液的溶剂为水。10.如权利要求l一9中任一权利要求所述抗心磷脂抗体检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤a、加样取用ACA抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔和阳性对照孔，在各孔先加样品稀释液，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照和样品，混匀，置37'C温育15-30分钟；b、洗板弃取各孔内液体，采用洗涤液洗涤加样孔；c、加酶在各孔加酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体，空白对照孔不加，置37'C温育15-30分钟；d、洗板弃取各孔内液体，采用洗涤液洗涤加样孔；e、显色依次在各孔加显色液，混匀，置室温18。C-25°C,10-15分钟；f、终止；依次在各孔加终止液，混匀；g、测定用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的吸光度值。全文摘要本发明涉及一种抗心磷脂抗体检测试剂盒及其应用，本发明的抗心磷脂抗体检测试剂盒，包括用ACA抗原包被的预包被酶联板；用酶标抗体稀释液稀释的IgG酶标抗体溶液；洗涤液；样品稀释液；阴性对照；阳性对照；显色液；终止液。本发明提供的试剂盒特异性与灵敏度高，试剂稳定性好，可为临床诊断提供强有力的可靠检测依据。文档编号G01N33/53GK101498715SQ200910047379公开日2009年8月5日申请日期2009年3月11日优先权日2009年3月11日发明者崔贻芬申请人:上海尧浩生物技术有限公司