专利名称：荧光检测方法以及荧光检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光检测方法以及荧光检测装置，该方法和装置通过对在缓冲液中含 有细胞或细菌等测定对象物并流动的流体的流动照射激光，从而检测测定对象物发出的荧光。
背景技术：
在医疗、生物领域中使用的流式细胞仪中装有荧光检测装置，该装置通过照射激 光，接收由测定对象物的荧光色素发出的荧光，以识别测定对象物的种类。具体来说，流式细胞仪通过荧光试剂对在缓冲液中含有细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等 生物物质而构成测定对象物的混浊液实现标记化，施加压力以每秒IOm以内程度的速度在 管路内流动的鞘液中使测定对象物流动以形成层状鞘液。通过对这种流动中的测定对象物 照射激光，接受生物物质的荧光色素发出的荧光，用该荧光作为标记进行识别来识别生物 物质。在该流式细胞仪中，例如，计测细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白质等在细胞内相对量， 并能够在短时间内分析这些物质的运动。另外，采用了细胞分选仪，其通过用荧光识别特定 类型的细胞或染色体，能够在仅产生识别的细胞或染色体的状态下，在短时间内进行选择 收集。在其使用中，要求能够在短时间内从荧光的信息识别更多的测定对象物。在以下的专利文献1中披露了荧光检测装置。在该荧光检测装置中，对从激光源 部射出的激光的强度进行时间调制，并在生物物质上照射该激光。接收此时从试剂发出的 荧光，以利用激光相对于调制信号的相位差信息计算出生物物质发出的荧光的荧光松弛时 间。因此，能够识别许多荧光的种类，并且，能够以特别短的时间识别荧光信号。专利文献1 特开2006-226698号公报
发明内容
发明所要解决的课题上述专利文献1的装置虽然在生物物质等发出的荧光的荧光强度较强的情况下， 能够正确识别接收的荧光的种类，但是，其产生的问题为生物物质等发出的荧光的发光区 域会受到限制，并且，在荧光强度较弱的情况下，不一定能够正确地识别。例如，由于在预先测定荧光松弛时间已知的荧光色素发出的荧光的情况下，在荧 光强度较弱时，求得的荧光松弛时间与已知的荧光松弛时间会产生偏差，因此，会产生不能 正确识别的问题。此外，每当生物物质通过激光的照射位置时，均求出荧光松弛时间常数， 在以横轴为求出的多个荧光松弛时间常数、纵轴为其频率的频率曲线中，以较宽的方式形 成频率曲线的山形形状，从而不能正确识别多个荧光。目前，大多采用的是将生物物质中的限于极为狭小的局部区域作为荧光的发光区 域的生物物质。在这种情况下，由于减小了生物物质发出的荧光的发光区域，因此，荧光强度较弱。所以，以上述方式，荧光的正确识别会越发困难。因此，本发明的目的在于为了解决上述问题，提供了一种荧光检测方法以及荧光 检测装置，该方法和装置在通过照射激光检测生物物质等测定对象物发出的荧光时，与以 往相比，能够正确计算出荧光松弛时间常数。为了实现上述目的，本发明提供了荧光检测方法，在对在缓冲液中含有测定对象 物并流动的流体的流动，通过照射使用设定的频率的调制信号并调制了光强度的激光，从 而受光装置接收通过的测定对象物发出的荧光以检测荧光时，其特征在于，具有第1步骤，在该步骤中，在测定对象物通过激光的照射位置时，收集上述受光装置 接收的荧光的第1荧光信号；和第2步骤，在该步骤中，在上述测定对象物通过上述激光的 照射位置后，在激光的照射位置没有上述测定对象物的状态下，收集上述受光装置接收的 荧光的第2荧光信号；和第3步骤，在该步骤中，使用上述第2荧光信号相对于上述调制信 号的第2相位差信息，调整上述第1荧光信号相对于上述调制信号的第1相位差，通过上述 调整从而求出测定对象物的发出的荧光的荧光信号相对于上述调制信号的第3相位差信 息，并从该求出的第3相位差信息中，求出测定对象物的发出的荧光的荧光松弛时间常数。此时，上述第1以及第2相位差信息优选为由与上述调制信号同相的信号成分的 值与相对于上述调制信号存在90度相位差的信号成分的值构成的数据。另外，上述第3相 位差信息优选为在每个成分中从上述第1相位差信息的数据中扣除上述第2相位差信息的 数据所得的数据。另外，本发明提供了荧光检测装置，该装置是通过对在缓冲液中含有测定对象物 并流动的流体的流动照射激光，从而检测测定对象物发出的荧光的荧光检测装置，其特征 在于，具有激光光源部，其使用设定的频率的调制信号并向上述流动射出对光强度进行调制 的激光；和受光部，其是输出通过激光的照射而发出的荧光的荧光信号；和计时检测部，其 是检知上述测定对象物通过激光照射位置的时间；和处理·分析部，其根据上述检知的时 间，收集上述受光部接收的荧光的第1荧光信号，进而，在上述测定粒子通过激光的照射位 置后的激光照射位置处没有上述测定粒子的状态下，收集上述受光部接收的荧光的第2荧 光信号，并使用上述第2荧光信号相对于上述调制信号的第2相位差信息，调整上述第1荧 光信号相对于上述调制信号的第1相位差，通过上述调整从而求出测定对象物发出的荧光 的荧光信号相对于上述调制信号的第3相位差信息，并从该所求出的第3相位差信息中，求 出测定对象物的发出的荧光的荧光松弛时间常数。此时，上述第1以及第2相位差信息优选为由与上述调制信号同相的信号成分 的值与相对于上述调制信号存在90度相位差的信号成分的值构成的数据。另外，上述处 理·分析部优选通过在每个成分中，从上述第1相位差信息的数据中扣除上述第2相位差 信息的数据，求出上述第3相位差信息的数据。发明效果在本发明的荧光检测方法以及荧光检测装置中，不仅测定对象物发出的荧光，而 且测定对象物通过激光的照射位置后的缓冲液发出的荧光均作为荧光检测的检测对象。其 原因在于在测定对象物的荧光比较弱的情况下，不能忽视缓冲液本身发出的荧光。在测定 对象物通过激光照射位置时所计测的荧光中，虽然除了测定对象物发出的荧光以外，还含有缓冲液本身发出的荧光，在本发明中，由于对于测定对象物通过激光的照射位置后的缓 冲液发出的荧光也进行荧光的计测，因此，使用该计测结果，能够准确求出测定对象物发出 的荧光的相位差信息。因此，与以往相比，能够正确、迅速计算出荧光松弛时间常数。
图1为采用了本发明的荧光检测装置的流式细胞仪的概括结构图。 图2为概括结构图，其显示了采用本发明的荧光检测装置的激光源部的一个例
子。图3为概括结构图，其显示了在本发明的荧光检测装置中使用的受光部的一个例 子。
一个例子。
图4为概括结构图，其显示了在本发明的荧光检测装置中使用的控制·处理部的图5为用于说明图4所示的控制·处理部的IQ混合器的视图。
图6说明了由本发明的荧光检测装置进行的荧光松弛时间常数
图7显示了荧光强度的时间变化的概括形式。
符号说明
10 流式细胞仪
12 试剂
20 信号处理装置
22 激光光源部
22r R光源
22g G光源
22b B光源
23a1 23a2, 26b1,26b2,分光镜
23c,26a透镜组
24，26受光部
26c” 26c2, 26c3带通滤波器
27a 27c光电转换器
28控制·处理部
30管路
32回收容器
34r，34g，34b激光驱动器
35,48,56能量分流器
40信号生成部
42信号处理部
44控制器
46发射器
50，52，54a，54b，54c，64 放大器
58a,58b,58cIQ混合器
62低频滤波器
66A/D转换器80
分析装置
具体实施例方式下面，以适于采用实现本发明的荧光检测方法的本发明的荧光检测装置的流式细 胞仪为基础进行详细说明。图1为采用了由强度调制的激光形成的荧光检测装置的流式细胞仪10的概括结 构图。在以下说明的实施例中，虽然是以悬浮在缓冲液中的具有荧光色素的生物物质M作 为测定对象物进行说明的，但是，具备生物物质M以外的规定的荧光色素，在缓冲液中同时 含有与生物物质M形成生物结合的微粒以及生物物质M，可以以生物物质M以及微粒作为测 定对象物。流式细胞仪10具有信号处理装置20，该装置通过照射激光，照射试剂12，该试剂 12是悬浮在缓冲液中的发出荧光的生物物质M构成的，检测出试剂12中的生物物质M具备 的荧光色素发出的荧光的荧光信号以进行信号处理；以及，分析装置(计算机)80，其用于 根据由信号处理装置20获得的处理结果进行试剂12中的测定对象物的分析。信号处理装置20具有激光源部22 ；和受光部24、26 ；和控制·处理部28，该控 制 处理部28含有为了用规定的调制频率对从激光源部22发出的激光进行强度调制而生 成调制信号的调制部，以及识别试剂12发出的荧光信号的信号处理部；和管路30，其是在 高速流形成的鞘液中使含有生物物质M的缓冲液构成的试剂12流动，以形成流动管。在管路30的出口设有回收容器32。在流式细胞仪10中也可以采用的结构为为 了通过激光的照射在短时间内识别并分离试剂12中的生物物质M的细胞而配置分选仪，以 便在各个回收容器中进行分离。激光源部22为射出波长不同的3种激光，例如λ i = 405nm, λ 2 = 533nm以及λ 3 =650nm等的激光的部分。设置透镜组，以便使激光聚集在管路30中心规定的位置，从而 使激光在该聚集位置处形成试剂12的测定点。该测定点对应本发明中的激光照射位置。图2显示了激光源部22的结构的一个例子。激光源部22为射出具有350nm SOOnm的可视光范围的波长并经强度调制的激 光的部分。激光源部22具有R光源22r，其主要将红色激光R作为CW(连续波)激光射出并 以规定的频率调制该CW激光的强度；和G光源22g，其将绿色激光G作为CW (连续波)激光 射出并以规定的频率调制该CW激光的强度；和B光源22b，其主要将蓝色激光B作为CW(连 续波)激光射出并以规定的频率调制该CW激光的强度。另外，激光源部22还具有分光镜23ai，23a2，是透过特定波长范围的激光并反射 其它波长范围激光的分光镜23a1; 23a2 ；和透镜组23c，是使由激光R，G以及B构成的激光聚 集在管路30中的测定点的透镜组23c ；和激光驱动器34r，34g以及34b，是分别驱动R光源 22r，G光源22g以及B光源22b的激光驱动器34r，34g以及34b ；和能量分流器35，是将供 给的信号分配给激光驱动器34r，34g以及34b的能量分流器35。作为射出这些激光的光源，例如采用半导体激光。
激光例如为5 IOOmW程度的输出。另一方面，调制激光强度的频率(调制频率) 的周期比激光松弛时间常数稍长一些，例如为10 50MHz。分光镜23&1为透过激光R并反射激光G的分光镜，分光镜23a2为透过激光R和G 并反射激光B的分光镜。通过这种结构合成激光R，G和B，形成照射测试点的试样12的照射光。R光源22r，G光源22g以及B光源22b以预定的波长带域振荡，以便激光R、G和 B激发荧光色素而发出特定的波长带域的荧光。通过激光R、G和B激发的荧光色素附着在 进行测定的生物物质M上，在生物物质M作为测定对象物通过管路30时，在测定点处受到 激光R、G和B的照射并以特定的波长发出荧光。进而，在生物物质M通过测定点之后，优选 紧接在通过之后，在没有生物物质M的状态下以一定时间对缓冲液照射激光，从而进行缓 冲液发出的荧光的检测。受光部24以夹持管路30并与激光源部22相对的方式设置，并设有光电变换器， 该光电变换器利用通过测定点的生物物质M使激光向前方散射，从而输出表示生物物质M 通过测定点的检测信号。从该受光部24输出的信号供给至控制·处理部28，并且，在控 制·处理部28中作为获知生物物质M通过管路30中的测定点的定时的触发信号。另外，在以生物物质M通过测定点的时间为T，以生物物质M的平均直径为D，以 流过流动管的生物物质M的速度为V，以激光的测定点的辉点幅度为W时，时间T达到T = (D+W)/V。该时间T是已知的值。信号处理装置20以由受光部24生成的触发信号作为计 测开始的计时，开始荧光的检测，并继续进行时间T的2倍的时间2 · T的间隔计测。所谓 计测，为在时间T期间，接收试剂12发出的荧光，以利用后面所述的控制·处理部28进行 信号处理，并将相位差信息供给至分析装置80。通过该计测，在生物物质M通过测定点时， 收集受光部26接收的荧光的第1荧光信号，在生物物质M通过测定点之后在测定点没有生 物物质M的仅有缓冲液的状态下，能够收集受光部26接收的荧光的第2荧光信号。另一方面，受光部26与从激光源部22射出的激光的射出方向垂直，并且，相对于 管路30中试剂12的移动方向垂直布置，并设有光电转换器，其用于接收由利用测定点照射 的试剂12发出的荧光。图3为概括结构图，其显示了受光部26的一个例子的概括的结构。在图3中所示的受光部26具有聚集来自试剂12中的生物物质M的荧光信号的透 镜组26a，和分光镜26b1;26b2，和带通滤波器26Cl 26c3，和光电子倍增管等的光电转换器 27a 27c。透镜组26a以使射入受光部26的荧光聚集在光电转换器27a 27c的受光面上 的方式构成。分光镜26b1;26b2为反射具有规定范围的波长带域的荧光并使除此之外的荧光透 过的分光镜。为了通过带通滤波器26Cl 26c3进行滤波并由光电转换器27a 27c获取 具有规定波长带域的荧光，设定分光镜26b1;26b2的反射波长带域以及透过波长带域。带通滤波器26Cl 26c3为设置在各个光电转换器27a 27c的受光面的前面并 仅透过具有规定波长带域的荧光的滤波器。对应荧光色素的发出的荧光的波长带域设定透 过的荧光的波长带域。光电转换器27a 27c为设有例如带有光电子倍增管的传感器并将由光电面接收的光转换为电信号的传感器。此处，由于接收的荧光作为相对于激光的调制信号具有相位 差信息的光信号被接收，因此，输出的电信号形成具有相位差信息的荧光信号。该荧光信号 由增幅器增幅并被供给至控制·处理部28。如图4所示，控制 处理部28具有信号生成部40、和信号处理部42和控制器44。 信号生成部40和控制器44形成产生规定频率的调制信号的光源控制部。控制 处理部28 对应于本发明中的第1荧光信号以及第2荧光信号的收集部分。信号生成部40为生成以规定的频率调制(振幅调制)激光强度的调制信号的部 分。具体来说，信号生成部40具有振荡器46、能量分流器48以及放大器50，52，该信 号生成部为在将所生成的调制信号供给至激光源部22的能量分流器35的同时，将其供给 至信号处理部42的部分。将调制信号供给至信号处理部42的原因如后面所述，将从光电 转换器27a 27c输出的荧光信号(第1荧光信号、第2荧光信号)用作用于检波的参考 信号。另外，调制信号为具有规定频率的正弦波信号，并以范围10 50MHz的频率被设定。信号处理部42为使用从光电转换器27a 27c输出的荧光信号，通过激光的照 射处理含有试剂12发出的荧光的相位差信息的信号的部分。信号处理部42具有放大器 54a 54c，其使从光电转换器27a 27c输出的荧光信号增幅；和能量分流器56，其用于 分配从信号生成部40供给各个被增幅的荧光信号的作为正弦波信号的调制信号；和IQ混 合器58a 58c，这些混合器以该调制信号作为参照信号并使其与被增幅的荧光信号合成。IQ混合器58a 58c为将从光电转换器27a 27c供给的荧光信号，从信号生成 部40供给的调制信号作为参考信号进行合成的装置。具体来说，如图5所示，各个IQ混合 器58a 58c使参考信号与荧光信号(RF信号)相乘以计算出含有荧光信号的cos成分 (与参考信号同相位的信号成分)和高频率成分的处理信号，同时，将使参考信号的相位90 度偏移的信号与荧光信号相乘，以计算出含有荧光信号的sin成分(相对于参考信号存在 90度相位差的信号成分)和高频成分的处理信号。将含有该cos成分的处理信号以及含有 sin成分的处理信号供给至控制器44。控制器44以由信号生成部40生成的规定频率的调制信号(正弦波信号)的方式 实施控制，进而，从含有利用信号处理部42求出的荧光信号的cos成分的值以及sin成分 的值的处理信号除去高频成分，从而求出荧光信号的cos成分的值以及sin成分的值。具体地说，控制器44具有系统控制器60，其提供用以控制信号处理部20中各个 部分的动作的指令，同时，管理流式细胞仪10的整个动作；和低频滤波器62，其用于从由信 号处理部42运算出的cos成分和sin成分相加高频成分所得的处理信号中除去高频成分； 和放大器64，其使除去高频成分的cos成分和sin成分的处理信号增幅；和A/D转换器66， 其对被增幅的处理信号采样。系统控制器60为了进行激光的强度调制，规定了振荡器46的振荡频率。控制器44通过低频滤波器62进行滤波处理并且由放大器64使除去了高频信号 的COS成分和Sin成分的值增幅，进而，通过用A/D转换器66进行采样，从而将被数字化的 cos成分和sin成分的处理信号供给至分析装置80。分析装置80为求出生物物质M发出的荧光的荧光松弛时间常数(荧光松弛时间) 并根据荧光松弛时间常数识别试剂12中生物物质M的荧光种类的部分。使附着了规定荧光色素的微粒含在试剂12中，也可以研究生物物质M是否进行生物结合等的生物物质M的 特性。另外，分析装置80形成本发明中计算出荧光松弛时间常数的处理部并由计算机 构成。生物物质M发出的荧光的荧光松弛时间常数的计算是利用悬浮在缓冲液中的生 物物质M通过测定点时发出的荧光的第1荧光信号相对于调制信号的相位差信息，以及紧 接在生物物质M通过测定点后缓冲液发出的荧光的第2荧光信号的相位差信息进行的。如上所述，基于由受光部24生成的触发信号开始计测，继续进行生物物质M通过 测定点的时间T的2倍的时间2 · T的间隔计算。因此，从计测开始直至最初的时间T，检 测悬浮在缓冲液中的生物物质M通过测定点时的荧光，在时间T 时间2 · T，检测紧接生 物物质M通过测定点后的缓冲液发出的荧光。因此，供给至分析装置80的cos成分和sin 成分的处理信号含有从计算开始至最初时间T的荧光的相位差信息，即缓冲液和生物物质 M发出的荧光的相位差信息；以及，直至时间T 时间2 ·Τ的荧光的相位差信息，即缓冲液 发出的荧光的相位差信息。生物物质M发出的荧光的荧光松弛时间常数的计算，具体地说，从控制器44供给 的上述cos成分的值和Sin成分的值形成向量成分的计测向量用作含有相位差信息的数据 进行使用。关于该计测向量，将悬浮在缓冲液中的生物物质M通过测定点时的第1荧光信 号的计测向量作为Pms，将在紧接生物物质M通过测定点之后的缓冲液发出荧光时的第2荧 光信号的计测向量作为Pmb，将由生物物质M发出的荧光的cos成分的值和sin成分的值构 成的生物物质M的向量作为Ps，此时，由Ps = Pms-Pmb表示该计测向量。在图6中，显示了计 测向量Pms，Pmb与生物物质M的向量Ps的关系。在图6所示的视图中，在横轴采用激光调制 信号的cos成分(实数部分)的值(振幅)，在纵轴采用了 sin成分(虚数部分)的值(振 幅)。S卩，本发明中的相位差信息形成由与调制信号同相的信号成分(cos成分)的值与相 对于调制信号存在90度相位差的信号成分(sin成分)的值构成的数据。实际上，在生物物质M通过测定点时从试剂12发出的荧光含有生物物质M发出的 荧光和缓冲液发出的荧光。因此，在分析装置80中，在这些荧光混合的状态下，由受光部26 接收荧光。所以，用分析装置80获得的计测向量Pms含有生物物质M发出的荧光的荧光信 号的cos成分的值和sin的值，和缓冲液发出的荧光的荧光信号的cos成分的值和sin的 值。因此，通过从计测向量Pms中扣除紧接在生物物质M通过测定点后缓冲液发出的荧光的 荧光信号的cos成分的值和sin成分的值构成的计测向量Pmb，能够计算出生物物质M发出 的荧光向量Ps。即，通过按每一成分从计测向量Pms中的cos成分的值，sin成分的值扣除 计测向量Pmb中的cos成分的值和sin成分的值，计算生物物质M发出的荧光的向量Ps。在生物物质M的荧光较弱的情况下，形成背景成分并在生物物质M的荧光的荧光 信号中所含的缓冲液发出的荧光是不能忽视的。在本实施例中，在紧接生物物质M通过测 定点之后的一定时期(时间T 时间2 ·Τ的时期)，例如，以与生物物质M通过测定点的时 间T相同的时间长度，通过计算缓冲液发出的荧光，如上所述，计算出生物物质M发出的荧 光的向量Ps。图7为显示试剂12发出的荧光的荧光强度的时间变化的图表。图7中的区 域R1为生物物质M发出的荧光与缓冲液发出的荧光混合的区域。另一方面，区域R、2为仅 存在缓冲液发出的荧光的区域。这样，将从受光部24输出的触发信号的生成作为计测的开始计时以进行计测开始 时间T之间的区域R1的计测，之后立刻进行区域R、2的计测。另 外，按每一由光电转换器27a 27c获得的荧光信号进行向量Ps的计算。分析装置80根据以此方式求出的生物物质M发出的荧光的向量Ps求出荧光松弛 时间常数(荧光松弛时间)，荧光松弛时间常数是使用每当生物物质M通过测定点时供给的 计测向量Pms，Pmb计算出的。因此，在分析装置80中，制作表示计算出的荧光松弛时间常数 的频率的频率图，对荧光松弛时间常数进行统计处理，以求出荧光松弛时间常数的平均值 以及分散。因此，能够识别生物物质M发出的荧光。另外，荧光松弛时间常数的计算方法取决于荧光色素发出的荧光的荧光松弛时间 常数，例如，在1次松弛过程中表示荧光的情况下，根据以下公式计算。τ = 1/ω · tan θ s此处，θ s为计算出的向量Ps中相对于cos成分的轴的倾斜角度(参见图6)， ω为激光的调制信号的频率，τ为荧光松弛时间常数。荧光松弛时间常数τ为若将脉 冲照射激光时的初期荧光强定为Itl,则从该时刻至荧光强度达到Ic/ek为自然对数的底， e与2.71828)的时刻的时间。以上述方式构成流式细胞仪10。这种流式细胞仪10的信号处理装置20首选根据控制器44发出的指示，由发射器 46产生规定频率的调制信号，该信号由放大器50增幅并被供给至激光源部22以及信号处 理部42。在这种状态下，试剂12流过管路30，从而形成流体。流体例如在100 μ m的流动路 径中具有ι IOm/秒的流速。若对通过测定点的生物物质M照射激光，则将在受光部24检测生物物质M的通过 的检测信号作为触发信号输出至控制器44。在控制器44，将该检测信号作为触发信号，将计测开始的指示信号供给至各个部 分。由于从激光源部22射出的激光用于在测定点处激励试剂12中的荧光色素，通过 该激光照射，荧光色素产生荧光并由受光部26接收。因为激光以规定的频率调制强度，因 此，荧光也与其对应，以规定的频率调制荧光强度。从由这种激光照射发出的荧光色素产生的荧光相对于调制了激光强度的调制信 号，具有相位差的信息。此时，在生物物质M通过测定点的数μ 数10μ秒期间，以规定频率进行振幅调 制的激光照射在生物物质M上。激光的调制频率例如为10 50MHz。在生物物质M通过测定点的计测开始 时间T的期间，进行荧光的计测，即图7所 示的区域R1的计测并获得第1荧光信号，紧接在经过时间T之后，进而进行时间T的间隔、 荧光差别的计测，即进行图7所示的区域R2的计测，从而获得第2荧光信号。通过受光部26的光电转换器27a 27c接收并输出的第1，第2荧光信号由放大 器54a 54c增幅，通过IQ混合器58a 58c，与从信号生成部40供给的正弦波信号即调 制信号合成。在IQ混合器58a 58c中，生成作为正弦波信号的调制信号(参照信号)与第1、 第2荧光信号相乘所得的合成信号，同时，生成使相对于作为正弦波信号的调制信号(参照信号)相位偏移90度的信号与荧光信号相乘合成的信号。接着，将相对于第1荧光信号生成的2个合成信号输送至控制器44的低频滤波器 62，除去高频成分，取出第1荧光信号的cos成分和sin成分。使该第1荧光信号的cos成 分和sin成分的信号增幅，对其进行A/D转换并将其输送至分析装置80。A/D转换在从受 光部24发出的触发信号的时刻同期进行，并进行取样。同样，将相对于第2荧光信号生成的2个合成信号输送至控制器44的低频滤波器 62，除去高频成分，取出第2荧光信号的cos成分和sin成分。使该第2荧光信号的cos成 分和sin成分的信号增幅，对其进行A/D转换并将其输送至分析装置80。从光电转换器27a 27c供给通过计测获得的第1，第2荧光信号，在工作时间进 行这种信号处理，并逐次对分析装置80供给信号处理后的cos成分的值和sin成分的值。在分析装置80中，在逐次收集所供给的cos成分的值和sin成分的值之后，求出 使用该COS成分的值和Sin成分的值计算出的区域R1的计测向量Pms的平均值与区域R2的 计测向量Pmb的平均值的差分，从而求出生物物质M的向量Pm。在分析装置80中，进而，使 用该向量？111，根据公式τ = 1/ω · tan θ 3求出荧光松弛时间常数τ。这样，在本实施例中，紧接在计测生物物质M通过测定点时的荧光之后，也计测缓 冲液发出的荧光，并使用这些计测结果的信息计算荧光松弛时间常数。因此，能够正确、并 有效地计算出生物物质M的荧光的荧光松弛时间常数。还存在的方法为每当生物物质M通过测定点时，不进行由缓冲液发出的荧光的 计测，并预先计测从缓冲液发出的荧光的荧光松弛时间常数以将其存储保存在分析装置80 中，根据生物物质M通过测定点时的荧光的计测结果以及从在分析装置80中存储的缓冲液 发出的荧光的荧光松弛时间，运算出生物物质M的荧光的荧光松弛时间。可是，在一定时期存在多种、大量应计测的试剂12，并且，在缓冲液的种类不同的 情况下，用上述方法是不能迅速应对的。另外，在导入荧光蛋白液的细胞等存在于培养基 中，并使其稀释以形成试剂12的情况下，由于通过稀释的程度，在试剂12中所含的培养基 的量变化，缓冲液发出的荧光松弛时间也变化，因此，上述方法不能应对。进而，由于生物物 质M通过其生物体活动，缓冲液的成分也变化，缓冲液发出的荧光松弛时间也变化，因此， 上述方法不能应对。本实施例能够消除这种不良情况，从而能够迅速、正确地计算出荧光松弛时间常数。在本实施例中，求出计测向量Pms以及Pmb的方法代替在信号处理部42以及控制器 44中的上述处理方法，将激光的调制信号作为输入信号，使用频率分析器求出将从IQ混合 器58a 58c输出的处理信号作为应答信号的传递函数的频谱数向量，求出该频谱数向量 中的实数部的值以及虚数部的值，以此时的DC成分的实数部的值以及虚数部的值作为计 测向量Pms，Pfflb的向量成分，求出生物物质M发出的荧光的向量Ps = Pms-Pmb,从而也能够计 算出荧光松弛时间常数。虽然上面对本发明的荧光检测方法以及荧光检测装置进行详细说明，但是，本发 明不应限定上述实施例，在不脱离本发明的主要思想的范围下，也可以进行各种改进和变 化。
权利要求
荧光检测方法，对在缓冲液中含有测定对象物并流动的流体的流动，照射使用设定的频率的调制信号并调制了光强度的激光，通过上述照射从而受光装置接收通过的测定对象物发出的荧光，以检测荧光时，其特怔在于，具有第1步骤，在该步骤中，在测定对象物通过激光的照射位置时，收集上述受光装置接收的荧光的第1荧光信号；和第2步骤，在该步骤中，在上述测定对象物通过上述激光的照射位置后，在激光的照射位置没有上述测定对象物的状态下，收集上述受光装置接收的荧光的第2荧光信号；和第3步骤，在该步骤中，使用上述第2荧光信号相对于上述调制信号的第2相位差信息，调整上述第1荧光信号相对于上述调制信号的第1相位差，通过上述调整从而求出测定对象物的发出的荧光的荧光信号相对于上述调制信号的第3相位差信息，并从该求出的第3相位差信息中，求出测定对象物的发出的荧光的荧光松弛时间常数。
2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，上述第1以及第2相位差信息为由与上述调 制信号同相的信号成分的值和相对于上述调制信号存在90度相位差的信号成分的值构成 的数据。
3.根据权利要求2所述的荧光检测方法，上述第3相位差信息为在每个成分中从上述 第1相位差信息的数据中扣除上述第2相位差信息的数据所得的数据。
4.荧光检测装置，该装置是通过对在缓冲液中含有测定对象物并流动的流体的流动照 射激光，从而检测测定对象物发出的荧光的荧光检测装置，其特征在于，具有激光光源部，其使用设定的频率的调制信号并向上述流动射出对光强度进行调制的激 光；和受光部，其输出通过激光的照射发出的荧光的荧光信号；计时检测部，测知上述测定对象物通过激光照射位置的时间；处理·分析部，其根据上述测知的时间，收集上述受光部接收的荧光的第1荧光信号， 进而，在通过激光的照射位置后的激光照射位置处没有上述测定粒子的状态下，收集上述 受光部接收的荧光的第2荧光信号，并使用上述第2荧光信号相对于上述调制信号的第2 相位差信息，调整上述第1荧光信号相对于上述调制信号的第1相位差，通过上述调整从而 求出测定对象物发出的荧光的荧光信号相对于上述调制信号的第3相位差信息，并从该所 求出的第3相位差信息中，求出测定对象物的发出的荧光的荧光松弛时间常数。
5.根据权利要求4所述的荧光检测装置，上述第1以及第2相位差信息为由与上述调 制信号同相的信号成分的值和相对于上述调制信号存在90度相位差的信号成分的值构成 的数据。
6.根据权利要求5所述的荧光检测装置，其特征在于上述处理·分析部通过从上述 第1相位差信息的数据中在每个成分中扣除上述第2相位差信息的数据，求出上述第3相 位差信息的数据。
全文摘要
本发明提供了荧光检测方法以及荧光检测装置，该方法和装置通过在照射激光以检测测定对象物发出的荧光时，与以往相比，能够正确计算出荧光松弛时间常数。其中，在测定对象物通过以规定频率的调制信号调制光强度的激光的照射位置时，收集受光装置接收的荧光的第1荧光信号。进而，在测定对象物通过激光的照射位置后，在激光的照射位置没有测定对象物的状态下，收集受光装置接收的荧光的第2荧光信号。使用收集的第1荧光信号和第2荧光信号，求出测定对象物的发出的荧光的荧光信号相对于调制信号的相位差信息，并从所求出的测定对象物发出的荧光的荧光信号的相位差信息中，求出测定对象物的荧光松弛时间常数。
文档编号G01N15/14GK101960289SQ20098010775
公开日2011年1月26日 申请日期2009年2月18日 优先权日2008年3月4日
发明者中田成幸, 星岛一辉, 林弘能 申请人:三井造船株式会社