一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒的制作方法

专利名称：一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析领域，具体涉及一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇 的试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒结合了免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技 术。
背景技术：
雌二醇(E2)是女性激素中生物活性最强的一种，主要由卵巢合成，少数由肾上腺分 泌，其生理效应主要促使女性生殖器官的生长发育、促使第二性征的发育、对下丘脑一垂体 轴的影响。血清中雌二醇浓度检査下视丘一垂体一生殖腺轴功能指标之一，对诊断某些内分 泌及妇科疾病有一定的价值和重要意义。雌二醇含量的改变会表现出不同的病变。雌二醇增 高可见女性性早熟、双胎妊娠或多胎妊娠、卵巢性索间质细胞瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、男 性乳房发育、男性冠心病、男性系统性红斑狼疮(SLE)、肝硬变；雌二醇降低表现为女性性 发育不全、先天性卵巢发育不全(Turner's Syndrome)、闭经、女性不孕、多囊卵巢综合征、 席汉氏综合征、完全性或部分性葡萄胎、异位妊娠。另外，人体雌二醇对促进女性生殖系统 的生长发育、维持生育力以及对物质代谢有着重要影响。近年来，人们研究发现人体中雌二 醇含量水平与某些肿瘤，如乳腺癌、子宫癌、肝癌等有显著的相关性，欧美等国家已相继禁 止或严格禁止使用。因此，发明一种灵敏度高，操作简便，费用较低且适用的分析方法和国 产试剂，对于国内临床诊断的推广和普及，以及计划生育的研究都是很有意义的。
目前，免疫分析方法可以提供分析物的宽范围检测和很低的检测限，并且费用低廉，为 分析物的检测提供了一个快速、简便、高灵敏度的分析方法。因此，免疫分析法作为一种重 要的分析方法已广泛应用于临床诊断和生物化学等方面的研究。常用雌二醇检测的方法有放 射免疫分析法(radioimmunoassay， RIA)、酶免疫分析、法(enzyme linked immunosorbentassay， ELISA)和化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)等。然而，放射性元 素对环境的污染及半衰期短等因素限制RIA与IRMA的广泛应用；酶免疫吸附分析法因灵敏度低、检测范围窄等无法满足临床要求。化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分 析方法和特异性强的免疫分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析的高灵敏度和 免疫分析法的高选择性的新的免疫分析技术。该法具有特异性高、灵敏度高、快速、简便及 无放射性污染等优点，已广泛应用于医学、生物和化学等领域。
在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多， 一定程度上影响了检测灵 敏度和准确性。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载 体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗 体)，使其致敏为免疫磁微粒，具有分离速度快、效率高、可重复性好；操作简单；不影响 被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下定向运动，使得 某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。采用免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检 测待测物，可大大提高检测的灵敏度和准确性。该技术的新颖之处在于采用微小的磁微粒 作为固相载体，可增加包被表面积，从而增加了抗体的有效包被量，增加了抗原、抗体的接 触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度和检测范围。
本发明试剂盒是将化学发光免疫分析与免疫磁微粒分离技术相结合，灵敏度高、检测时 间短，无需昂贵的仪器，还可以大大节省原料，并且操作简便、适用性广，既可应用于开放 式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，有助于促进化学发光免疫分析技 术在临床检验、检测中的应用与发展。

发明内容
本发明的目的在于提供一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒。 本发明的目的还在于提供一种上述试剂盒的制备方法。
一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒，所述试剂盒包括雌二醇系列 校准品、二抗包被的磁微粒溶液、辣根过氧化酶标记的雌二醇、雌二醇抗体、化学发 光底物液以及浓縮洗涤液。
所述二抗为多克隆抗体，优选羊抗兔的多克隆抗体。所述雌二醇抗体为兔抗雌二醇多克隆抗体。 所述化学发光底物液为A液和B液，其中
化学发光底物A液是pH值为8.0 10.0的含有8 10 mM鲁米诺、0.1 0.3 mM 4-羟基 联苯和0.05 0.1 mM4-碘苯硼酸的0.1 0.2 M硼酸-硼砂缓冲液。
化学发光底物B液是pH值为7.0 7.6的含有3.5 5 mM过氧化脲和体积百分比浓度为 0.1 0.5 %的Tween20的0.1 0.2 M磷酸盐缓冲液。
所述化学发光底物A液优选pH值为8.5的含有lOmM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯和 0.05mM 4-碘苯硼酸的0.2M硼酸-硼砂缓冲液。
所述化学发光底物B液优选pH值为7.4的含有3.5mM过氧化脲和体积百分比浓度为 0.1%Tween20的0.2M磷酸盐缓冲液。
所述浓縮洗涤液是pH为7.2 7.4的含有质量百分比浓度为10 20%的NaCl、体积百 分比浓度为0.05 0.1%的吐温20和0.05 0.1%的防腐剂Proclin 300的0.1 0.25M磷酸盐 缓冲液。
所述浓縮洗涤液为25倍浓縮洗涤液，优选该洗涤液为pH为7.4的含有质量百分比浓 度为20%的NaCl、体积百分比浓度为0.1%的吐温20和0.1%的防腐剂Proclin 300的0.25M 磷酸盐缓冲液。
上述试剂盒的制备方法，包括以下操作步骤
1) 雌二醇系列校准品的制备用去激素人血清将雌二醇纯品稀释成校准品，其校准品 的浓度范围为0-1000pg/mL;
2) 羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备通过戊二醛两步法制备羊抗兔多克 隆抗体包被的磁微粒，并溶于pH值为7.4、含体积百分比浓度为0.1-0.3 %的吐温-20和质量 百分比浓度为0.05~0.1 %的叠氮化钠防腐剂的0.01-0.05 M磷酸盐洗涤缓冲液中，制备浓度 为5~10 mg/mL的工作液，具体操作步骤如下将粒径为2~3pm的磁微粒用戊二醛进行活化， 室温搅拌，混匀2小时后，加磁场(磁场强度2000高斯)，静置20 25min,倒出上清，用 pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗3~5次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50~100mg/mL;每毫升悬浮液中加入纯化的羊抗兔多克隆抗体60 100pg，在4'C下搅拌过夜 后，加磁场，静置10 15min，倒出上清，用含有0.2°/。 1.0%牛血清白蛋白、0.5%~1.0%酪蛋 白、0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.2)于室温封闭3 4小时；最后用pH值为7.4、并溶 于pH值为7.4、含体积百分比为0.1 0.3 %的吐温-20和质量百分比为0.05~0.1 %的叠氮化钠 防腐剂的0.01~0.05 M的磷酸盐洗涤缓冲液清洗3~5次，并用该溶液配制羊抗兔多克隆抗 体包被的磁微粒浓度为5 10mg/rnL的工作液；磁微粒溶液在4'C保存。
3) 雌二醇多克隆抗体的制备
a) 雌二醇抗原的制备使用混合酸酐方法制备雌二醇活性酯，再用雌二醇活性酯与BSA 在磷酸缓冲液的条件下制备雌二醇-BSA复合物；
b) 雌二醇多克隆抗体的制备选取新西兰兔，用步骤a)制备的雌二醇-BSA复合物 进行免疫，首次剂量为2.0mg/只，四周后加强一次剂量为l.Omg/只，第二次注射后，每间 隔两个月加强注射一次剂量均为1.0 mg/只，再连续注射3次，三周后，心脏采血，分离血 清，纯化而得雌二醇多克隆抗体，使用抗体稀释液将其稀释，稀释比例为1:1000 1:3000;
4) 辣根过氧化酶标记雌二醇的制备采用改良的戊二醛法制备辣根过氧化酶标记雌二 醇，得到的酶标记物用酶标记物稀释液按体积比将其稀释成1:1000 1:3000的工作液。
5) 化学发光底物液的制备
a) 化学发光底物液A:
向0.1 0.2\1硼酸-硼砂缓冲液中加入终浓度如下的成分8 10mM鲁米诺、0.1 0.3 mM4-羟基联苯和0.05 0.1 mM4-碘苯硼酸，调节pH值至8.0 10.0:
b) 化学发光底物液B:
向0，1 0.2 M磷酸盐缓冲液中加入终浓度为3.5 5mM过氧化脲，然后加入Tween20 使其在缓冲液中的体积百分比浓度为0.1 0.5 %，调节pH值至7.0 7.6。
6) 25倍浓縮洗涤液的配制
向0.1 0.25M磷酸盐缓冲液中加入NaCl、吐温20和防腐剂Proclin 300，其中，NaCl 的质量百分比浓度为10 20%、吐温20的体积百分比浓度为0.05 0.1%、防腐剂Proclin 300
8的体积百分比浓度为0.05 0.1%，然后调节缓冲液pH至7.2 7.4。 7)分装步骤l) 6)制备的试剂并装入试剂盒中。
所述载体磁微粒为2 3pm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有氨基活性基团的聚合物。
所述抗体稀释液为含质量百分比浓度为1%BSA和0.5°/。水解明胶的0.01MPBS。 本发明试剂盒还可以包括反应管，酶标记物稀释液等方便试剂盒使用的一些试剂，反应 管的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。 所述雌二醇纯品的纯度大于卯％。
本发明试剂盒采用"竞争法"的反应模式，有效地利用了化学发光技术结合免疫磁微粒技 术原理，定量检测人体血清、血浆样品中E2的含量，可同时检测大量样品，具有简便、 快速、灵敏、稳定、高灵敏度等优点，检测的灵敏度高于同类试剂盒。本发明的试剂盒 结构简单，使用方便，价格便宜，携带便利，与市场上的酶免疫试剂盒相比，线性表现均很 好，并且临床符合率也大大提高，该试剂盒适于产业化，具有良好的市场应用前景，特别适 合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。


图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图，即logit-log标准曲线； 图2为本发明的试剂盒同国外RIA试剂盒对临床血样测值比对的相关曲线。
具体实施例方式
以下实施例中使用的试剂来源如下
雌二醇纯品购自美国Fitzgerald公司，纯度99%; 纯化的羊抗兔多克條抗体购自意大利的Adaltis公司；
磁微粒购自意大利Adaltis公司，磁微粒表面包裹带有氨基活性基团的聚合物； 辣根过氧化物酶购自美国Sigma公司； 正常混合人血清来自医院血库。 以下实施例中使用的部分试剂的配制封闭液向0.02mol/L磷酸缓冲液中加入牛血清白蛋白和酪蛋白，使二者的质量百分比 浓度分别为1.0%和0.5% ，溶解后调节pH至7.2。
酶标记物稀释液的配制向0.02M磷酸盐缓冲液中加入如下组分并使其在缓冲液中的 质量百分比浓度为0.076°/。氯化钾、1。/oBSA和0.P/。Proclin300， 0.05%。食品红，调节pH 值至7.5。
抗体稀释液的配制向0.01M PBS中加入质量百分比浓度为1%BSA和0.5%水解明胶。 实施例1本发明试剂盒的制备I
1) 、雌二醇系列校准品的制备
A) 去激素人血清的制备-
将60mL的正常混合人血清等份装入四个容量瓶中，然后分别加入8.0g活性炭，倒置用 旋涡混合器混合均匀，振荡8h后，以6000rpm离心20min，将上清液过滤，滤液中加体积 百分比浓度为0.5 °/。。的防腐剂Proclin-300，冷冻保存。
B) 雌二醇校准品的配制
用步骤A)制备的去激素人血清将E2纯品稀释成校准品，分装E2纯品浓度分别为0、 15、 50、 150、 500、 1000pg/mL的校准品共6瓶。
2) 、羊抗兔多克隆抗体包被磁微粒溶液的制备
通过戊二醛两步法制备羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液，具体操作步骤如下将粒 径为2.8jxm的磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混勾2小时后，加磁场强度为2000高 斯的磁场，静置25min，倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次，并 用该缓冲液进行悬浮，浓度为100mg/mL;每毫升悬浮液中加入纯化的羊抗兔多克隆抗体 10(Hig，在4。C下搅拌过夜后，加磁场，磁场强度为2000高斯，静置10min，倒出上清，用 封闭液于室温封闭3小时；最后用pH值为7.4、含体积百分比浓度为0.3 %吐温-20和质量 百分比浓度为0.1 %叠氮化钠防腐剂的0.05 M磷酸盐缓冲液清洗4次，并用该缓冲液配制成 5mg/mL的工作液，该抗体包被的磁微粒溶液在4'C保存。
3) 、 E2多克隆抗体的制备a) 雌二醇抗原的制备使用混合酸酐方法制备雌二醇活性酯，再用雌二醇活性酯与BSA 在磷酸缓冲液的条件下制备雌二醇-BSA复合物；
b) 雌二醇多克隆抗体的制备选取两只新西兰兔(雌、雄各一只，体重1.5 2.0kg)， 用步骤a)中制备的雌二醇-BSA复合物进行免疫，首次剂量为2.0 mg/只，四周后加强一次 剂量为1.0mg/只，第二次注射后，每间隔两个月加强注射一次剂量均为l.Omg/只，再连续 注射3次，三周后，心脏采血，离心分离血清，采用饱和硫酸铵(saturated ammonium sulfate, SAS)法纯化而得雌二醇多克隆抗体，使用抗体稀释液将其稀释，稀释比例为L2000。
4) 、辣根过氧化酶(HRP)标记雌二醇的制备
以辣根过氧化酶标记雌二醇采用改良的戊二醛法，具体标记过程如下 称取将5mg HRP溶于0.1ml含1.25。/。戊二醛的PH 6.8 O.lmol/LPBS中，置室温18小时， 经葡聚糖凝胶G-25层析除去多余戊二醛，加生理盐水至0.5ml，然后加入5mg雌二醇纯品 及0.05ml PH 9.6的1 mol/L碳酸盐缓冲液，混合后于4匸冰箱放置24小时，加入0.05ml 0.2 mol/L的赖氨酸溶液，室温置2小时，用PH7.2、 0.15 mol/L PBS透析过夜，离心除去沉淀， 上清即为酶标记物(可加入等体积甘油，混匀后，密闭冷冻保存)，用酶标记物稀释液稀释 上述酶标记物制成工作液，稀释比例为1:1000;
5) 、化学发光底物液 A) A液的配制
鲁米诺 L7716g (10mM)
4-羟基联苯 0.05 lg ( 0.3mM)
4-碘苯硼酸 0.012g (0.05mM)
硼酸 11.4g
硼砂 4.9g 蒸馏水 定容至1000mL
pH 调节至8.5
B)、 B液的配制:
11Tween20 lmL (体积百分比0.1 % )
Na2HP04'12H20 51.58g
NaH2P042H20 8.74g
蒸馏水 定容至lOOOmL
pH 调节至7.4 使用时A液与B液等比例混合。 6)、 25倍浓縮洗涤液
Na2HP0412H20 72.5g
NaH2P04.2H20 2.5g
NaCl 200g
Tween-20 lmL
Proclin 300 lmL
蒸馏水 定容至lOOOmL
调整pH至7.4
使用时用蒸馏水稀释25倍。
7)、上述步骤所得产品分装后装入试剂盒即为本发明试剂盒。以检测50个样品的试剂 盒为例，包括
A) 校准品共6瓶，3mL/瓶；
B) 羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液1瓶，共6 mL;
C) 辣根过氧化酶标记雌二醇溶液1瓶，6mL;
D) E2多克隆抗体溶液l瓶，6mL;
F) 化学发光底物A液1瓶，12 mL、 B液1瓶，12 mL;在使用前根据使用量将A液和 B液等体积混合；
G) 浓縮洗涤液l瓶，5mL,使用时用去离子水稀释25倍；H) 聚苯乙烯材料的反应管1袋，50个，每管10mm直径x50mm长度。 实施例2本发明试剂盒的制备II
I) 、雌二醇系列校准品的制备，同实施例I
2) 、羊抗兔多克隆抗体包被磁微粒溶液的制备
通过戊二醛两步法制备羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液，具体操作步骤如下将粒
径为2.0pm的磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混匀2小时后，加磁场强度为2000高 斯的磁场，静置25min，倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次，并 用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL;每毫升悬浮液中加入纯化的羊抗兔多克隆抗体 80吗，在4'C下搅拌过夜后，加磁场，其中，磁场强度为2000高斯，静置15min，倒出上清， 用封闭液将磁微粒于室温封闭4小时；最后用pH值为7.4、含体积百分比浓度为0.2 %的吐 温-20和质量百分比浓度为0.1 %的叠氮化钠防腐剂的0.01 M的磷酸盐洗涤缓冲液清洗4次， 并用该缓冲液将抗体包被的磁微粒配制成7.5mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4'C保存。
3) 、 E2多克隆抗体的制备，除将制得的抗体稀释且稀释比例为1:3000夕卜，其他同实施 例I。
4) 、辣根过氧化酶标记雌二醇(酶标记物)的制备同实施例I ,用酶标记物稀释液将酶 标记物稀释，稀释比例为1:2000;
5) 、化学发光底物液 A)A液的配制
鲁米诺 1.4173g(8mM) 4-羟基联苯 0.017g(0.1mM) 4-碘苯硼酸 0.024g(0.1mM) 硼酸 U.4g 硼砂 4.9g 蒸馏水定容至1000mL
pH 调节至9 .0B)、 B液的配制
过氧化脲 0. 470g (5mM)
Tween20 2 mL (体积比百分比0.2% )
Na2HP04-12H20 51.58g
NaH2P04-2H20 8.74g
蒸馏水 定容至lOOOmL
pH 调节至7.6
使用时A液与B液等比例混合。
6)、 25倍浓縮洗涤液
Na2HP04-12H20 36.25g
NaH2P04'2H20 1.25 g
NaCl 1 00g
Tween-20 0.5 mL
Proclin 300 0.5mL
蒸馏水 定容至lOOOmL
调整pH至7.4
使用时用蒸馏水稀释25倍。
7)、上述步骤所得产品分装后装入试剂盒即为本发明试剂盒。以检测50个样品的试剂 盒为例，包括
A) 校准品共6瓶，3mL/瓶；
B) 羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液1瓶，共6mL;
C) 辣根过氧化酶标记雌二醇溶液1瓶，6mL;
D) E2多克隆抗体溶液l瓶，6mL;
F)化学发光底物A液1瓶，12mL、 B液l瓶，12 mL;在使用前根据使用量将A液和 B液等体积混合；G) 浓縮洗涤液l瓶，5mL，使用时用去离子水稀释25倍；
H) 聚乙烯材料的反应管l袋，50个，每管10mm直径x50mm长度。 实施例3本发明试剂盒的制备III
I) 、雌二醇系列校准品的制备，同实施例I
2) 、羊抗兔多克隆抗体包被磁微粒溶液的制备
通过戊二醛两步法制备羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液，具体操作步骤如下将粒 径为3.0m的磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混匀2小时后，加磁场强度为2000高斯 的磁场，静置20min,倒出上清，用pH值为7.4的0.01tnol/L磷酸盐缓冲液清洗三次，并用 该缓冲液进行悬浮，浓度为75mg/mL;每毫升悬浮液中加入纯化的羊抗兔多克隆抗体60pg， 在4。C下搅拌过夜后，加磁场，其中，磁场强度为2000高斯，静置10min，倒出上清，用封 闭液将磁微粒于室温封闭3小时；最后用pH值为7.4、含体积百分比浓度为0.1 %的吐温-20 和质量百分比浓度为0.05 %的叠氮化钠防腐剂的0.05 M的磷酸盐洗涤缓冲液清洗4次，并 用该溶液配制成10mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4'C保存。
3) 、 E2多克隆抗体的制备，除将制得的抗体稀释且稀释比例为1:1000夕卜，其他同实施 例I。
4) 、辣根过氧化酶标记雌二醇酶标记物的制备同实施例I ，用酶标记物稀释液将酶标记 物稀释，稀释比例为1:3000;
5) 、化学发光底物液 A)A液的配制
鲁米诺 1.5944g (9mM)
4-羟基联苯 0.034g (0.2mM)
4-碘苯硼酸 0.012g (0.05mM)
硼酸 11.4g 硼砂 4.9g
蒸馏水 定容至1000mLpH 调节至10 B)、 B液的配制
过氧化脲 0.376 g (4mM )
Tween20 5 mL (体积百分比为0.5%)
Na2HP04,12H20 51.58g
NaH2P04'2H20 8.74g
蒸馏水 定容至lOOOmL
pH 调节至7.0
使用时A液与B液等比例混合。
6)、 25倍浓縮洗涤液
Na2HP04.12H20 29g
NaH2P04,2H20 lg
NaCl 150g
Tween-20 0.75mL
Proclin300 0.75 mL
蒸馏水 定容至lOOOmL
调整pH至7.2
使用时用蒸馏水稀释25倍。
7)、上述步骤所得产品分装后装入试剂盒即为本发明试剂盒。以检测50个样品的试剂 盒为例，包括
A) 校准品共6瓶，3mL/瓶；
B) 羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液1瓶，共6mL;
C) 辣根过氧化酶标记雌二醉溶液1瓶，6mL; ■D) E2多克隆抗体溶液1瓶，6 mL;F) 化学发光底物A液1瓶，12 mL、 B液1瓶，12 mL;在使用前根据使用量将A液和 B液等体积混合；
G) 浓縮洗涤液l瓶，5mL，使用时用去离子水稀释25倍；
H) 玻璃材料的反应管l袋，50个，每管10mm直径x50mm长度。 实施例4本发明试剂盒的使用方法
I) 、待检样品前处理
静脉抽取人空腹晨血样品，3000rpm离心5min，取上层血清进行分析。 2)、检测方法
使用实施例1制备的本发明试剂盒按照如下步骤对人血清样品进行分析-
A) 洗涤液配制将试剂盒提供的25倍浓缩洗涤液加蒸馏水稀释25倍变为1倍；
B) 将雌二醇系列校准品、羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液、辣根过氧化酶标记雌 二醇和E2多克隆抗体从4。C冰箱中取出，放置15min，平衡至室温；
C) 将实验需要的圆底聚苯乙烯试管编号后固定在板架上；
D) 将上述试管中依次加入待测样品和各浓度校准品各50 ^L，每次试验设空白1管，
然后除空白管外各管加辣根过氧化酶标记雌二醇、E2多克隆抗体和多抗包被的磁微粒溶液各
100pL， 37。C反应50min;
E) 将试管架置于磁分离器上分离5min，然后弃去管中溶液，用上述稀释好的洗涤液， 洗涤5次，在吸水纸上拍干；
F) 将化学发光底物液A和B按1: l混合后，每管加化学发光底物液200pL，充分混 匀，37'C温育10min，置于磁分离器内，暗处放置10min;
G) 在化学发光测量仪上依序测量各管的发光强度(RLU)，测量时间1秒/管；
H) 建立标准曲线分别对校准品浓度和对应RLU取对数，在双对数坐标图上建立标 准曲线，以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Logit值为纵坐标绘出标准曲线，见附图
1，曲线方程为logitY--2.33761ogX+4.983 ， r=0.9993。
I) 以待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清雌二醇的浓度。
17实施例5本发明试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，分别对试剂盒的精密度、准确度、灵敏度、特异性以及稳定性进行了检定。
1) 、试剂盒灵敏度实验
灵敏度是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量，是指分析方法的最小检出量(记为零标准点的平均减去2SD)。按实施例4的使用方法实施例1制备的试剂盒测定10个So标准点，计算其发光强度的平均值和标准偏差，带入线性方程，计算出对应的浓度值，并重复该操作5次，得到该试剂盒的最低检出限为2.51pg/mL。并与其它方法比对，见表l。表1本发明试剂盒与其他方法灵敏度对比实验结果方法 灵敏度(pg/mL)
RIA 5.0ELISA 34,0本发明试剂盒 2.51由表1可以看出，本试剂盒采用的方法检测灵敏度明显高于其他方法。
2) 、试剂盒精密度测定
将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验，分别按实施例4的使用方法测定低、中、高三种不用浓度的血清，IO管平行测定，重复3次，得出每次分析的批内变异和多次分析的批间变异(表2)。其批内和批间变异系数均小于15%。
表2方法精密度考察
样品测定次数E2浓度(pg/mL)CV (o/o)
11038.16.1
批内变异210106.44.7
310427.57.3
13040.39.4
批间变异230104.15.1
330431.612.23)、试剂盒准确度测定
准确性是指测量值接近真值的程度，通常用回收率表示。选用三份人血清，在最佳实验条件下测定浓度，然后分别向血清内加入浓度为0、 30、 80和200 pg/mL的E2校准品，使用实施例1的试剂盒实施例4的使用方法对每个浓度做3个平行，计算回收率。结果如表3所示，表明E2的加标回收率在93.3%~106%之间。
表3样品回收率
加入浓度值(pg/mL)测得浓度(pg/mL)回收率(％)
052.3-
3080.393.3
80137106
200254101
4)试剂盒特异性实验
选取常见的雌二醇结构类似物，配制成浓度远大于生理浓度的临床样本，用实施例l
的试剂盒按实施例4的使用方法进行测定。
六^ E ^，= 抑制率为50%时所需雌二醇的浓度
乂 一抑制率为50%时所需雌二醇结构类似物的浓度
结果表明， 一些常见的类固醇激素与雌二醇抗体的交叉均小于2.0%，说明本方法所选用的抗体特异性较高，可以满足准确测定人血清中雌二醇的要求。
表4一些常见的雌二醇结构类似物与抗体之间的交叉反应率(n=5)
类固醇激素交叉反应率(％)
雌二醇(E2)100
雌酮(El)1.87
雌三醇(E3)0.7
雄烯二酮<0. 03
双氢睾酮(DHT)〈0.01
睾酮〈0. 1
5)、试剂盒稳定性实验
将实施例1的试剂盒中的各试剂在4'C和37'C下放置3d、 7d、 10d后进行实验。实验结果表明，实施例1的试剂盒指标均在正常范围之内，不同条件对实验结果均没有明显的影响，则说明该产品的稳定性很好。 、
经过实验证明，本发明的试剂盒方法学指标如下
检测范围0 1000pg/mL;
灵敏度最小检出限为2.51pg/mL;
精密度小于15% (n = 3);
准确性平均回收率在93.3%~106%之间；
特异性与E,、 E3、 T、 DHT等其他类似物的交叉反应率小于2.0。/。；稳定性各试剂组分置4。C和37。C，考察3d、 7d、 10d后，各组分仍稳定。实施例6本发明试剂盒同RIA试剂盒对临床血清样品测值的比对
分别用实施例1制备的试剂盒(使用方法见实施例4)和购自法国Cisbio International公司的RIA试剂盒对105份临床血清样品进行检测。其检测结果见附图2，以本发明试剂盒测定的血清样品E2结果为横坐标，以RIA试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为Y=1.0782X-3.2188，相关系数r = 0.9892。经统计学处理结果表明，本发明方法同RIA试剂盒临床血样测值相关性良好。
权利要求
1、一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括雌二醇系列校准品、二抗包被的磁微粒溶液、辣根过氧化酶标记的雌二醇、雌二醇抗体、化学发光底物液以及浓缩洗涤液。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗为多克隆抗体。
3、 根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗为羊抗兔的多克隆抗体。
4、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述雌二醇抗体为兔抗雌二醇多克隆 抗体。
5、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液为A液和B液， 其中化学发光底物A液是pH值为8.0 10.0的含有8 10mM鲁米诺、0.1 0.3 mM 4-羟基 联苯和0.05 0.1 mM4-碘苯硼酸的0.1 0.2M硼酸-硼砂缓冲液；化学发光底物B液是pH值为7.0~7.6的含有3.5 5 mM过氧化脲和体积百分比浓度为 0.1 0.5 %的Tween20的0.1 0.2 M磷酸盐缓冲液。
6、 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物A液是pH值为8.5 的含有lOmM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯和0.05mM 4-碘苯硼酸的0.2M硼酸-硼砂缓冲液；所述化学发光底物B液是pH值为7.4的含有3.5mM过氧化脲和体积百分比浓度为 0.1°/。Tween20的0.2M磷酸盐缓冲液。
7、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓縮洗涤液是pH为7.2 7.4的含有 质量百分比浓度为10 20%的NaCl、体积百分比浓度为0.05 0.1。/。的吐温20和0.05 0.10/。 的防腐剂Proclin 300的0.1 0.25M磷酸盐缓冲液。
8、 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述浓縮洗涤液为25倍浓縮洗涤液，该洗 涤液是pH为7.4的含有质量百分比浓度为20%的NaCl、体积百分比浓度为0.1%的吐温 20和0.1%的防腐剂Proclin 300的0.25M磷酸盐缓冲液。
9、 权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤1) 雌二醇系列校准品的制备用去激素人血清将雌二醇纯品稀释成校准品，其校准品 的浓度范围为0 1000pg/mL;2) 羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备通过戊二醛两步法制备羊抗兔多克隆抗体包被的磁微粒，并溶于pH值为7.4、含体积百分比浓度为0.1~0.3 %的吐温-20和质量 百分比浓度为0.05-0.1 %的叠氮化钠防腐剂的0.01~0.05 M磷酸盐洗涤缓冲液中，制备浓度 为5~10mg/mL的工作液；3) 雌二醇多克隆抗体的制备a) 雌二醇抗原的制备使用混合酸酐方法制备雌二醇活性酯，再用雌二醇活性酯与BSA 在磷酸缓冲液的条件下制备雌二醇-BSA复合物；b) 雌二醇多克隆抗体的制备选取新西兰兔，用步骤a)制备的雌二醇-BSA复合物 进行免疫，首次剂量为2.0mg/只，四周后加强一次剂量为l.Omg/只，第二次注射后，每间 隔两个月加强注射一次剂量均为1.0 mg/只，再连续注射3次，三周后，心脏采血，分离血 清，纯化而得雌二醇多克隆抗体，使用抗体稀释液将其稀释，稀释比例为1:1000 1:3000;4) 辣根过氧化酶标记雌二醇的制备采用改良的戊二醛法制备辣根过氧化酶标记雌二 醇，得到的酶标记物用酶标记物稀释液按体积比将其稀释成1:1000 1:3000的工作液；5) 化学发光底物液的制备 a)化学发光底物液A:向0.1~0.2 M硼酸-硼砂缓冲液中加入终浓度如下的成分8~10 mM鲁米诺、0.1~0.3 mM 4-羟基联苯和0.05~0.1 mM 4-碘苯硼酸，调节pH值至8.0 10.0;b)化学发光底物液B:向0.1~0.2 M磷酸盐缓冲液中加入终浓度为3.5~5 mM过氧化脲，然后加入Tween20使 其在缓冲液中的体积百分比浓度为0.1~0.5 %，调节pH值至7.0 7.6;6) 25倍浓縮洗涤液的配制向0.1-0.25M磷酸盐缓冲液中加入NaCl、吐温20和防腐剂Proclin 300，其中，NaCl 的质量百分比浓度为10 20%、吐温20的体积百分比浓度为0.05~0.1%、防腐剂Proclin 300 的体积百分比浓度为0.05~0.1%，然后调节缓冲液pH至7.2 7.4;7) 分装步骤l) ~6)制备的试剂并装入试剂盒中。
10、根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述载体磁微粒为2~3nm粒径、四氧 化三铁内核、表面包裹带有氨基活性基团的聚合物。
全文摘要
本发明公开了一种属于免疫分析领域的利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇(E₂)的试剂盒。该试剂盒包括雌二醇系列校准品、二抗包被的磁微粒溶液、辣根过氧化酶标记的雌二醇、雌二醇抗体、化学发光底物液以及浓缩洗涤液。本发明还公开了所述试剂盒的制备方法。本发明试剂盒可定量检测人体血清、血浆样品中雌二醇的含量。可同时检测大量样品，具有简便、快速、灵敏、稳定、高灵敏度等优点，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
文档编号G01N33/543GK101639478SQ200910091848
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者林金明, 勤 肖, 辛天兵 申请人:清华大学