专利名称：胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学免疫应用领域，具体涉及到利用胶体金免疫层析技术检测肝病的 试纸及其制备方法。
背景技术：
原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrh0SiS，PBC)是以破坏肝内小及中等 大小胆管为主的器官特异性自身免疫性肝病，表现为肝门脉区炎症导致纤维化，肝硬化甚 至功能性衰竭。肝炎、肝硬化病人各种病原检测指标呈阴性，需要考虑原发性胆汁性肝硬化 或自身免疫性肝炎。早期运用药物治疗可控制疾病的进展，而PBC的治疗关键在于早期治 疗，而早期治疗的前提是早期诊断，早期诊断就成为大家所关注的焦点。在PBC患者体内可检出多种自身抗体，如抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)、抗平滑肌抗体(SMA)、抗肝肾微粒体抗体(LKM)等，其中最主要 的抗体是AMA，PBC常伴有高滴度的AMA，病程早期就出现AMA是本病的特点。AMA于1965 年由WalRer等在PBC患者血清中用间接免疫荧光法首次发现，其后的研究显示，PBC患者的 AMA阳性率可高达90%，此项检测已成为PBC诊断的主要检查项目。(Neuberger J，Thomson R.PBC and ΑΜΑ—what is theconnection[J]. Hepatology,1999,29(1)265-271)近年研究发现，AMA存在若干亚型，迄今已发现的亚型共有9种(Ml M9)，与PBC 有关的有4种，即M2、M4、M8、M9，其中M2亚型抗体(AMA-M2)为PBC的特异性抗体，对本病 有确诊意义。AMA-M2线粒体抗体对PBC检测的敏感性达93%以上，特异性几乎达95%。 (LeungP S,Van de water J,Coppel R L.et al. Molecular aspects andthe pathoh)gi (al basis of primary biliary cirrhosis[J]Autoimnlun,1996,9(2) :119-128.)PBC病人在出现临床症状和组织学特征变化之前几年甚至十几年就可出现M2型 抗线粒体抗体(姜小华，仲人前，孔宪涛.原发性胆汁肝硬化发病机制研究进展.中国免疫 学杂志，2002,18 =586-588) 0因此M2型抗线粒体抗体即时检出对PBC早期检出及辅助诊断 有非常重要的意义。2000年美国肝病学会(AASLD)在发表的《PBC诊断指南》中，其中有一 很重要的一项为M2亚型抗线粒体抗体(AMA-M2)阳性。随着对M2靶抗原的研究深入，鉴定出M2的靶抗原为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复 合体〔2-0ADC〕的一些组分丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)、2-氧酸脱氢酶(BC0ADC-E2)、2_氧戊 二酸脱氢酶(0GDC-E2)、X蛋白等，而其中PDC的抗原表位主要位于内酯酰区和部分外酯酰 区，在PBC病人血清中的阳性率为95%。BC0ADC，0GDC的抗原表位位于内酯酰区，阳性率分 别为53 % 55 %，39 % 88 %。三抗原间无交叉反应，PBC病人血清中M2型抗线粒体抗体 能与一种或一种以上抗原反应。三个靶抗原联合检测，其阳性率可达95% 99%，而且特 异性也很高，正常人阳性仅为0. 5% (贾继东自身抗体检测在自身免疫性肝病诊断中的应 用[J].中华检验医学杂志，2003, ) 116-120)。本产品采用基因工程方法(定康，陈燕等人源M2 二联体靶抗原P0-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定· [J]临床军医杂志· 2007，636 (3) :323 :325.)成功克隆、原核表达全部为人源的M2三个靶抗原，即丙酮酸脱氢酶(PDC)、2_氧酸脱氢酶 (BCOADC)、2_氧戊二酸脱氢酶(OOTC)，且成功连接形成抗原蛋白三联体即为本产品的检测 抗原。目前M2型抗线粒体抗体的检测方法有间接免疫荧光 Indirectmmunofluorescence, IIF)禾口酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)。目前市场上商品化M2型抗线粒体抗体检测试剂盒主要为ELISA试剂盒。ELISA法 操作程序烦琐，完成整个实验过程需三小时左右，亦需要专业免疫学技术人员在实验室中 进行实验操作，并且需经酶标仪检测后读取实验结果，这在基层医疗机构的实验室和小型 门诊中较难实现该项目的实验检测，同时基于ELISA方法学易受各种温度和孵育时间等环 境条件因素的影响，对试验带来诸多不便。间接免疫荧光，观察结果需要专业人员操作特殊的仪器设备，间接免疫荧光法存 在检测时间长但须有荧光显微镜观察结果，并有一定的主观人为判断误差，另外易受其他 干扰产生假阳性，标准化困难，也不适合高通量标本的检测。为了克服上述检测方法的不足，我们将胶体金层析法应用到M2型抗线粒体抗 体的检测中。胶体金免疫层析法(gold-immunochromatography assay, GICA)是应用 胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细效应使样 品溶液在层析条上泳动，使样品中的待测物与结合垫上针对待测物的受体(如抗原或抗 体)发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原(或抗体)发生免疫反应而被截留， 进而形成肉眼可见的紫红色条带，得到直观的实验结果，达到快速检测的目的(Sikowicz Getal. One-step chromatographic immunoassay for qualitativedetermination of choricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990 (36) 1579-1586.)。使用时只将样品加样 到样品垫上，数分钟就根据检测线上紫红色条带出现情况来判断阴阳性结果。与其他检测 方法相比，检测时间短，只需要5 10分钟，操作人员无需培训，操作简便、快速，无需低温 保存，储运方便等优势。在自身免疫性疾病方面，目前国外市场上出现了一些检测自身免疫疾病的试纸条 产品，但M2型抗线粒体抗体的胶体金免疫试纸在国内外市场上仍没有问世。本发明将基因 工程菌表达的抗原蛋白首次引入到试纸条中，实现了高特异性、高灵敏度、高准确度的检测 性能。目前市面上也出现了商品化ELISA试剂盒，但金标层析试纸与之相比，仍有诸多不同 之处，不受场地人员之限，检测时间短即5-10分钟，判读结果简便。此外该试纸具有高特异 性、高灵敏度、高准确度，能满足市场的快速筛选PBC，为病人及早诊断治疗提供条件，同时， 也能满足基层实验室、即时检测、床边检测的需求。
发明内容
本发明为了克服以上方法学的不足，将胶体金层析法应用到M2型抗线粒体抗体 的检测中，同时首次将M2型线粒体抗原蛋白应用到胶体金层析法中，采用间接法来实现血 液中的M2型抗线粒体抗体检测，实现高特异、高灵敏度、高准确性的检测性能，快速筛选出 M2型抗线粒体抗体的阳性样本，能快速、便捷地辅助诊断原发性胆汁肝硬化。本发明目的之一在于提供一种胶体金层析法肝病检测试纸。
本发明目的之二在于提供一种胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法。一种胶体金层析法肝病检测试纸，包括有硝酸纤维素包被膜(3)、结合垫⑵、样 品垫(1)、吸水垫(6)，它们依次粘贴在底板上，其特征在于所述的结合垫包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)，所述的硝酸纤维素包被膜( 上有检测线(4)和质控线(5)，其中检测线包被有M2型线粒体抗原蛋白，其中的质控线(5)包被有抗体(C)。进一步，所述的抗体(a)为抗人IgG单克隆抗体或抗人IgG多克隆抗体，或葡萄球 菌A蛋白(SPA)或链球菌G蛋白(Protein G)中的一种或多种。所述的抗体(a)中的多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中的一种，抗 体(a)中的单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。所述的抗体(b)和抗体(C)均为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种，其中(b)和 (C)可发生特异性结合形成免疫复合物。所述的抗体(b)和抗体(C)中的多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中 的一种，单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。所述的检测线上包被的蛋白为通过原核表达克隆化基因获得的M2型线粒体抗原 蛋白。所述检测是定性检测人血清中M2型抗线粒体抗体，辅助诊断早期原发性胆汁肝 炎。所述M2型线粒体抗原蛋白是针对M2的靶抗原即线粒体的2_氧酸脱氢酶复合体〔 2-0ADC〕的一些组分丙酮酸脱氢酶(PDC-E》、2_氧酸脱氢酶复合体E2 (BC0ADC-E2)、2_氧 戊二酸脱氢酶复合体E2 (0GDC-E2)，通过基因克隆技术构建重组基因，然后采用原核表达技 术成功表达出全部为人源的M2三个靶抗原蛋白，且成功连接形成抗原蛋白三联体(姜小 华，仲人前等.M2自身抗原及其三联体的克隆表达和初步鉴定.中华消化杂志，2001(21) 530-533)。所述样本来自人血清、血浆、全血样本。根据本发明应用的单克隆抗体可通过由Kohler等(Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J]. Nature,1975 (256) 495-497)首先描述的杂交瘤法进行制备，或者可通过重组DNA法进行制备(见美国专 禾Ij 4816567)。"单克隆抗体，，由 Clackson 等(Making antibody fragments usingphage display libraries[J]. Nature, 1991 :624-628)禾口 Marks 等(By-passing immunization Human antibodies from V-genelibraries displayed on phage[J]. Journal of MolecularBiology, 1991 :581-597)所述技术从噬菌体抗体文库中分离。根据本发明应用的多克隆抗体可通过陈学清等(免疫学常用实验方法.[M]， 2000 :15-26)通过免疫动物来制备。本发明的SPAlrotein G通过原核表达克隆化重组基因，由J.萨姆布鲁克等(分 子克隆实验指南.[M]，2002 =1228-1232)描述的大肠杆菌原核表达克隆化基因。一种胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法，该试纸由样品垫、结合垫、包被膜、 吸水垫和底板共同组成，其特征在于该方法包括有以下步骤步骤1，抗原的制备，是通过原核表达克隆化基因获得M2线粒体抗原蛋白，
以及包被膜的制备，是用包被膜缓冲液稀释抗原蛋白至浓度为1. 0 1. 5mg/mL, 将抗体(c)稀释到0. 8 1. 5mg/mL,以1 10 μ 1/cm硝酸纤维素膜上，置放于37°C烘干备 用，以及金标抗体的制备，是用0. IM碳酸钾调节胶体金pH 7. 0 9. 0，按每毫升胶体 金溶液缓慢加入4 25 μ g蛋白，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 5%，搅 拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体积的保
存液将沉淀重悬，置4°C备用，以及结合垫的制备，是经处理液浸渍处理的聚脂膜，烘干后，将金标抗体(a)和金 标抗体(b)混合后，以0. 5 4μ 1/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，25 °C 30°C干燥 后，置于2°C 8°C的环境下备用，以及样品垫的制备，是经处理液浸渍处理的玻璃纤维膜，于37°C烘干后备用；步骤2，在底板上顺次相互搭接粘贴经前述步骤1所制作完成的硝酸纤维素包被 膜、结合垫、样品垫、吸水垫；步骤3，对步骤2所制作完成的材料，切割成试纸条。所述的步骤1中，金标抗体的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至8. 0 9. 0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA 至终浓度0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次 用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。所述的步骤1中，金标抗体的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8 12 μ g兔IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA至终 浓度0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十 分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。所述的步骤1中，金标SPA的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升胶体金溶液缓慢加入10 15 μ g SPA,搅拌10 30min，然后加入BSA至终 浓度0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十 分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。然后将金标SPA OD 20 2 4μ 1/cm喷 涂于结合垫，干燥后备用。所述的步骤1中，金标SPA的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA 至终浓度0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次 用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。然后将金标SPAOD 302 4μ 1/cm 喷涂于结合垫，干燥后备用。所述的步骤1中，将制备好的金标抗体(a)和金标兔IgG按20 40/15 20比 例混合，用ΒΙΟ-Dot喷膜机以2. 0 4μ 1/cm喷于预处理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥，封 袋，置2 °C 8 °C备组装粘板用。所述的步骤3中，切割成的试纸的宽度优选为4mm和3mm两种。本发明的检测原理具体为选用亲和层析纯化的M2抗原蛋白，金标抗体(a)和金标 兔IgG作为胶体金标记复合物，喷涂于结合垫，利用间接法来检测血清样品中是否含有M2 型抗线粒体抗体。检测时，样本随着层析泳动到结合垫并浸润金标复合物，其中的人IgG和金标抗体(a)结合形成人IgG-金标抗体(a)复合物，由于毛细效应，此复合物沿包被膜泳 动向前，若血清样品中有M2型抗线粒体抗体，此复合物与包被于硝酸纤维素膜上的抗原蛋 白发生特异性免疫结合反应，形成金标抗体(a)_人IgG_M2抗原蛋白三联体复合物而被截 留在检测线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带；由于毛细效应继续泳动向前，金标兔IgG 与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较 深的紫红色条带，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线都出 现条带的判为阳性结果；若血清样品中不含有M2型抗线粒体抗体，金标抗体(a)到达检测 线时，不与包被在检测线上的抗原蛋白发生免疫反应，因此在检测线处没有出现紫红色条 带，金标抗体(a)继续泳动向前到达吸水垫，而金标兔IgG继续泳动向前与包被于质控线处 羊抗兔IgG发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带，因此仅 在质控上出现条带判为阴性结果。与现有的检测方法相比，本发明优点1.该测定方法的独特性在于基因重组表达的三联体抗原蛋白首次应用于胶体金 层析试纸，大大提高了其检测灵敏度，通过胶体金试纸可快速筛选出M2型抗线粒体抗体所 有阳性样本(能检出大于25RU/ml的样本)。2.本发明的优点是生产成本低。本发明所提供的M2型抗线粒体抗体检测试纸所需的核心试剂是抗体(a)即抗人IgG或SPA或PROTEIN G、抗体(c)、抗体 (b)、抗原蛋白，其单条试纸所用试剂量少，且可通过购买商品化试剂或自制，抗原蛋白来源 于商品化的纯化基因工程抗原蛋白，或者自行制备。3.与已公开的用于M2型抗线粒体抗体检测的其他方法相比，本发明的试纸具有 许多其他方法所不能比拟的优点，如检测时间短(5 IOmin)；不需要任何特殊仪器，可实 现床边检测和门诊即时检测；操作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低； 对温度无特殊要求，无需冷冻，储存运输方便，室温可保存M个月。
图1为本发明的侧面结构示意图。图1所示，该试纸是在支撑胶板(7)上顺次相 互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜(3)、结合垫O)、样品垫(1)、吸水垫(6)。结合垫( 上包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)；硝酸纤维素包被膜( 有检 测线⑷和质控线(5)，其中，检测线⑷包被有M2型线粒体抗原蛋白，质控线(5)包被有 抗体(c)。图2为本发明的检测结果示意图。图加所示为加样后，反应3 5min即可看到检测区4⑴和控制区5 (C)相应位 置上出现紫红色条带；图2b所示为当C区5和T区4均出现紫红色条带，结果为阳性，说明血清中含有 M2型抗线粒体抗体；图2c所示为如只在C区5出现一条紫红色条带，T区4不出现紫红色条带，结果 为阴性，说明血清中不含M2型抗线粒体抗体；图2dJe所示为如C区5不出现紫红色条带，无论T区4是否有条带出现，都说 明试纸失效。
具体实施例方式本发明所述的胶体金免疫层析法肝病检测试纸，如图1所示，该试纸是在支撑胶 板(7)上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜(3)、结合垫O)、样品垫(1)、吸水垫(6)。 所述的结合垫( 上包被有金标抗体(a)和金标兔IgG。所述的硝酸纤维素包被膜(3)有 检测线(4)和质控线(5)，检测线(4)包被有M2型线粒体抗原蛋白，质控线(5)包被有羊抗 兔 IgG。如图2所示，加样后，反应3 5min即可看到检测区4⑴和控制区5(C)相应位 置上出现紫红色条带，如图加所示；当C区5和T区4均出现紫红色条带(如图2b所示)， 结果为阳性，说明血清中含有M2型抗线粒体抗体；如只在C区5出现一条紫红色条带，T区 4不出现紫红色条带(如图2c所示)，结果为阴性，说明血清中不含M2型抗线粒体抗体；如 C区5不出现紫红色条带，无论T区4是否有条带出现(如图2dde所示)，都说明试纸失 效。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例一抗原组成应用于本试纸的抗原蛋白是针对M2的靶抗原即线粒体的2-氧酸脱氢酶复合体〔 2-0ADC〕的一些组分丙酮酸脱氢酶(PDC-E》、2_氧酸脱氢酶复合体E2 (BC0ADC-E2)、2_氧 戊二酸脱氢酶复合体E2 (0GDC-E2)，通过基因克隆技术构建重组基因，然后采用原核表达技 术成功表达出全部为人源的M2三个靶抗原蛋白，且成功连接形成抗原蛋白三联体。实施例二抗体制备抗体(a)及抗体(c)、抗体(b)用下述方法来实现胶体金层析法肝病检测试纸的 制备。其中抗人IgG、抗体(c)及抗体(b) —般可通过在动物上经多次皮下(sc)或腹膜内 (ip)注射纯化的免疫原和佐剂而产生。通过将0. 05mg Img免疫制剂(分别针对山羊或小鼠)与3倍体积的Freund’s 完全佐剂混合，将该溶液在皮内多部位注射，一个月后将动物用1/5至1/10原初量的人IgG 的Freund’ s完全佐剂混合液经多部位皮下注射而加强免疫。7 14天后将动物放血，测 定血清抗人IgG滴度。对动物加强免疫直至滴度达到平台期。在许多免疫学教科书中描 述了生产多克隆抗体的方法，例如，陈学清等《免疫学常用实验方法》。通过从被免疫的动 物回收脾细胞并使细胞永生化，例如通过与骨髓瘤细胞融合或通过Epstein-Ban·病毒转 化，并且筛选能表达目的抗体的单克隆抗体(Kohler，Milstein. Derivation ofspecific antibody-producing tissue culture and tumor lines bycell fusion[J]. European Journal of Immunology, 1976 :501-511)。可通过大肠杆菌原核表达克隆化基因来制备重组葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋 白，具体操作方法参见J.萨姆布鲁克等(分子克隆实验指南.[M]，2002 1228-1232)，或购 买商品化的SPA或ftOtein G。实施例三羊抗人IgG标记羊抗人IgG的标记用0. IM碳酸钾调节胶体金pH 8. 0 9. 0，按每毫升胶体金溶 液缓慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 1 %，搅 拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。实施例四兔IgG标记兔IgG的标记用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升胶体金溶 液缓慢加入8 12 μ g兔IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 1 %，搅拌 10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体积的保存 液将沉淀重悬，置4°C备用。实施例五葡萄球菌A蛋白(SPA)的标记SPA蛋白的标记用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升胶体金 溶液缓慢加入10 15 μ gSPA蛋白，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 1 %， 搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体积的 保存液将沉淀重悬，置4°C备用。实施例六鼠抗人IgG的标记鼠抗人IgG的标记用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升胶体 金溶液缓慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体 积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。实施例七本发明所述胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法步骤1，包被膜的制备用包被缓冲液将M2蛋白稀释到1. 0 1. 5mg/mL,调整ΒΙΟ-Dot仪器，喷涂检测线 (T)，靠近结合垫端，距结合垫端约9. 5mm ；用包被缓冲液将羊抗兔IgG稀释到0. 8 1. 5mg/ mL，用ΒΙΟ-Dot仪器喷涂羊抗兔IgG于质控线(C)靠近吸水垫，距吸水垫约9mm。两线距离 约5 8mm，喷线应粗细均勻。37°C烘干，封装备用。其中的包被缓冲液可以是硼酸盐，碳酸盐，磷酸盐，Tris-HCl或Tris-磷酸盐，醋 酸盐，巴比妥，等等，其缓冲液的目的为提供一定pH和离子强度使蛋白包被并牢固包被于 NC膜，其缓冲液pH值一般约为6 9. 5范围内，优选为6. 5 7. 5的中性缓冲范围内，且最 优选缓冲液的PH值为7. 0 7. 4范围内。缓冲液优选为磷酸盐。其中的NC膜可以为任何商品化硝酸纤维素膜，S&S AE99、whatman 8 μ m、 millipore M135,sartorius CN140等。使用的具体的NC膜不是本发明的关键，但是在每次 测定中，上述几种NC膜可以作为优选。不同厂家使用的含不同表面活性剂的不同缓冲液处 理的膜，与所用检测线抗体溶液亲和力有不同程度的差距，也会很大程度造成线条不均勻， 拖带或是弥散的现象，因此运用组装试纸来选择优选的NC膜。2.胶体金溶液制备将0. 01 %的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入每IOOmL HAuCl4溶液加入还原剂 溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7 IOmin出现透明的橙红色。 再用超滤或微孔滤膜(0.45μπι)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备 好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物 时弃用。其中所使用的还原剂可以为柠檬酸三钠(Frens 1973)、鞣酸-柠檬酸三钠(Slot与Gueeze 1985年)、白磷，优选使用柠檬酸三钠，更优选地使用柠檬酸三钠。其中所用玻璃容器应绝对清洁，用前需经酸洗、硅化。其水应为去离子超纯水，电 阻率达18. 2ΜΩ。3.金标抗体的制备参见实施例3、实施例4、实施例5、实施例6。其中所述洗涤液也即保存液为含0.2 大分子蛋白的硼酸盐，碳酸盐，磷酸 盐，Tris-HCl或Tris-磷酸盐，醋酸盐，巴比妥，等等，大分子蛋白可以为牛血清白蛋白、 PEG20000、酪蛋白等，缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，更优选为0. 2% BSA pH7. 2磷酸盐缓冲液。4.结合垫的预处理用缓冲液将聚脂膜浸泡30分钟，37°C烘干。可以用于此目的的缓冲液包括(a)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% TritonX-IOO ；(b) 1% PVAU% BSA,0. 05% PR0CLIN 300、0. 1% TritonX-100, ρΗ7· OPBS ；(c) 1% PVAU% BSA、0. 05% PR0CLIN 300, ρΗ7· 0 PBS ；(d)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% Tween-20 ；(e)含有 PVA、0. 71 % Na3PO4U% BSA.0. 05% NaN3、0. 1 % Tween-20,pH7. OPBS ； 本文所述测定法优选的缓冲液是缓冲液(a)，因为它具有区别阴阳性样品的最大分辨率。 PR0CLIN 300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去污和亲水作用。5.结合垫的制备将金标抗人IgG (a)和金标抗体(b)按一定比例混合，用BIO-Dot仪器0. 5 4 μ 1/ cm喷涂在预处理的聚脂膜上，25°C 30°C干燥，待干燥完毕之后，封袋，置2°C 8°C备用。6.样品垫的处理将样品垫按45mL/片用处理液均勻洒涂于样品垫上，于37°C烘干后，用铝箔袋封
装 备用ο可以用于此目的的缓冲液包括(a)0.05M Borax,0. OlMPBS(pH7. 0) ,0. 1% Sodium CaseinU % PEG20000、2 % BSA、0. 05 % NaN3 ； (b)0. 05M Borax,0. 01MPBS (pH 7. 0)、0. 1 % Sodium CaseinU % PEG20000、2 % Casein,0. 05 % NaN3 ； (c) 0. 05M Tris-cl(pH 7.0)、 0. 01MPBS、0. 1% Sodium CaseinU% PEG20000,2% Casein,0. 05% Na 。本文所述测定法 优选的缓冲液是缓冲液(a)，因为它具有区别阴阳性样品的最大分辨率，NaN3起防腐作用。7.原材料预裁剪玻璃纤维膜的裁切用裁切机将玻璃纤维膜切成与PVC胶板等长度即长^cm，宽 2. km，置干燥房间备用。吸水纸的裁切用裁纸机将吸水纸切成与PVC板等长度即长^cm,宽3cm，置干燥 房间备用。聚脂膜的裁切用裁纸机将其切成与PVC板等长度即长^cm,宽1cm，置干燥房备用。将硝酸纤维素膜、吸水纸、聚脂膜、玻璃纤维膜按图1所示依次层叠在PVC塑料底 板上，组成大板。组装车间温度应控制在25°C 37°C，湿度20% 30%。
8.切条用切条机将大板切成单人份，每人份宽度按照一定要求切成2. 5mm 4mm的宽度， 随机抽检，灵敏度能检出室内质控样品(即弱阳性样本)，条带显色程度达到如图2d，且无 非特异性条带，则产品通过质控规定成为合格产品。9.组装、包装将1人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸的样品垫，结 果显示窗对应检测区和控制区，组装车间温度应控制在25°C 37°C，湿度20 % 30 %。再 与一包干燥剂、说明书、样品加样器封装在外包袋里，于4 25°C避光保存。实施例八确定金标抗体(a)和金标抗体(b)的混合比例以金标羊抗人IgG和兔IgG为例来说明比例的确定，其他抗体如鼠抗人IgG和兔 IgG、葡萄球菌A蛋白和兔IgG、链球菌G蛋白和兔IgG也可据此方法来确定。1.在实施例7的步骤3中，所述两者混合比例确定具体为通过预实验基本确定 金标兔IgG的0D20，用ΒΙΟ-Dot喷量1 μ 1/cm喷于结合垫上，用0. OlMPBS为上样缓冲液，即 能得到预期的颜色强度的条带，确定兔IgG的应用OD喷量为1 μ 1。2.随后将金标羊抗人IgG进行梯度稀释到终浓度0D100、80、60、40、20，然后将金 标兔IgG稀释到终浓度0D20，用ΒΙΟ-Dot将以上金标羊抗人IgG和金标兔IgG混合物喷量 为3μ 1/cm喷于处理好的聚酯膜，将制备的包被膜、结合垫、样本垫、吸水垫依次粘贴于塑 料底板上，用阳性血清、临界参考值血清、阴性血清为调试对象。判定依据阳性血清的检测 线(T)和质控线(C)两者的条带颜色强度一致为依据，临界参考值血清能出现，阴性血清无 条带出现的那个OD值，即为这批的应用量。通过本试验得出0D20 40较为符合要求。实施例九试纸组成及试剂配制本发明提供的一种胶体金层析法肝病检测试纸的组成是在支撑塑料PVC板(7) 上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜(3)、结合垫O)、样品垫(1)、吸水垫G)。所述 的结合垫( 上包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)，所述硝酸纤维素包被膜( 有检测线 和质控线，检测线(T)包被有M2型线粒体抗原蛋白(5)，质控线处(C)包被有抗体(c)，其 中，M2型线粒体抗原蛋白来源于商品化的纯化基因工程抗原蛋白，或者自行制备。将重组表达的M2型线粒体抗原蛋白引入到胶体金层析法肝病检测试纸，能实现 血液样本中的M2型抗线粒体抗体的检测，能快速、便捷地辅助诊断原发性胆汁肝硬化。本发明所述的胶体金层析法肝病检测试纸，所用的试剂配制如下1.包被缓冲液的配制9gNacl、l. 15gNa2HP04,0. 23g NaH2P04、IOgSucrose、 0. 5gEDTA溶于IL超纯水中，过滤置于4°C备用。2. HAuCl4的配制用超纯水溶解氯金酸，配成溶液，置4°C备用，有效期四个 月。IOOOmL HAuCl4溶液配方IOg HAuCl4、超纯水定容至1000mL。3.1%柠檬酸三钠(Sodium Citrate)的配制用超纯水溶解Sodium Citrate，配 成1 %溶液，0. 22 μ m膜滤过，现配现用。4.0. IMK2CO3的配制用超纯水配制，0. 22 μ m膜滤过，置4°C备用，有效期一个月。 IOOOmL 0. IM K2CO3 溶液配方:13. 8g K2CO3 ；超纯水定容至 IOOOmL05. 10% BSA的配制用超纯水配制，0. 05%叠氮钠(NaN3)，0. 22 μ m膜滤过，置4°C 备用，有效期两周。IOOOmL 10% BSA溶液配方100gBSA，0. 5g NaN3 ；超纯水定容至lOOOmL。
6.洗涤液也即保存液的配制2% BSA,0. 05% (NaN3) >0. OlM pH 7. 2PBS，0. 22 μ m 膜滤过，置 4°C备用，有效期两 周。IOOOmL 标记洗涤保存液配方:20g BSA,0. 5g NaN3、0. OlM pH 7. 2 PBS 定容至 IOOOmL07.金标稀释液的配制IOOOmL 稀释液的配制2. 423g tris，lOgBSA，0. 2gNaN3 溶于超纯水中，调 pH 8.0， 定容到1000mL。用稀释液将金标稀释到工作浓度后，加入20% Sucrose和5%的海藻糖。实施例十样本处理取全血1 5ml,自然凝集5分钟后，3000 5000g/5min lOmin，取上清即得到 待测样品溶液，至少有100 μ 1以上待测样品溶液。用微量加样器吸取以上血清50 70 μ 1样本于样品垫，缓慢加样。或者用吸管将 血清样本缓慢滴加3 5滴于样品垫上，5 IOmin观察结果，根据条带出现情况来判读阴 阳性结果。实施例十一试剂盒的检测和临床性能评估1.稳定性试验1. 1 37 °C加速稳定性将试纸置于37°C进行加速实验，每天取出用室内质控品进行测试，通过阴阳性参 考品(各10份)的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸的稳定性。4个月后结果显示， 质控品的检测结果符合预期，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100%。阴阳性参考品为 10份M2型抗线粒体抗体阳性血清和10份M2型抗线粒体抗体阴性血清。1.2 4°C稳定性实验将试纸置于4°C进行常规稳定性实验，每月取出用室内质控品测试，同样通过阴阳 性参考品(各10份)的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸的稳定性。12个月后结果 显示，质控品检测结果符合预期，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100%。18个月后结 果显示，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率仍为100%。M个月后检测结果显示，出现一例 假阴性。综合以上结果说明试纸在2 8°C贮存，2年内是稳定的。2.诊断灵敏度从临床中收集到100份确诊为原发性胆汁肝炎(PBC)病人的血清，用自制的胶体 金试纸按照说明书上的操作步骤对上面收集到的PBC病人血清进行检测。5min后统计结果 如下
权利要求
1.一种胶体金层析法肝病检测试纸，包括有硝酸纤维素包被膜、结合垫、样品垫、吸水 垫，它们依次粘贴在底板上，其特征在于所述的结合垫包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)，所述的硝酸纤维素包被膜上有检测线(T)和质控线(C)，其中的检测线包被有M2型线粒体抗原蛋白，其中的质控线(C)包被有抗体(C)。
2.根据权利要求1所述的胶体金层析法肝病检测试纸，其特征在于抗体(a)为抗人 IgG单克隆抗体或抗人IgG多克隆抗体，或葡萄球菌A蛋白(SPA)或链球菌G蛋白(Protein G)中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的胶体金层析法肝病检测试纸，其特征在于抗体(a)中的多 克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中的一种，抗体(a)中的单克隆抗体为鼠源或 兔源中的一种。
4.根据权利要求1所述的胶体金层析法肝病检测试纸，其特征在于抗体(b)和抗体 (c)均为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种，其中(b)和(c)可发生特异性结合形成免疫复 合物。
5.根据权利要求4所述的胶体金层析法肝病检测试纸，其特征在于抗体(b)和抗体 (c)中的多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中的一种，单克隆抗体为鼠源或兔源 中的一种。
6.根据权利要求1所述的胶体金层析法肝病检测试纸，其特征在于检测线上包被的 蛋白为通过原核表达克隆化基因获得的M2型线粒体抗原蛋白。
7.一种胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法，该试纸如前述的权项1-6所述，该试 纸由硝酸纤维素包被膜、结合垫、样品垫、吸水垫和底板共同组成，其特征在于该方法包括 有以下步骤步骤1，抗原的制备，是通过原核表达克隆化基因获得M2线粒体抗原蛋白， 以及包被膜的制备，是用包被膜缓冲液稀释抗原蛋白至浓度为1. 0 1. 5mg/mL，将抗 体(c)稀释到0. 8 1. 5mg/mL,以1 10 μ 1/cm硝酸纤维素膜上，置放于37°C烘干备用， 以及金标抗体的制备，是用0. IM碳酸钾调节胶体金pH 7.0 9. 0，按每毫升胶体金 溶液缓慢加入4 25 μ g蛋白，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 5%，搅拌 10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体积的保存 液将沉淀重悬，置4°C备用，以及结合垫的制备，是经处理液浸渍处理的聚脂膜，烘干后，将金标抗体(a)和金标抗 体(b)混合后，以0. 5 4μ 1/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，25°C 30°C干燥后，置 于2°C 8°C的环境下备用，以及样品垫的制备，是经处理液浸渍处理的玻璃纤维膜，于37°C烘干后备用； 步骤2，在底板上顺次相互搭接粘贴经前述步骤1所制作完成的硝酸纤维素包被膜、结 合垫、样品垫、吸水垫；步骤3，对步骤2所制作完成的材料，切割成试纸条。
8.根据权利要求7所述的胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法，其特征在于所述 的步骤1中，金标抗体的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至8. 0 9. 0，按每毫 升胶体金溶液缓慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度/0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一 初始体积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。
9.根据权利要求7所述的胶体金层析法肝病检测试纸条的制备方法，其特征在于所 述的步骤1中，金标抗体的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至7. 0 8. /0，按每毫 升胶体金溶液缓慢加入8 12 μ g兔IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体 积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。
10.根据权利要求7所述的胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法，其特征在于所述 的步骤1中，金标SPA的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至5. 0 6. /5，按每毫 升胶体金溶液缓慢加入10 15 μ g SPA,搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一初始体 积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。然后将金标SPA OD 20 2 4μ 1/cm喷涂于结合垫， 干燥后备用。
11.根据权利要求7所述的胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法，其特征在于所述 的步骤1中，金标SPA的制备方法为用0. IM碳酸钾调节胶体金pH值至7. 0 8. /0，按每毫 升胶体金溶液缓慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，搅拌10 30min，然后加入BSA至终浓度 0. 5 1 %，搅拌10 30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2 3次，末次用十分之一 初始体积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。然后将金标SPA OD 30 2 4μ 1/cm喷涂于结 合垫，干燥后备用。
12.根据权利要求7所述的胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法，其特征在于所 述的步骤1中，将制备好的金标抗体(a)和金标兔IgG按20 40/15 20比例混合，用 ΒΙΟ-Dot喷膜机以2. 0 4 μ 1/cm喷于预处理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥，封袋，置2°C 8 °C备组装粘板用。
13.根据权利要求7所述的胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法，其特征在于所述 的步骤3中，切割成的试纸条的宽度优选为4mm和3mm两种。
全文摘要
本发明公开了胶体金层析法肝病检测试纸，以及制备方法。本发明所述的胶体金层析法肝病检测试纸，是在PVC塑料底板上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜、结合垫、样品垫、吸水垫而形成的膜条，硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被M2型线粒体抗原蛋白，质控线包被抗体(c)，结合垫包被金标抗体(a)和金标抗体(b)。本发明所述的试纸条引入M2型线粒体抗原蛋白，并对结合垫和样品垫进行了工艺优化，实现了对M2型抗线粒体抗体的高灵敏度、高特异、高准确性的检测性能。
文档编号G01N33/577GK102062777SQ20091019870
公开日2011年5月18日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年11月12日
发明者孙宏彬, 孙潇, 张宇婷, 张玥, 杨超文, 钱杰, 韩永俊, 高成秀 申请人:上海科新生物技术股份有限公司