专利名称：一种新的检测血清样本中鼠疫抗体的方法和产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的检测血清样本中鼠疫抗体的定量检测方法和产品及其 制备方法。
背景技术：
鼠疫耶尔森菌(rem'm'a pesto)属于耶尔森菌属(yem7w),是引起烈性传染病 鼠疫(Plague)的病原菌。鼠疫是一种病情凶险的传染病，传染性强，致死率为30% 至100%,鼠疫的潜伏期大约是2至7天，各型的初期症状有发高烧、剧烈头痛、 呕吐、脸部潮红、眼红、皮肤有出血点、意识模糊、四肢剧痛、局部'淋巴结肿
大等等:'"、''-''': ',、 .'.'n,
原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竟争法、间4妻法等。
间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待4企血清中的相
应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结
合形成酶标记抗体-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。
悬浮芯片(suspension array)^称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex
公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞
仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已
广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分 析等领域。
目前发展的悬浮芯片主要是基于细胞因子的检测。但是悬浮芯片是否能够 检测人血清中的鼠疫抗体，尚缺乏模型和评价。
发明内容
本发明涉及一种新的检测血清中鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包括 编码微球，作为包被微球抗原的鼠疫Fl抗原，生物素标记的羊抗兔IgG和羊抗 人IgG作为检测抗体，链亲和素-藻红蛋白和适宜的緩冲溶液。本发明提供上述检测鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，其特征在于， 在相关缓冲溶液中，编码微球用鼠疫Fl抗原包被、用生物素标记的片全测抗体为
羊抗兔IgG、羊抗人IgG、用链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)作为信号检测物。
本发明提供一种鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法，该方法采用间接 法检测抗体的免疫学^r测原理，其特征在于，在检测过程中所有反应可在96孔 滤板上或在微量离心管中进行，其中包括下列步骤(1 )每孔或管中加入含有 已包被捕获抗原，即鼠疫Fl抗原包被的编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；
(2) 加入待测血清样品，聘育后清洗；(3)加入生物素化的4全测抗体，孵育 后清洗；(4)加入链亲和素-藻红蛋白(SA-PE),孵育后清洗，(5)加入枱r 测緩沖液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取MFI数值(即平均焚光强度)并分 析数据判定检测结果阴性或阳性。
本发明还提供一种检测血清样品中鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方 法，其特征在于，该方法包括下列步骤(1)加入的阳性检测样品或标准品经 4倍梯度倍比系列稀释，(2)制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应标准曲线，
(3) 用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(4)根据剂量-反应曲线可判断动 态检测范围、未知浓度样品可根据剂量-反应方程计算出检测样品的浓度，还可 判定方法的^:测限。
悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不 同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特 的色彩编号，每颗微球大小约5.6|im，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、 酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸 探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后， 利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通 过检测通道。检测通道中设有两道激光， 一道为红色，激发微球基质中的颜色， 识别微球分类编码以确定检测项目； 一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录 信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时， 两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有撰L球中 的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的《鼓 球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本 中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利 用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确 性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。
本发明人经过大量和深入的研究，对鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检
测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点
1、 抗原包被量的改进
鼠疫Fl抗原的包被量是成功检测的关键，本发明对包被微球的抗原包被量
进行实质性优化使血清样本的检测效杲非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗
原包被量很低，本发明的抗原包被量为3-9pg /1.25x 106个微球，即 6-36ng/2500-5000个微球/测试，而一般的ELISA方法中包被量为5pg/孔/测试。
2、 生物素标记的改进
通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量 的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗体连接，清洗时#皮4由 滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶 尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此本申请生物素标记抗体 后，尽量去除多余的生物素。以标记2 mg/mL的IgG (分子量150,000) 1 mL溶 液为例，需加入10mM生物素溶液约27 )iL。
3 、 检测的灵敏度及动态范围
本发明的血清样品鼠疫抗体的定量检测方法和芯片与经典的免疫学ELISA 检测方法相比，结果有着很好的吻合性(相关系数R^0.9994)。同时，悬浮芯 片方法灵每文度为2.12ng/mL，高于ELISA方法的312.5ng/mL，灵每文度增高100 倍以上；并且，本发明的悬浮芯片方法动态检测范围为1.22~2000000ng/mL，高 于ELISA方法动态检测范围312.5 20000ng/mL达2个数量级。
4、 方法的特异性
本发明通过选用鼠疫Fl抗原为包被抗原，以兔抗鼠疫Fl抗体为待测抗体， 以生物素化的羊抗兔IgG为检测抗体。本研究试验证明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗禽流感H5NlIgG、兔抗结核抗体、兔抗SARS IgG干扰抗体存在条件 下，本方法具有良好的特异性。
5、 样品的检测能力
本发明评价了悬浮芯片方法对/ok清的检测能力。通过对人血清的检测， 初步证实了该方法在检测人血清中鼠疫抗体的实用性。
图1: 043号微球包被鼠疫F1蛋白检测鼠疫抗体示意图2:蛋白悬浮芯片方法检测兔抗鼠疫F1抗体的剂量-反应标准曲线图3: ELISA方法检测兔抗鼠疫F1抗体标准曲线图4:蛋白质悬浮芯片与ELISA方法检测兔抗鼠疫F1抗体的相关性。
具体实施例方式
本发明涉及的检测鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片制备方法、检测及定量方法通 过下面的具体实施方式
作进一步说明，但本发明不以任何方式受该实施例的限 定。
一、材料
1. 蛋白悬浮芯片的相关緩冲液
(1 ) PBS緩冲液(pH7.4) : NaCl 137mmol/L; KC1 2.7匪ol/L; Na2HP04 10mmol/L; KH2P04 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44g Na2HPOjo 0.24gKH2PO4。用HC1调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后 在15psi ( 1.05kg/cm2)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。
(2 )微球清洗液PBS ( pH7.4 ) , 0.05% TWEEN-20。
(3 )微球活化緩冲液100 mM NaH2P04: 3g NaH2P04， 5N NaOH 1.5 mL, 定容于250mL, pH6.2。
(4 )微球包被緩冲液0.05 M MES， pH 5.0: 2.44 g MES， 5NNaOH 0.15 mL， 定容于250mL。
(5) 微球保存液PBS-TBN: PBS， 0.1%BSA， 0.02% TWEEN， 0.05%叠氮 化物，pH7.4。
(6) 微球封闭液PBS-BN: PBS, 1%BSA, 0.05%叠氮化物，pH7.4。
(7) 检测緩冲液:PBS， 1%BSA, pH7.4。
(8) 抗体稀释液PBS, pH7.4。
(9) 微球稀释液PBS, 1%BSA， pH7.4。
(10) 样品稀释液PVX: PBS, 0.5%PVA， 0.8%PVP;
(11 )生物素化抗体稀释液PBS-TBN(PBS， 0.1%BSA, 0.02% TWEEN-20， 0.05%NaN3， pH7.4)。
(12) SA陽PE稀释液PBS (pH7,4) , 1%BSA。
2. 抗原与抗体
本发明使用鼠疫F1抗原作为检测抗原。
7本发明所使用待测抗体为兔抗鼠疫Fl抗原多克隆抗体。 本发明所使用检测抗体为生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊抗人IgG。 二、待测样品的制备
1、 目标分析物样品的制备
目标分析物为兔抗鼠疫F1 IgG,干扰样品或作为方法特异性测试的样品是 目标;险测物外的其它抗体或其它蛋白质，包括兔抗结核血清、兔抗SARSIgG 、 兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。将上述待 分析样品均溶于样品稀释液中，4 °C保存。兔抗禽流感H5N1 IgG的储备液浓度 为0.2mg/mL 。比较实验中，相同样品用于ELIS A和悬浮芯片的检测。
将待分析的兔抗鼠疫F1 IgG用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度 样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏 感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。
2、 人血清样本的处理
分别将鼠疫病人血清样本和健康人血清样本用样品稀释1: IO稀释，例如 如人血清样本5pL加样品稀释液50|iL混匀后，作为待检样品进行悬浮芯片方法 的斗全测。
实施例l、检测鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片的制备 1、捕获抗原包被编码微球
本发明采用的043号编码微球购自美国BIO-RAD公司，编码微球用于标记 可以捕获鼠疫抗体的鼠疫F1蛋白抗原，即利用鼠疫F1蛋白包被4鼓球。
A、 编码微球的活化
取100|iL ( 1.25xl。6个)编码微球到1.5mL离心管中，14000 x g离心，小 心吸出并弃去上清液。加入100^iL的微球清洗緩冲液悬浮，震荡并超声后14000 xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入100jxL的微球活化緩冲液，接着先加入 l(VL新鲜配置的EDC ( 50mg/mL),再加入lOpL新鲜配置的50mg/mL的 Sulfo-NHS,高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20分钟。加入150pL的 PBS(pH7.4),震荡后，14000 xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入IOOjiL 的PBS (pH7.4)悬浮编码微球。
B、 用抗原包被编码微3求
取捕荻抗原鼠疫F1蛋白抗原4-50吗加入到活化后的编码微球中，用PBS 緩沖液定容至50(HiL,室温震摇2小时。14000xg离心，小心吸出并弃去上清 液。用50(HiL的PBS緩冲液洗一次，14000 xg离心，小心吸出并弃去上清液。
8加入25(VL的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000 x g离心， 小心吸出并弃去上清液。加入500pL的微5求保存液洗涤编码微球，16000 x g离 心，小心吸出并弃去上清液。最后用150|iL的微球保存液悬浮编码微球，于4"C 避光保存备用。
C、包被微球的计数
吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm; 1/400mm"在普通显微镜 下计数。根据公式(每个大格数xlO、稀释倍数x体积(mL))计算微球数量。 2、检测抗体标记生物素
A、 生物素的标记
分别配制好浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计 算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小 时)，过柱脱盐后分装，-20。C冻存备用。
B、 抗体的用量
以标记2mg/mL的IgG (分子量150,000) lmL溶液为例，需加入10mM生物 素溶液约27 jiL。
实施例2、悬浮芯片制备法a的优化
1、 微球包被抗原包被量的选择
分别以lpg、 3jxg、 6pg、 9昭、12昭、15吗、20]ig的量包被lOO)iL编码为 027号的微球。经检测效果比较，以6昭/1.25"06个微球即12-24ng/2500~5000 个微球/测试包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。
如图1所示，包被鼠疫F1蛋白抗原的043号微球均落在其正确检测区域内， 并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的悬浮芯片检测系统 可成功用于鼠疫抗体的检测。
2、 生物素化抗体的优化
本发明分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧 基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体， 经质控过程检测效果比较，本实验中SH-活性的生物素标记检测抗体检测效果较 好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述的 方法。
本发明人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的抗体羊抗兔以1: 250稀 释作为4全测兔血清中鼠疫抗体，检测结杲显示生物素化检测抗体Bio-羊抗兔抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果；2mg/mL生物素化的抗体羊抗人以1: 2500稀释作为检测人血清中鼠疫抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-羊 抗人抗体可获得高;f全测值和低背景值的检测效果。实施例3、悬浮芯片样品制备、检测及结果判定1、 待测样品制备用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白悬浮芯片检测。2、 样品的检测及结果判定检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下1) 每孔加入50pL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2) 加入50 |iL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；3) 加入50 适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温 避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤； '4) 加入50(iL的SA-PE，混匀后室温避光震摇IO分钟。洗液洗涤并真空泵 抽滤；5) 加入125pL的检测緩沖液，经蜗旋重悬混匀；6) 用悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。3、 检测结果判定根据试验研究结果与相关研究报道，本发明定义蛋白悬浮芯片方法检测鼠 疫抗体的最低检出限(LOD值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物 浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光4全测信号MFI均 值加3倍标准差(SD),即Cutoff值为=細1(空白对照)+3倍标准差。若检测 结果高于Cutoff对应萸光强度值则判定为鼠疫抗体检测结果阳性；若检测结果 低于Cutoff对应荧光强度值则判定为鼠疫抗体检测结果阴性。实施例4、悬浮芯片对鼠疫F1蛋白抗原特异性检测应用悬浮芯片检测方法分别对兔抗结核IgG 、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫FlIgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等 进行检测，根据实施例3中检测结果判定标准，仅兔抗鼠疫F1 IgG为阳性，其余干扰抗体或蛋白均为阴性。说明本发明所建立的鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片检 测方法与其它测试抗体均不发生交叉反应或非特异反应。实施例5、悬浮芯片定量检测模型的建立1 、兔抗鼠疫F1 IgG标准曲线样品制备用样品稀释液将兔抗鼠疫FlIgG标准品由80略/mL以4倍倍比梯度稀释至 73.6pg/mL成系列浓度样品。2 、剂量-反应标准曲线的绘制按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统 检测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表抗体的浓度 (ng/mL) , Y轴代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的 检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定，图2中兔抗鼠疫FlIgG的浓度 (ng/mL)分别为Sl: 0.0763, S2: 0.305， S3: 1.221， S4: 4.883, S5: 19.531, S6: 78.125, S7: 312.5， S8: 1250.0, S9: 5000.0 ， S10: 20000.0。悬浮芯片系统根据检测结果拟合兔抗鼠疫FlIgG剂量-反应标准曲线方程 FI = -7.99831 +(16838.6+ 7.99831)/[1 +(Conc/ 1006.33)—3 5361Y 198701 3、悬浮芯片检测兔抗鼠疫FllgG的灵^t度和动态范围根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即蛋白悬浮芯片方 法检测兔抗鼠疫FlIgG的灵敏度为50.3pg/mL (Cutoff =8 , Blank=8, SD=0 )。本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓 度。根据标准曲线随着兔抗鼠疫FlIgG浓度的升高，其对应的MFI值也随之递 增，当兔抗鼠疫FlIgG浓度达到0.025mg/mL时，抗原抗体的免疫反应即达到t包 和状态，MFI值也进入平台期，说明样品中的待检物浓度高，需要将高浓度样 品稀释后再检测。因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即悬浮芯片定量l企测 兔抗鼠疫F1 IgG的动态范围为4.883 ~ 25000ng/mL。实施例6、蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法检测兔抗鼠疫Fl抗体的比较 1、生物素-亲和素ELISA (BAS-ELISA)检测方法作为对比，生物素-亲和素ELISA采用包括下列步骤 1)向普通ELISA微孔板每孔加入50jxL用PBS緩冲液稀释的禽流感H5蛋 白5-5Ong, 4。C静止过夜；li2) 加入封闭液，在37。C封闭2小时；3) 洗液洗3次，拍干；4) 加入检测样品，每孔50 pL,室温放置40分钟；洗液洗3次，拍干；5) 加入适量生物素化检测抗体，每孔50jiL,室温放置30分钟；洗液洗3次， 拍干；6) 加入适量SA/HRP (辣根酶标记链霉亲和素)，50pL/孔，室温放置3分 洗液洗3次，拍干；7) 加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50pL/孔，室温 ;汰置10分钟；8) 用2MH2S04终止反应；9) 应用酶标仪测读A450nm数值。2、 本发明的悬浮芯片检测方法采用间接法测抗体的免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板 上进行。1) 每孔加入50jiL含相应编码提0求的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵4由滤2次；2) 加入50 检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽 滤3次；3) 加入50 (iL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温 避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤3次；4) 加入5(HiL的SA-PE,混匀后室温避光震摇10分钟。用清洗液洗涤并真 空泵;^由滤3次；5) 加入125)iL的检测緩冲液，经蜗旋重悬混匀；6) 用Bio-Plex悬浮芯片系统读取MF1数值并分析数据。3、 两种检测方法的灵敏度和动态范围及相关性的比较制备的相同 一组兔抗鼠疫Fl抗体样品用样品稀释液4倍比稀释同时应用悬 浮芯片和ELISA方法进行检测。绘制EUSA方法检测兔抗鼠疫Fl抗体的标准 曲线(图中横坐标为样品浓度，纵坐标为吸光度值，坐标轴取对数-对数关系)， 并与悬浮芯片方法结果进行比较。冲艮据两种方法标准曲线悬浮芯片方法如图2所示的灵敏度为2.12ng/mL, 线性4全测范围1.22 2000000ng/mL; ELISA方法如图3所示的灵敏度为312.5/mL， 线性检测范围312.5~20000ng/mL。可以得出结论检测相同兔抗鼠疫Fl抗体样12品，蛋白悬浮芯片方法比ELISA方法具有更高的检测灵敏度，即高100倍；并 且具有更宽的动态检测范围，即高2个数量级。另夕卜，如图4所示，将两种方法检测结果在312.5 20000ng/mL范围内进行 比较可以判定蛋白质悬浮芯片方法与ELISA方法有良好的相关性，相关系数为 0.9994。实施例7、 Ajk清样品的检测、人血清样品的准备将人血清样品用样品稀释液1:10稀銜人血清样本5pL加样品稀释液50|liL 混匀)后用于蛋白悬浮芯片检测。 2、人血清样品的检测1) 每孔加入50pL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2) 加入50 待检测人血清样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液 洗涤并抽滤；后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4) 加入50ixL的SA-PE，混匀后室温避光震摇IO分钟。洗液洗涤并真空泵 抽滤；5) 加入125nL的4全测緩冲液，经蜗旋重悬混匀；6) 用悬浮芯片系统读取MFI数值，根据标准曲线，确定待检测人血清中鼠 疫抗体的浓度。经过多次重复试验，生物素化羊抗人IgG稀释比例选用1: 2500稀释，SA-PE 稀释比例选用1: 300稀释，经过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值 与其标准差的3倍之和作为判断阴阳性的界值，即Cutoff值为632.35,换算为 浓度值是9.6ng/mL,检测得到的MFI值如杲大于632.35，即血清中的鼠疫抗体 浓度超过9.6ng/mL可视为鼠疫抗体阳性可能被鼠疫感染，如果MFI值小于 632.35,即血清中的鼠疫抗体浓度低于9.6ng/mL可判断为鼠疫抗体阴性，未感 染鼠疫。
权利要求
1、一种采用蛋白悬浮芯片检测血清样品中鼠疫抗体的间接免疫学定量检测方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤(1)包被微球的捕获抗原为鼠疫F1蛋白抗原；(2)向孔内加入含已包被捕获抗原编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待测血清样品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；(5)加入链亲和素-藻红蛋白，孵育后清洗；(6)加入检测缓冲液后混匀；(7)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(MFI)数值并分析数据判定检测结果。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用生物素标记的羊抗人IgG 作为检测抗体，其与鼠疫F1蛋白抗原的组合组成间接法4企测体系。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被孩史球的捕获抗原 鼠疫F1蛋白抗原用量为6吗/1.25xl()6个编码微球或12~24ng/2500^5000个孩0求/测试。
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体 羊抗人IgG的生物素为羧基活性的生物素。
5、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗 体Bio-羊抗人IgG以1: 2500稀释作为检测抗体进行检测。
6、 一种定量检测血清样品中鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片方法，其特征在于， 该方法包括下列步骤(1 )加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释，所述梯度倍比稀释 为4倍；(2) 将系列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应荧光值(MFI);(3 )制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应曲线； (4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；(5 )未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断未知样本中鼠疫抗体 的浓度，其特征在于加入的阳性检测样品为兔抗鼠疫Fl IgG。
7、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕获抗原为 鼠疫F1蛋白，采用生物素标记的羊抗兔抗体作为4全测抗体，并且其组合 组成间接法检测体系。
8、 一种检测血清样品中鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包括编码微 球，作为包被微球抗原的鼠疫Fl抗原，生物素标记的羊抗兔IgG和羊抗 人IgG作为检测抗体，链亲和素-藻红蛋白和适宜的緩冲溶液。
9、 权利要求8所述蛋白悬浮芯片的制备方法，其特征在于，在相关緩冲 溶液中，编码微球用鼠疫Fl抗原包被、用生物素标记的4企测抗体为羊抗 兔IgG和羊抗人IgG、用链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)作为信号检测物。
全文摘要
本发明涉及一种新的检测血清样本中鼠疫菌抗体的定量检测方法和产品。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了以鼠疫抗体为代表的病原菌抗体蛋白质悬浮芯片检测的开放性检测模式化平台。
文档编号G01N33/569GK101533019SQ200910082599
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者孙肖红, 宇 杨, 杨永莉, 静 王, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院