专利名称：用于分析液体样本中的微粒的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于对保持在样本保持设备中的液体样本中的微粒进行图像分析的方法和装置。
背景技术：
分析液体样本中的微粒，例如确定微粒的浓度和类型，在许多不同的工业领域诸如农业、医药等等中非常重要。研究液体样本中的微粒的传统方法是利用视觉，且很可能借助于显微镜，如果微粒小的话。通常通过用显微镜观察专用计数室诸如BUrker室中的样本，通过手动过程获得微粒浓度。计数室具有以明确界定的小的容积划分该室的格栅。可以使得微粒沉淀在计数室的底部以便允许显微镜聚焦在该室中的所有微粒上，由此便于计数。因此，在可能执行计数前，样本需要沉淀几分钟。然后，通过计数格栅中的每一盒的微粒的数量，确定微粒计数。由需要在执行分析方面富有经验的分析员来手动地获得微粒计数，以便能执行可靠的分析。该分析耗时。此外，由于手动地执行，因此，分析结果可能随执行分析的人员不同而改变。因为计数相对少的微粒以及现有的计数室的容积通常也不精确，因此，分析也是不精确的。存在一些现有的自动分析方法，用于确定液体样本中的微粒浓度。可能通过基于感知阻抗的Coulter原理，确定微粒浓度和大小，特别是用于生物微粒诸如细胞的微粒浓度和大小。在US 5，262，302中描述过用于通过Coulter原理计数白细胞的方法。根据 Coulter原理的测量装置昂贵，因此，是相当大的投资。由此，医院或实验室将不愿投资于一个以上的装置。这意味着分析将需要在集中的地点执行以及病人将需要等待分析结果。在W098/50777中，公开了用于估算牛奶中的体细胞的数量的方法。该方法包括在样本隔室中施加一定容积的样本，以及将从样本隔室通过的电磁信号传送到检测元件阵列上。处理所检测到的电磁信号的强度以及将结果与样本中存在的细胞的数量关联。国际申请WO 2008/010761公开了用于样本中的微粒的计数和分类的装置和方法。该方法包括下述步骤获得样本的至少一个放大的数字图像；识别图像中对焦成像的微粒；以及确定这些微粒的类型和数量。当动物细胞是微粒时，使用由细胞质和细胞膜充当透镜所导致的细胞边缘处的光学现象，来识别对哪些细胞进行了焦点对准的(对焦)成像。 还公开了可以在样本中的不同焦平面处获得图像。然而，未提及这些焦平面应当离开多远。还期望加速和简化用于对液体样本诸如生物样本中的微粒进行分析的现有的自动方法。提供快速、简单和相对廉价的分析方法以便在护理场所(at a point of care)提供分析是特别有利的。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单的分析，使能确定样本中的微粒的容积计数以及识
5别不同的微粒，所述样本诸如血液样本，所述微粒诸如白细胞、血小板或细菌。因此，根据本发明的方面，提供一种用于分析液体样本中的微粒的方法，该样本保持在样本保持设备中，该方法包括通过图像采集设备，在样本保持设备内不同焦平面处采集所述样本的多个图像；以及通过图像分析器，分析所述图像，用于识别在所分析的图像的任何一个中对焦成像的样本的微粒；以及对所识别的微粒的每一个，识别在所述分析图像的哪一个中识别出该微粒，以及使用各自的图像分析那些微粒，其中那些微粒在所分析的图像的任何一个中已经被识别为对焦成像，而所述各自图像中的各自的微粒已经被识别为对焦成像；其中，在不同的、基本上平行的焦平面处采集所述多个图像，所述平面彼此分开一距离，所述距离小于10微米；其中，对每一微粒，通过如下步骤来实现对所对焦成像的微粒的所述识别；找到可辨别微粒的图像；确定由微粒占据的图像的区域和不能辨别出微粒的图像的区域间的光强的最大差值；确定可辨别出相同微粒的其他图像中的光强的相应差值；以及识别光强的差值最高的图像；由此将该微粒视为在该识别的图像中被对焦。通过在不同焦平面处采集多个图像，能覆盖更多容积的样本，其中，这些微粒仍然被对焦成像。由此还可以使用更大的样本保持设备，其中，可以增加垂直于焦平面的样本深度。如果分析包括浓度确定，则这对较低浓度的微粒也可以实现，因为增加了分析的容积。在采集图像前，不需要等待样本沉淀。在微粒处于悬浮的状态下就可以对样本进行成像。通过在不同焦平面处采集多个图像，以及确定在哪一图像中对哪些微粒进行了对焦成像，也可以确定每个微粒在样本中多深处。由此，例如可以将两个或更多重叠的微粒彼此公开，因为它们存在于样本中的不同深度处。另外，通过在不同焦平面处采集多个图像以及确定在哪一图像中对哪些微粒进行了对焦成像，可以确定垂直于焦平面的微粒尺寸，因为可以计算出每个微粒在多少个图像中被对焦，这些图像在不同但相邻的焦平面处获取。然而，这当然依赖于微粒相对于各焦平面间的距离足够大。焦平面间的较小距离意味着可以更好对焦成像微粒，即使以更高的放大率。因此， 当减小焦平面间的距离时，也可以成像更小的微粒用于分析。并且，鉴于上面讨论的在不同焦平面处采集多个图像的优点随着减小距离而放大，可以更详细地成像和分析微粒。可以通过例如移动置于样本和图像采集设备间的透镜或其他光折射器，实现从一个焦平面移向另一个。为了将焦平面移动诸如根据本发明的一小段距离，例如，可以将压电电动机用于移动透镜。这种电动机还具有能快速地并以高精度移动透镜的优点。焦平面基本上彼此平行并且垂直于光轴，该光轴从图像采集设备延伸并通过样本。图像分析器分析多个图像以便识别对焦成像的微粒，诸如细胞。这允许对相对厚的样本采集图像，同时仅计数或者以另外方式分析对准焦点的微粒。通过确保仅计数对焦的微粒，即，当足够清楚详尽地成像微粒时，在样本中可以执行对微粒的类型的识别，该样本可以同时用来确定样本中微粒的统计上可靠的容积计数。通过进一步减小焦平面间的距离，能放大减小焦平面间的距离的优点。因此，该距离优选小于5微米，更优选小于2微米，甚至1. 8微米或更小，特别是1. 6微米或更小。当识别出哪些图像中对焦成像了哪些微粒时，优选将在不同焦平面处采集的不同图像彼此相比较。特定微粒典型地在具有不同焦平面的几个不同图像中是可辨别的，其中， 所述图像的焦平面彼此相邻(即分开小于10微米的距离)。为识别在哪一图像中该特定微粒得以在最佳焦点处成像，可以将各个图像的对比度用作选择标准。因此，确定由特定微粒占据的图像的区域和无微粒可辨别的图像的区域即背景间的光强的最大差值。用相同的方式研究可辨别出相同微粒的其他图像。因此，能识别相对于特定微粒显示最大对比度的图像，以及将该微粒视为在该识别的图像中被对焦。然后对在所采集的图像的任何一个图像中可辨别的所有微粒，重复相同的过程。此外，作为互补或替换，基于像素或样本方差(variance)可以实现识别在所采集的图像的哪一个图像中对焦成像了哪些微粒。像素方差可以带偏差(biased，S2n)或进行过偏差校正(S2im)。根据下述公式，计算偏差校正后的像素方差
权利要求
1.一种用于分析液体样本中的微粒的方法，该样本保持在样本保持设备中，该方法包括通过图像采集设备，在所述样本保持设备内不同焦平面处采集所述样本的多个图像；以及通过图像分析器，分析所述各图像，用于识别在所分析的图像的任何一个图像中对焦成像的样本的微粒，以及用于对每一个所识别的微粒，识别在所分析的图像中的哪一个图像中识别出所述微粒，以及使用各自的图像分析那些微粒，其中那些微粒在所分析的图像的任何一个图像中已经被识别为对焦成像，而在所述各自的图像中各自的微粒已经被识别为对焦成像；其中，在不同的、基本上平行的各焦平面处采集所述多个图像，所述各平面彼此分开一距离，所述距离小于10微米；其中，对每一微粒，通过如下步骤来实现对所对焦成像的微粒的所述识别 找到可辨别所述微粒的图像；确定由该微粒占据的图像的区域与无微粒可辨别的该图像的区域之间的光强的最大差值；确定可辨别出相同微粒的其他图像中的光强的相应差值；以及识别光强差值最高的图像； 由此将所述微粒视为在该识别的图像中被对焦。
2.一种用于分析液体样本中的微粒的方法，所述样本保持在样本保持设备中，所述方法包括通过图像采集设备，在所述样本保持设备内不同焦平面处采集所述样本的多个图像；以及通过图像分析器，分析所述各图像，用于识别在所分析的图像的任何一个图像中对焦成像的样本的微粒，以及用于对所识别的每一个微粒，识别在所述分析的图像的哪一个图像中识别出所述微粒，以及使用各自的图像分析那些微粒，其中那些微粒已经在所分析的图像的任何一个图像中被识别为对焦成像，而在各自的图像中各自的微粒已经被识别为对焦成像；其中，在不同的、基本上平行的焦平面处采集所述多个图像，所述各平面彼此分开一距离，所述距离小于10微米；其中，对每一微粒，通过如下步骤实现对所对焦成像的微粒的所述识别 找到可辨别所述微粒的图像；限定所找到的图像的区域，所述区域包括所述微粒及其最近的围绕物； 确定所限定区域的像素方差；确定可辨别出相同微粒的其他图像的相应区域的像素方差；以及识别像素方差最高的图像； 由此将所述微粒视为在该识别的图像中被对焦。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述距离小于5微米，优选小于2微米。
4.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，所述方法进一步包括叠加所述多个图像，由此获得了包含在不同焦平面中对焦成像的所有微粒的叠加图像。
5.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，每一焦平面仅采集一个图像。
6.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，采集至少10个，优选至少100个，以及更优选至少200个图像。
7.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，将样本保持设备配置成呈现用于成像的液体样本，以便样本具有至少100微米，优选至少200微米，更优选至少500微米的、垂直于所述焦平面的深度。
8.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，将样本保持设备配置成呈现用于成像的液体样本，以便样本具有1毫米或更小的、垂直于所述焦平面的深度。
9.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，所述液体样本是生物样本。
10.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，所述液体样本是血液样本。
11.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，所述微粒是真核细胞，优选是哺乳动物细胞，更优选是人体细胞。
12.如权利要求1-10的任何一个所述的方法，其中，所述微粒是细菌、病毒或血小板。
13.如权利要求1-10的任何一个所述的方法，其中，所述微粒具有小于20微米，优选小于10微米，更优选小于2微米的最大直径。
14.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，分析已经识别为对焦成像的那些微粒包括确定微粒的类型和数量，所述类型由微粒的物理特征来区分，由此确定样本中的不同类型的微粒的比率。
15.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，在采集图像前，已经通过染色剂染色了待分析的微粒。
16.如权利要求15所述的方法，其中，在样本保持设备内，液体样本与染色剂接触，染色剂采用干燥的形式，由此在样本中溶解染色剂。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中，所述染色剂是荧光染色剂。
18.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，所述图像采集设备是数码相机。
19.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，通过图像采集设备采集的图像是对液体样本的放大而采集的，所述放大通过光折射器诸如透镜来实现。
20.如上述权利要求的任何一个所述的方法，其中，通过将样本的成像面积与由多个图像所覆盖的样本的深度相乘，来定义样本的成像容积。
21.一种测量装置，用于分析液体样本中的微粒，该装置包括图像采集设备，图像分析器，配置成固定保持液体样本的样本保持设备的固定器，以及置于所述图像采集设备和所述固定器之间的光折射器；其中，当所述样本保持设备由所述固定器固定时，可在样本保持设备内逐步移动焦平面，由此所述图像采集设备适于在样本保持设备内的不同焦平面处采集所述样本的多个图像，所述不同焦平面基本上彼此平行、以及彼此分开一距离，所述距离小于10微米；其中，配置所述图像分析器来分析至少一个采集的图像，用于识别哪些微粒被对焦成像，以及分析已经被识别为对焦成像的那些微粒；其中，对每一微粒，通过如下步骤实现对所对焦成像的微粒的所述识别找到可辨别所述微粒的图像；确定由该微粒占据的图像的区域与无微粒可辨别的该图像的区域之间的光强的最大差值；确定可辨别出相同微粒的其他图像中的光强的相应差值；以及识别光强的差值最高的图像； 由此将所述微粒视为在该识别的图像中被对焦。
22.一种测量装置，用于分析液体样本中的微粒，该装置包括图像采集设备，图像分析器，配置成固定保持液体样本的样本保持设备的固定器，以及置于所述图像采集设备和所述固定器之间的光折射器；其中，当所述样本保持设备由所述固定器固定时，可在样本保持设备内逐步移动焦平面，由此所述图像采集设备适于在样本保持设备内的不同焦平面处采集所述样本的多个图像，所述不同焦平面基本上彼此平行、并彼此分开一距离，所述距离小于10微米；其中，配置所述图像分析器来分析至少一个采集的图像，用于识别哪些微粒被对焦成像，以及分析已经识别为对焦成像的那些微粒；其中，对每一微粒，通过如下步骤来实现对所对焦成像的微粒的所述识别 找到可辨别微粒的图像；限定所找到的图像的区域，所述区域包括所述微粒及其最近的围绕物； 确定所限定区域的像素方差；确定可辨别相同微粒的其他图像的相应区域的像素方差；以及识别像素方差最高的图像； 由此将所述微粒视为在该识别的图像中被对焦。
23.如权利要求21或22所述的装置，其中，所述距离小于5微米，优选小于2微米。
全文摘要
本发明涉及用于分析液体样本中的微粒的方法，该样本保持在样本保持设备中，该方法包括通过图像采集设备，在样本保持设备内不同焦平面处采集所述样本的多个图像；以及通过图像分析器，分析所述图像，用于识别，如果有的话，在每一个图像中，样本的哪些微粒被对焦成像，以及分析已经被识别为对焦成像的那些微粒，其中，在不同的、基本上平行的焦平面处采集所述多个图像，所述平面彼此分开一距离，所述距离小于10微米。本发明还涉及适用于本发明方法的装置。
文档编号G01N33/493GK102216954SQ200980102032
公开日2011年10月12日 申请日期2009年1月16日 优先权日2008年1月18日
发明者斯特兰·林德博格, 汤姆·奥勒森, 马丁·沃尔维克 申请人:海默库伊公司