专利名称：一种pcr荧光分子信标探针技术定量检测人类白细胞抗原b27基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因的定量检测技术，具体地说， 是一种通过内参标准品实现靶基因定量的PCR荧光分子信标探针定量检测技术在HLA-B27 基因检测方面的应用。
背景技术：
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)及其相关的血清阴性脊柱关节病 (Spondyloarthropathies, SpA)是一组与免疫学密切相关的疾病，其免疫与遗传发病机制 至今不明。SpA是一类疾病，包括:AS、反应型关节炎(ReA)、银屑病关节炎(PsA)、肠炎性关 节炎(IBDA)、瑞特综合征(旧)和未分化脊柱关节病(USpA)。它们具有如下一些共同特点 ①以HLA-B27为主要遗传易感因子；②以肌腱-骨附着点炎症和滑膜炎为基本的病理改变； ③常常累及骶髂关节、脊椎和各大关节；④类风湿因子阴性；⑤可进行性发展至脊柱强直、 关节强直。AS是典型的SpA病例，以中轴关节慢性炎症为主，多发于青壮年男性，主要侵犯 人体骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织及外周关节，也可累及内脏及其他组织，严重者可 发生脊柱畸形和关节强直，丧失劳动力。AS起病隐匿、病程长、迁延不愈、致残率高，在中国 人群中的发病率约为0.3%。因此，我国约有400万患者。约有10%的AS患者在幼年发病， 称为幼年型AS，其早期临床表现主要以外周关节为主，表现为下肢或上肢关节肿胀、压痛、 活动受限等症状，与类风湿关节炎、风湿性关节炎等疾病的表现相似，容易引起误诊。近30年的研究表明，AS在免疫医学领域与人类白细胞抗原B27(HLA_B27)密切 相关。流行病学调查显示，HLA-B27阳性率在AS患者高达96%以上，而正常人群中仅为
-5%。但HLA-B27与AS的致病机理的关系目前并不十分清楚，一种观点认为可能是 HLA-B27分子和一些自身肽段结合，形成肽-HLA复合体在自身细胞膜上表达后，能被相应 的CD4+T细胞识别，从而导致T细胞对自身靶细胞的杀伤，造成组织变性、器官受损。另一 种观点认为是多重因子交互影响，其中基因与环境因素(如细菌感染)扮演重要角色。国 外研究发现动物脊柱受累程度与转化的HLA-B27基因数量有关，故HLA-B27的基因型与AS 的发病风险和病情关系密切。纯合子每个细胞有两个HLA-B27基因，发病风险更高，病情更 重。杂合子每个细胞只有一个HLA-B27基因，发病风险相对较低，病情也更轻。因此，定量 检测HLA-B27基因，区分纯合子与杂合子，是临床预测和诊断AS及其相关的SpA最有效的 方法。以往临床上多采用免疫学分型方法检测HLA-B27，需要采取较多新鲜血液并分 离白细胞，然后采用ELISA方法或流式细胞仪检测，整个操作时间长，而且要高质量的 HLA-B27抗体，价格较贵，细胞保存时间短，不便操作，不易普及。此外，HLA-B27与其他的 HLA-B族抗原之间只有很小的差异，免疫学检测存在较高的交叉反应，假阳性率较高，影响 检测的准确性。因此，免疫学检测方法已经逐渐被基因检测方法取代。目前临床上HLA-B27的基因检测方法主要有序列特异性引物PCR(PCR-SSP)法和PCR序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)法。PCR-SSP法是针对HLA-B27基因的特异性序 列，设计序列特异性引物，特异性引物与HLA-B27完全互补，然后用此特异性引物扩增一段 HLA-B27特异性序列。在一定条件下，只有有HLA-B27基因的个体才能扩增出目的片段，而 其他HLA I类抗原基因因不能与特异性引物完全互补，无目的扩增产物，结果呈阴性。此法 除引物设计讲究外，与普通的PCR反应没有实质性差别，检测的准确性不够高，容易出现假 阳性和假阴性结果。PCR-SSO是用通用引物PCR扩增出目的产物后，再用HLA-B27序列特异 性探针和通用探针检测PCR扩张产物中是否含有HLA-B27特异性序列。此法比PCR-SSP检 测的准确性更高，可部分避免假阳性结果。但此法需要较长的检测时间，整个操作复杂，不 利于大批量样品检测。Tyagi和Krammer于1996年设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探 针，这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光，他们将其命 名为分子信标(Molecular Beacon)。分子信标具有背景信号低，灵敏度高、特异识别性强、 操作简单，不必与未反应的探针分离即可实时检测，可用于活体分析等优点，在生物化学分 析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。当无靶序列存在时，荧光信标呈茎环 结构，茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热 能的形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，荧光信标探针的环序列与靶序 列特异性结合，形成的双链体比分子信标的茎环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分开，此 时荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收，可以检测到荧光(见附图)。本发明是基于荧 光分子信标探针设计的HLA-B27基因的定量检测技术。参考文献[1]刘春明，彭媛.强直性脊柱炎与HLA-B27关系的研究.广西医学，2005，27 (4) 550-552[2]陈国敏，王东辰.人白细胞抗原-B27在诊断强直性脊柱炎中的意义.检验医 学与临床，2007，4 (10) 931-933[3]Brown M, Kennedy L, Mae A, et al. Susceptibility to ankylosing spondylitis in twins :therole of genes,HLA and enviroment. Arthritis Rheum,1997, 40(10) 1823-1828[4]Sayer C, Cassell S, Christiansen T. HLA-B27typing by specific amplification without DNAextraction. Mol Pathol,1999,52(5) :300_304[5]Lee H, Choi J, Yoon Y, et al. Quantitative analysis of HLA-B27by flow cytomeyry using CD3gating in seronegative spondy!arthropathies. Clin Exo Rheumatol,1999,17(2) :191_195[6]李维.强直性脊柱炎与HLA-B27.国外医学临床生物化学与检验分册，2002， 12(4) 235-238.[7]Khan Ma. Update the twenty subtypes of HLA-B27. Curr Opin Rheumatol, 2000，12 (4) 235-238[8]胡志东，王金良.强直性脊柱炎实验室诊断的研究进展.医学综述，2008， 14(11) 1678-1681[9]黄烽，杨春花.强直性脊柱炎临床及免疫发病机制的研究进展.中国免疫学杂志，2001，17(6) :281-285[10]杨柚岩，丁建新.未分化脊柱关节病的诊断与治疗.临床内科杂志，2003， 20(10) :510-51
发明内容
本发明目的是克服上述已有的HLA-B27蛋白或基因检测方法缺陷，提供一种以 HLA-B27基因为检测目标的PCR荧光分子信标探针定量检测技术，通过内参标准品定量，实 现HLA-B27基因的灵敏、准确、快速定量检测。实现上述目的的具体方案是本发明涉及的PCR荧光分子信标探针技术定量检测人类白细胞抗原B27基因的方 法，包括以下步骤a、在HLA-B27基因中选择一段小于150bp的片段做为靶序列，合成一对引物；b、根据靶序列中位于两个引物之间的序列，设计合成一个荧光分子信标探针，其 淬灭基团为DABCYL，荧光基团为FAM ；C、构建一个引物与靶序列完全相同、片段长度与靶序列长度相似，但序列内容与 靶序列不同的内参标准品。并根据内参标准品的序列，设计合成一个荧光分子信标探针，其 淬灭基团为DABCYL，荧光基团为R0X。d、提取待测标本中的DNA，使用步骤a中的引物、步骤b中的探针、步骤c中的内参 标准品及其探针，与其它PCR反应体系成分混合，进行PCR反应，扩增靶基因片段和内参标 准品片段。e、分别检测反应结束后的FAM和ROX荧光值。根据各自外标曲线计算靶序列和内 参标准品的反应终拷贝数。f、根据内参标准品的起始拷贝数和反应终拷贝数计算PCR扩增效率，根据靶序列 的终拷贝数和PCR扩增效率计算靶序列的起始拷贝数。本发明方法的PCR反应体系与常规PCR反应体系类似，包括高温聚合酶、dNTPs、缓 冲体系、引物、模板和探针。靶序列(Seq1)为1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC CGTCTTCCCA GTCCACCGTC CCCATCGTGG51 GCATTGTTGC TGGCCTGGCT GTCCTAGCAG TTGTGGTCAT CGGAGCTGTG101 GTCGCTGCTG TGATGTGTAG GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA引物序列为引物 l(Seq 2) :5，TTC CCT TCC TTT CCC AGA G3，引物 2 (Seq 3) :5，TTC CCT ACC TGA GCT CTT CCT3，靶序列荧光分子信标探针序列(Seq 4)为5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G3，内参标准品核酸序列(Seq 5)为1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC GTACCACTGG CATCGTGATG GACTCCGGTG51 ACGGGGTCAC CCACACTGTG CCCATCTACG AGGGGTATGC CCTCCCCCAT101 GCCATCCTGC GTCTGGACCT GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA
内参标准品荧光分子信标探针序列(Seq 6)为5' CAG GCT CCC CAC ACT GTG CCC ATC TAC GAG AGC CTG3，外标曲线是指采用一系列浓度已知的阳性DNA片段，与其荧光分子信标探针杂 交，检测荧光值，根据荧光值和DNA片段浓度绘制的标准曲线。本发明方法的PCR反应体系可选用重蒸水做为阴性质控。本发明方法使用的仪器为普通常规PCR仪，如果PCR仪有加热盖，则PCR反应体系 可无需使用覆盖剂，否则，最好用与水不相容的油性覆盖剂(如石蜡、矿物油等)覆盖。本发明中PCR反应时三步法PCR，包括变性、退火和延伸三步。变性的温度是94°C， 时间为10秒；退火的温度是50°C，时间为10秒；延伸的温度是72°C，时间为10秒。进行 30次循环。本发明中，FAM荧光激发光采用波长494nm的单色光，FAM检测波长为522nm ；ROX 荧光激发光采用波长588nm的单色光，ROX检测波长为608nm。本发明可定量的HLA-B27基因的核酸起始拷贝数范围为IO3拷贝/ml-1011拷贝/ ml ο本发明是针对AS及其相关的SpA疾病临床诊断而设计，具有快速准确、灵敏特异 等特点。突出特点在于使用了内参标准品在同一反应体系内扩增，通过计算内标的扩增效 率来计算样品中的靶序列起始拷贝数，同时外标曲线采用不经PCR反应的系列阳性DNA片 段，内外标联用可避免实验操作或扩增效率不同而引起的误差。使用本发明的有益效果是， 可以快速准确、灵敏特异的检测出AS及其相关的SpA疾病相关基因，并且对其定量，故可判 断出患者是否HLA-B27基因阳性纯合子，对其发病风险和病情轻重做出预测。检测手段采 用PCR方法，灵敏度高，低至1拷贝核酸也可检出；荧光分子信标探针具有茎环状结构，检测 特异性极高，对靶序列中单个碱基的错配、缺失或插入突变均能检测出来；内标的定量范围 可达IO3拷贝/ml-1011拷贝/ml ；反应与检测直接在封闭体系中进行，有效消除核酸交叉污 染；可以进行大规模自动化检测，无需实时定量，对仪器设备要求低，可在各级医疗机构推 广使用。
附图是荧光分子信标探针核酸检测原理图。当无靶序列存在时，荧光信标呈茎环 结构，茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热 能的形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，荧光分子信标探针的环序列与 靶序列特异性结合，形成的双链体比分子信标的茎环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分 开，此时荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收，可以检测到荧光。待测样品中靶序列拷 贝数越多，荧光信号越强。
具体实施例方式实例一、白细胞抗原B27基因(HLA-B27)测定试剂盒(PCR荧光分子信标法)1、白细胞抗原B27基因(HLA-B27)测定试剂盒(PCR荧光分子信标法)的组成(1)靶序列为HLA-27基因的相对保守区——第5外显子及其前后DNA序列共 142bp。荧光分子信标探针位于一对引物之间区域。
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引物序列为引物 l(Seq 2) :5，TTC CCT TCC TTT CCC AGA G3，引物 2 (Seq 3) :5，TTC CCT ACC TGA GCT CTT CCT3，靶序列荧光分子信标探针序列(Seq 4)为5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G3，(2)内参标准品的构建过程如下首先将靶序列扩增出来，插入质粒pBluSKM的HindIII和I^stI位点之间，得到质 粒pBluSKM-HLAB27。然后将人类β-Actin基因第4外显子部分DNA序列(102bp)扩增 出来，替换质粒pBluSKM = HLAB27靶序列中20 = 121的片段，得到内参标准品一质粒 pBluSKM—betaactin。内参标准品荧光分子信标探针序列(Seq 6)为5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G3，内参标准品(质粒pBluSKM_HLAB27)起始浓度为IO3拷贝/ml。(3)试剂盒的配制过程如下配制5XBuffer(50mM ρΗ8· 0Tris_HCl、20mM MgCl2,250mM KC1、0. 5% BSA)，再配 成PCR反应液每人份反应液模板0. 5 μ 1引物1，2各 0·5μ1荧光分子信标探针0. 5 μ 1dNTPs5 μ 1Taq 酶(IOU)5μ 15 X Buffer10 μ 1ddH2028 μ 1_总量50 μ 1(4)外标曲线绘制过程如下绘制靶序列外标曲线采用质粒pBluSKM_HLAB27做为靶序列的外标。配置浓度梯 度为 IO3拷贝 /ml、IO5拷贝 /ml、IO7拷贝 /ml、IO9拷贝 /ml、IO11 拷贝 /ml 的pBluSKM_HLAB27， 与靶序列荧光分子信标探针杂交，494nm激发，522nm检测FAM荧光值，绘制标准曲线并存储。绘制内参标准品外标曲线采用质粒pBluSKM-betaactin做为靶序列的外标。 配置浓度梯度为IO3拷贝/ml、105拷贝/ml、107拷贝/ml、109拷贝/mlUO11拷贝/ml的 pBluSKM-betaactin，与内参标准品荧光分子信标探针杂交，588nm激发，608nm检测ROX荧 光值，绘制标准曲线并存储。2、使用白细胞抗原B27基因(HLA-B27)测定试剂盒(PCR荧光分子信标法)进行 检测以体积从大至小的顺序，向PCR反应管中加入^μ 1 ddH20,10 μ 1 5 X Buffer, 5μ 1 dNTPs,5y 1 Taq 酶(IOU)，0· 5μ 1 引物 1，0. 5 μ 1 引物 2，0. 5 μ 1 荧光分子信标探针，0.5μ1待测基因组DNA样品。用移液器吹打混勻4-6次，放入PCR仪。采用以下程序进行 PCR反应
权利要求
1.一种以人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因为检测目标的PCR荧光分子信标探针定 量检测技术，包括以下步骤a、在HLA-B27基因中选择一段小于150bp的片段做为靶序列，合成一对引物；b、根据靶序列中位于两个引物之间的序列，设计合成一个荧光分子信标探针，其淬灭 基团为DABCYL，荧光基团为FAM ；c、构建一个引物与靶序列完全相同、片段长度与靶序列长度相似，但序列内容与靶序 列不同的内参标准品。并根据内参标准品的序列，设计合成一个荧光分子信标探针，其淬灭 基团为DABCYL，荧光基团为R0X。d、提取待测标本中的DNA，使用步骤a中的引物、步骤b中的探针、步骤c中的内参标准 品及其探针，与其它PCR反应体系成分混合，进行PCR反应，扩增靶基因片段和内参标准品 片段。e、分别检测反应结束后的FAM和ROX荧光值，根据各自外标曲线计算靶序列和内参标 准品的反应终拷贝数。f、根据内参标准品的起始拷贝数和反应终拷贝数计算PCR扩增效率，根据靶序列的终 拷贝数和PCR扩增效率计算靶序列的起始拷贝数。
2.权利要求1所述的PCR荧光分子信标探针定量检测技术，其特征在于所述的待测核 酸为人类白细胞抗原B27基因第5外显子及其前后DNA序列共142bp。所述的特异性核酸序列(Seq 1)为1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC CGTCTTCCCA GTCCACCGTC CCCATCGTGG 51 GCATTGTTGC TGGCCTGGCT GTCCTAGCAG TTGTGGTCAT CGGAGCTGTG 101 GTCGCTGCTG TGATGTGTAG GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA 所述的引物序列为引物 l(Seq 2) :5，TTC CCT TCC TTT CCC AGA G 3， 引物 2 (Seq 3) :5，TTC CCTACC TGAGCT CTT CCT 3， 所述的荧光分子信标探针序列(Seq 4)为 5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G 3'
3.权利要求l.c所述的内参标准品，其特征在于所述的核酸为人类β-Actin基因第4 外显子部分DNA序列与权力要求2所述的引物序列构建的片段，共142bp。所述的内参标准品核酸序列(Seq 5)为1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC GTACCACTGG CATCGTGATG GACTCCGGTG 51 ACGGGGTCAC CCACACTGTG CCCATCTACG AGGGGTATGC CCTCCCCCAT 101 GCCATCCTGC GTCTGGACCT GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA 所述的内参标准品荧光分子信标探针序列(Seq 6)为 5' CAG GCT CCC CAC ACT GTG CCC ATC TAC GAG AGC CTG 3'
4.权利要求1所述的PCR荧光分子信标探针定量检测技术在血细胞、组织细胞、人体液 中脱落细胞等各种样本的检测。
全文摘要
一种人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因的定量检测技术，其特征是以HLA-B27基因为检测目标，应用PCR荧光分子信标探针定量检测技术，检测反应终荧光强度，在外标曲线上读出内参标准品和待测样品的PCR反应终浓度。通过计算内参标准品的扩增效率，来定量待测样品的起始拷贝数，实现HLA-B27基因的灵敏、准确、快速定量检测。可应用于强直性脊柱炎(AS)及其相关的血清阴性脊柱关节病(SpA)的临床诊断和风险预测。
文档编号G01N21/64GK102115784SQ20101000156
公开日2011年7月6日 申请日期2010年1月4日 优先权日2010年1月4日
发明者王虹 申请人:王虹