专利名称：酶联免疫检测试剂盒及检测样品中t-2毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒及检测样品中T-2毒素的方法。
背景技术：
T-2毒素(T_2toxin)是单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)之一，T-2毒素是一 种倍半萜烯化合物，学名为4 β -1，5- 二乙酰氧基-8 α - (3-甲基丁酰氧基)-3 α -羧基-12， 13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为C24H34O9,分子量为466. 22。
Τ-2毒素的毒性强烈，可由多种真菌产生。Τ-2毒素作为一种常见的真菌毒素，在 自然界中广泛存在，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品，对人类健康及畜牧业 构成了较大危害。Τ-2毒素可引起机体过氧化损伤，还具有致畸性和弱致癌性。此外，Τ-2 毒素可能还与我国某些地区的大骨节病、食管癌和克山病的高发病率有关。
目前检测Τ-2毒素的方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、放射免疫 法和质谱分析法等。上述方法各有优缺点，但主要存在的问题是对设备依赖性高，并且不能 够实现对大批量样品的快速检测，因此，限制了这些方法的应用。
因此，开发一种不受检测设备的限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的 产品和方法成为迫切需要解决的问题。发明内容
本发明的目的在于克服现有的检测Τ-2毒素的方法存在的对设备的依赖性高，并 且不能够实现对大批量样品的快速检测的缺点，提供一种不受检测设备的限制并且能够实 现对大批量的Τ-2毒素样品进行快速检测的酶联免疫检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种检测样品中Τ-2毒素的方法。
为了实现本发明的第一个发明目的，本发明提供了一种酶联免疫检测试剂盒，其 中，该试剂盒包括
(1)包被有Τ-2毒素抗原的酶标板；
(2)酶标记物；
(3) Τ-2毒素特异性抗体；
(4) Τ-2毒素标准品溶液；
(5)底物显色液；
(6)终止液；
(7)洗涤液；
(8)复溶液；
其中，所述Τ-2毒素抗原是通过将Τ-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行 偶联得到的，所述Τ-2毒素特异性抗体为使用所述Τ-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。
为了实现本发明的另一个目的，本发明还提供了一种检测样品中Τ-2毒素的方 法，该方法包括以下步骤
(1)对样品进行处理用样品提取溶液对样品进行提取，然后用所述复溶液溶液 进行稀释，得到样品溶液；
(2)用上述的本发明的试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果制作T-2毒素标准品的标准曲线图，从该标准曲线上读出样品 溶液中T-2毒素的浓度。
本发明提供的试剂盒对检测设备的依赖性低，其中所使用的酶标板体积小、携带 方便、含有大量的孔，并且本发明的试剂盒中所使用的各溶液以工作液或浓缩液形式提供， 可以直接使用或简单稀释后使用，非常方便，同时使用本发明的试剂盒的检测结果准确度 高、可重复性高，检测方法简单易行，因此本发明的试剂盒能够实现对大批量的样品进行快 速检测。并且本发明的试剂盒中所使用的T-2毒素特异性抗体能够与T-2毒素发生特异性 的结合反应，同时与其它T-2毒素结构类似物的交叉反应率则很低，从而大大地提高了检 测的特异性和灵敏性。
由此可见，本发明提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实 现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测的优点，同时对T-2毒素具有较高的检测特异性。
图1为实施例3中的T-2毒素标准品溶液的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括
(1)包被有T-2毒素抗原的酶标板；
(2)酶标记物；
(3) T-2毒素特异性抗体；
(4) T-2毒素标准品溶液；
(5)底物显色液；
(6)终止液；
(7)洗涤液；
(8)复溶液；
其中，所述T-2毒素抗原是通过将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行 偶联得到的。对于制备小分子的抗体，人工抗原的合成是关键的一步，抗原的质量直接决定 着抗体的效价和特异性。T-2毒素是小分子吡啶化合物，分子量仅为466. 22，本身并不具备 免疫原性，为半抗原，同时，没有可供偶联的化学基团，必须进行分子改造，使其连接上带有 活性基团的有机分子，之后再与载体蛋白偶联才具有免疫原性。T-2毒素分子结构中用于连 接的位点对抗体的生成及其特异性起着决定性作用。通常情况下，离连接位点最远的部分 引起最强的抗体应答，即“免疫优势”。抗体的特异性是这些位点决定的。本发明将T-2毒素 的C-3位置作为引入带有活性基团的有机分子的位点，从而实现进一步与蛋白质的连接。 常用的带有活性基团的有机分子主要是琥珀酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)或者甲基肟(CMO)， 本发明优选琥珀酸酐。
所述将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联的方法包括
(1)在蒸汽搅拌的条件下，使T-2毒素与琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟在吡啶中反 应3-6小时；具体为，相对于10-15mg的T-2毒素，琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟的用量为 150-300mg,吡啶的用量为 0. 4-0. 8mL ；
(2)将步骤(1)所得的产物在氮气条件下旋转蒸干，用l_2mL氯仿、石油醚或二氯 甲烷重新溶解，以水洗涤3-6次，之后将产物旋转蒸干；
(3)将步骤⑵的产物称取10_15mg，用N，N- 二甲基甲酰胺溶解、搅拌，之后加入 20-25mg牛血清白蛋白(BSA)，搅拌。之后称取15_20mg的碳二亚胺(EDPC)溶解于10_15mL 水中，逐滴加入上述溶液中。室温反应18-M小时，之后用0. 01-0. IM磷酸盐缓冲液透析 3-6天，得到T-2毒素抗原。
在本发明的试剂盒中，所述T-2毒素特异性抗体为使用所述T-2毒素抗原获得的 鼠源单克隆抗体，该抗体的制备方法如下
(1)动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(T_2毒素半抗原与牛 血清白蛋白的偶联物)每次的免疫剂量为30-100 μ g/只，优选40-60 μ g/只。首次免疫时 将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同 剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，第6次免疫后腹腔加强免疫 一次，3天后取脾细胞；
(2)细胞融合与克隆化取上述免疫后Balb/c小鼠的脾细胞，按5-12 1的比例 与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀 释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(3)细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1-5 X IO6个 /mL的细胞悬液，分装于冻存管，可在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37°C 水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
(4)单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注 入灭菌石蜡油0. 5-lmL/只，14天后腹腔注射杂交瘤细胞3-12X IO5个/只，10天后采集腹 水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-70°C保存；
(5)可将腹水在35_40°C下烘干得到抗体冻干粉，放入_70°C保存；
本发明的试剂盒中，所述包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备方法包括
(1)用包被缓冲液将T-2毒素抗原稀释成0. 05-0. 2 μ g/mL浓度的抗原稀释液；
(2)向酶标板的各孔中加入100-150 μ L步骤⑴得到的抗原稀释液，35_40°C下放 置2-4小时，去除包被缓冲液，用洗涤液洗涤2-5次，每次15-30秒，干燥；
(3)向酶标板的各孔中加入200-300 μ L的封闭液，35_40°C下放置2_3小时，除去 酶标板各孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
在上述包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被缓冲液为pH值 9-10,0. 01-0. lmol/L的碳酸盐缓冲液；封闭液为含有5-6重量％。明胶的0. 01-0. 05mol/L 磷酸盐缓冲液。包被T-2毒素抗原的酶标板的材质可以为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、 聚乙烯、聚丙烯或硅橡胶。因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，吸附抗原后不会影 响抗原的免疫活性，且所制成的板的孔底透明度高、平整，从而使测量的空白值较低，因此， 本发明中包被T-2毒素抗原的酶标板优选为聚苯乙烯制成的酶标板。
以上方法制备的酶标板具有很好的稳定性，酶标板的相关技术参数均在正常范围。
在本发明的试剂盒中，所述酶标记物为过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体，该羊抗 鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫而得到的。所述酶标记的羊抗鼠抗抗体是 通过将过氧化物酶采用过碘酸钠法或戊二醛法与所述羊抗鼠抗抗体偶联并纯化提取而制 得的。
本发明的试剂盒中，所述洗涤液为4-8重量％。吐温-20的0. 01-0. 05mol/L的磷酸 盐缓冲液；所述复溶液为0. 01-0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述终止液为0. l-2mol/L的 硫酸。为了使本发明的试剂盒的体积更小，携带更方便，在本发明的试剂盒中所述洗涤液和 所述复溶液可以以浓缩溶液的形式提供，在使用前用去离子水稀释为上述浓度。所述底物 显色液为含有A物质和B物质的水溶液，所述A物质为过氧化氢和/或过氧化脲，所述B物 质为邻苯二胺、四甲基联苯胺和四甲基联苯胺硫酸盐中的一种或几种；所述A物质的含量 为底物显色液的总重量的1-2重量％，所述B物质的含量为0. 5-2mol/L。
本发明的试剂盒中，T-2毒素标准品溶液包括以下7个浓度梯度的T-2毒素溶液 0ng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、2. 5ng/mL、5. Ong/mL、lOng/mL 禾口 20ng/mLo
本发明的试剂盒的检测原理将T-2毒素C-3位衍生物与牛血清白蛋白偶联得到 的T-2毒素抗原包被于酶标板上，加入待测样品或T-2毒素标准品，然后加T-2毒素特异性 抗体，待测样品中的T-2毒素或T-2毒素标准品与酶标板上包被的T-2毒素抗原竞争T-2 毒素特异性抗体。将未结合在酶标板上的T-2毒素特异性抗体洗掉，再加入酶标记抗抗体 以结合剩余的T-2毒素特异性抗体，加入显色液显色后终止，测定酶标板各孔的吸光度值， 该值与样品中T-2毒素的含量呈负相关，与根据T-2毒素标准品制作的标准曲线比较即可 得出样品中T-2毒素的浓度。
本发明还提供了一种检测样品中T-2毒素的方法，该方法包括以下步骤
(1)对样品进行处理
将样品与样品提取溶液以1 2-10的重量比混合，搅拌5-20分钟，过滤，取 30-100 μ L滤液加入4-20倍重量的复溶液，得到样品溶液；其中，所述的样品提取溶液为 50-80体积％的甲醇水溶液。
(2)用上述本发明的试剂盒进行检测
a.向所述酶标板的各孔中加入50-100 μ L所述T-2毒素标准品溶液或步骤(1)得 到的所述样品溶液，然后加入等量的所述T-2毒素特异性抗体的工作液，盖板膜盖板后混 勻，于35-40°C反应30-90分钟；
b.除去孔内液体，用洗涤液洗3-5次，每次使用洗涤液200-500 μ L，每次间隔10 秒，然后拍干；
c.向各孔加入所述酶标记物的工作液100-150 μ L，盖板膜盖板后于35_40°C反应 30-60分钟，然后除去孔内液体，按步骤b的方法洗涤；
d.向各孔加入所述底物显色液100-200 μ L，轻轻振荡混勻，35_40°C下避光显色 10-30分钟；
e.向各孔加入所述终止液50-100 μ L，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于波长 450/630nm检测，测定每孔的吸光度值。
在该检测的方法中，所述T-2毒素特异性抗体的工作液为将所述T-2毒素特异性抗体用抗体工作稀释液稀释到蛋白浓度为0. 02-0. 5μ g/mL的溶液；所述酶标记物的工作 液为将所述酶标记物用抗体工作稀释液稀释到蛋白浓度为0. 01-0. 25 μ g/mL的溶液；所述 抗体工作稀释液为pH 7. 4-9. 5、含有0. 1-1重量％牛血清和5-6重量％。的0. 01-0. 05mol/L 磷酸盐缓冲液。
(3)分析检测结果
以T-2毒素标准品的百分吸光率相对于其浓度作标准曲线，在该标准曲线上读出 样品溶液的百分吸光率所对应的T-2毒素的浓度，乘以步骤(1)中所述稀释的倍数即得到 样品中的T-2毒素的浓度；其中，所述百分吸光率的计算公式为
百分吸光率(％) = B/B0X100%
B为T-2毒素标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值
B0为Ong/mL的T_2毒素标准品溶液的平均吸光度值
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
本发明提供的试剂盒对检测设备的依赖性低，其中所使用的酶标板体积小、携带 方便、含有大量的孔(通常每板含有96个孔)，并且本发明的试剂盒中所使用的各溶液以工 作液或浓缩液形式提供，可以直接使用或简单稀释后使用，非常方便，同时使用本发明的试 剂盒的检测结果准确度高、可重复性高，检测方法简单易行，因此本发明的试剂盒能够实现 对大批量的样品进行快速检测。并且本发明的试剂盒中所使用的Τ-2毒素特异性抗体能够 与Τ-2毒素发生特异性的结合反应，同时与其它Τ-2毒素结构类似物的交叉反应率则很低， 从而大大地提高了检测的特异性和灵敏性。
由此可见，本发明提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实 现对大批量的Τ-2毒素样品进行快速检测的优点，同时对Τ-2毒素具有较高的检测特异性。
以下用实施例和实验例来详细说明本发明，但不是用来限制本发明的范围。
实施例
实施例1检测Τ-2毒素的酶联免疫试剂盒组分的制备
1.Τ-2毒素抗原的合成
采用衍生物法合成Τ-2毒素半抗原(Τ-2毒素的C-3位琥珀酸酐衍生物)，再将该 Τ-2毒素半抗原通过与碳二亚胺反应与牛血清白蛋白载体进行偶联得到。
具体制备过程为
(1) 15mg的T-2毒素与溶解于0. 8mL吡啶中，然后添加300mg的琥珀酸酐，反应4 小时；
(2)将步骤(1)所得的产物在氮气条件下旋转蒸干，用2mL氯仿重新溶解，以水洗 涤5次，之后将产物旋转蒸干；
(3)将步骤O)的产物称取15mg，用N，N-二甲基甲酰胺溶解、搅拌，之后加入 25mg，牛血清白蛋白(BSA)，搅拌之后称取20mg的碳二亚胺(EDPC)溶解于15mL水中，逐滴 加入上述溶液中；
(4)室温反应M小时，之后用0. IM磷酸盐缓冲液透析3天，得到T-2毒素抗 原，-70°C保存。
2. T-2毒素鼠单克隆抗体的制备
(1)动物免疫8
采用Balb/c小鼠(购自军事医学科学院)作为免疫动物，以T_2毒素免疫原 (Sigma公司)，每次的免疫剂量为50 μ g/只，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂 (Sigma公司)混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗 氏不完全佐剂(Sigma公司)混合乳化，加强免疫一次，第6次免疫后腹腔加强免疫一次，3 天后取脾细胞。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞(购自中国农业大 学)融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进 行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)单克隆抗体的制备与纯化
采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0. 5mL/只，14天后 腹腔注射杂交瘤细胞5X IO5个/只，10天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯 化，小瓶分装，-70°C保存。
3.包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备
(1)用包被缓冲液将上述制备的T-2毒素抗原稀释成0. 1 μ g/mL浓度的抗原稀释 液；
(2)向酶标板的各孔中加入100 μ L步骤(1)得到的抗原稀释液，37°C下放置2小 时，去除包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，干燥；
(3)向酶标板的各孔中加入200 μ L的封闭液(5重量％。的明胶的0. 01mol/L磷酸 盐缓冲液)，37°C下放置2小时，除去酶标板各孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例2本发明的检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分
(1)实施例1中的包被有T-2毒素抗原的酶标板；
(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体作为酶标记物；
(3)实施例1中制备的T-2毒素鼠单克隆抗体；
(4) T-2 毒素标准品溶液 7 瓶，浓度分别为 0ng/mL、0. 5ng/mL、1. 0ng/mL、2. 5ng/mL、 5. Ong/mL、10. Ong/mL 禾口 20. Ong/mL ；
(5)底物显色液为过氧化氢与四甲基联苯胺(TMB)的混合溶液；
(6)终止液为2mol/L的硫酸溶液；
(7)洗涤液为含有5重量％。吐温-20的0. 02mol/L磷酸盐缓冲液；
(8)抗体工作稀释液为PH值8. 2、含有0. 5重量％牛血清和5重量％。明胶的 O.Olmol/L磷酸盐缓冲液。
(9)复溶液为0. 01mol/L磷酸盐缓冲液。
实施例3样品中T-2毒素残留的检测
1.谷物、饲料、食品等样品的前处理方法
5g粉碎的样品与25mL 70体积％的甲醇水溶液(70/30(V/V))；在磁力搅拌器上搅 动IOmin ；用滤纸过滤进行提取；取50 μ L滤液或是悬浮液加入300 μ L复溶液，得到样品溶 液，用于下面的检测。
2.用实施例2组建的试剂盒进行检测
使用本发明的试剂盒检测样品中T-2毒素含量的方法包括
(1)从4°C冷藏环境中取出所需试剂，置室温Q0-25°C )放置30min以上，注意每 种液体试剂使用前均须摇勻；
(2)取出需要数量的酶标板微孔及框架；
(3)编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并 记录标准孔和样本孔所在的位置；
(4)加标准品或样本50 μ L/孔到酶标板上各自的微孔中，然后加抗体工作液 (0. 1 μ g/mL), 50 μ L/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混勻。37°C环境中反应45min。
(5)除去孔内液体，用洗涤液(250yL/孔)洗板4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。
(6)每孔加入酶标记物工作液(0. 05 μ g/mL)，100 μ L/孔，盖板膜盖板后置37°C环 境中反应35min。然后除去孔内液体，按步骤(6)用洗涤液充分洗涤。
(7)显色每孔加入底物显色液IOOyL,轻轻振荡混勻，37°C环境中避光显色 15min。
(8)测定每孔加入终止液50μ L，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于波长450/630nm检 测，测定每孔的吸光度值。
3.定量分析
(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率(％) = B/B0X100%
B为T-2毒素标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值
B0为Ong/mL的T_2毒素标准品溶液的平均吸光度值
(2)标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率(％ )为纵坐标，以Τ-2毒素标准品浓度(ng/mL)为横坐标， 绘制标准曲线图(见图1)。
将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘 以其相对应的稀释倍数即为样本中T-2毒素实际浓度。
实验例1本发明的试剂盒中标准品的精密度试验
从每批制备的酶标板中，各抽出10个微孔，测定0 μ g/L标准溶液的吸光度值(0D 值)，重复3次，计算变异系数CV%，结果如表1所示。
表权利要求
1.一种酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括(1)包被有T-2毒素抗原的酶标板；(2)酶标记物；(3)T-2毒素特异性抗体；(4)浓度已知的多个Τ-2毒素标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)洗涤液；(8)复溶液；其中，所述Τ-2毒素抗原是通过将Τ-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联 得到的，所述Τ-2毒素特异性抗体为使用所述Τ-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述将Τ-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋 白进行偶联的方法包括(1)在蒸汽搅拌的条件下，使Τ-2毒素与琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟在吡啶中反应 3-6小时，相对于10-15mg的T-2毒素，琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟的用量为150_300mg， 吡啶的用量为0. 4-0. 8mL ；(2)分离步骤⑴所得的产物，用l_2mL氯仿、石油醚或二氯甲烷重新溶解，再以水洗涤；(3)分离步骤(2)所得的产物，取10-15mg该产物用N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入 20-25mg牛血清白蛋白；将含15-20mg碳二亚胺的水溶液逐滴加入上述溶液中，室温反应 18-24小时，然后分离得到T-2毒素抗原。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述酶标记物为过氧化物酶标记的羊抗鼠抗 抗体，该羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫而得到的。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述洗涤液为4-8重量％。吐温-20的 0. 01-0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述复溶液为0. 01-0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述终 止液为0. l-2mol/L的硫酸溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述底物显色液为含有A物质和B物质的水 溶液，所述A物质为过氧化氢和/或过氧化脲，所述B物质为邻苯二胺、四甲基联苯胺和四 甲基联苯胺硫酸盐中的一种或几种；所述A物质的含量为所述底物显色液总重量的1-2重 量％，所述B物质的含量为0. 5-2mol/L。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备方法 包括(1)用包被缓冲液将T-2毒素抗原稀释成0.05-0. 2 μ g/mL浓度的抗原稀释液；(2)向酶标板的各孔中加入100-150μ L步骤(1)得到的抗原稀释液，35-40°C下放置 2-4小时，去除包被缓冲液，用所述洗涤液洗涤；(3)向酶标板的各孔中加入200-300μ L的封闭液，35-40°C下放置2_3小时，然后干燥并用铝膜真空密封。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述包被缓冲液为pH值9-10、浓度为 0. 01-0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有5-6重量％。的明胶的0. 01-0. 05mol/L磷酸盐缓冲液。
8.—种检测样品中T-2毒素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)对样品进行处理用样品提取溶液对样品进行提取，然后用所述复溶液进行稀释， 得到样品溶液；(2)用权利要求1-7中的任意一项所述的试剂盒进行检测；(3)分析检测结果制作T-2毒素标准品的标准曲线图，从该标准曲线上读出样品溶液 中T-2毒素的浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(1)中所述的对样品进行处理的方法包括 将样品与样品提取溶液以1 2-20的重量比混合，搅拌5-20分钟，过滤，取30-100yL滤 液加入4-20倍重量的复溶液，得到样品溶液；其中，所述的样品提取溶液为50-80体积％的 甲醇水溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤O)中所述的检测的方法包括依次进行的 下列步骤a.向所述酶标板的各孔中加入50-100μ L所述T-2毒素标准品溶液或步骤(1)得到的 所述样品溶液，然后加入等量的所述T-2毒素特异性抗体的工作液，盖板膜盖板后混勻，于 35-40°C反应 30-90 分钟；b.除去孔内液体，用洗涤液洗3-5次，拍干；c.向各孔加入所述酶标记物的工作液100-150yL，盖板膜盖板后于35-40°C反应 30-60分钟，除去孔内液体，用洗涤液洗3-5次，拍干；d.向各孔加入所述底物显色液100-200μ L，轻轻振荡混勻，35-40°C下避光显色10-30 分钟；e.向各孔加入所述终止液50-100μ L，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于波长450/630nm检 测，测定每孔的吸光度值；所述T-2毒素特异性抗体的工作液为将所述T-2毒素特异性抗体用抗体工作稀释液 稀释到蛋白浓度为0. 02-0. 5μ g/mL的溶液；所述酶标记物的工作液为将所述酶标记物用 抗体工作稀释液稀释到蛋白浓度为0. 01-0. 25 μ g/mL的溶液；所述抗体工作稀释液为pH 7. 4-9. 5、含有0. 1-1重量％牛血清和5-6重量％。明胶的0. 01-0. 05mol/L磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明提供一种酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括包被有T-2毒素抗原的酶标板、酶标记物、T-2毒素特异性抗体、浓度已知的多个T-2毒素标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液和复溶液；其中，所述T-2毒素抗原是通过将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联得到的，所述T-2毒素特异性抗体为使用所述T-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。本发明还提供使用上述试剂盒检测样品中T-2毒素的方法。本发明提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测的优点，同时对T-2毒素具有较高的检测特异性。
文档编号G01N33/543GK102033130SQ200910093079
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者刘煊, 吴兆广, 戚大海, 果旗, 王伟, 王彦斐, 王雄, 葛宝坤, 陈冰君 申请人:北京中检维康技术有限公司, 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心