专利名称：一种快速检测微生物的阻抗型传感器及其构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及到对于环境或者人体有害微生物的快速检测，特别是一种快速检测微生物的阻抗型传感器及其构建。
背景技术：
传统的方法用最大可能数法来控制微生物种群的变化，这种方法需要长时间的预富集，然后再通过相关的生化测试，这一系列复杂的过程需要大概15天的时间。另外，酶联免疫反应、荧光免疫杂交技术以及改进的最大可能数法也被用于SRB的检测。尽管这些技术具有很好的应用的前景，当应用与原位在线的检测的时候也会存在一些问题。比如，因为长时间的增长期，SRB需要几天的时间得到足够的代谢产物，从而使得改进的MPN法需要相当长的时间；另外，对于酶链免疫反应来说，尽管一些封闭试剂阻碍非特异性吸附，但是这并不是非常有效。分子生物技术尽管准确度高，但是其操作技术复杂，成本高。最近，利用电化学交流阻抗谱的方法来检测微生物也得到了研究。这种方法主要基于在电极表面固载特异性的抗体来识别和检测微生物。阻抗体系结合氧化还原探针被认为是一种有效的灵敏的方法来检测电极表面修饰的改变。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速检测微生物的阻抗型传感器及其构建。为实现上述目的本发明采用的技术方案为一种快速检测微生物的阻抗型传感器阻抗型传感器以金电极作为载体，载体负载0. l-2mg/ml的纳米金标记的抗体作为识别元件。所述纳米金标记的抗体是10 30nm胶体金中加入抗体溶液和磷酸盐缓冲液，而后将胶体金表面非特异性的位点通过小牛血清白蛋白封闭。所述胶体金中加入0. lmg-2mg/ mL抗体溶液和pH 6. 8-7. 4磷酸盐缓冲液。所述抗体为硫酸盐还原菌的抗体，大肠杆菌的抗体或沙门杆菌的抗体。快速检测微生物的阻抗型传感器的构建1)纳米金标记的抗体10 30nm胶体金中加入抗体溶液和磷酸盐缓冲液，而后将胶体金表面非特异性的位点通过小牛血清白蛋白封闭，待用；金电极的活化2)构建阻抗型传感器将通过电化学方法处理的金电极浸泡在11-羧基硫醇 (MPA)中，然后用交联剂活化羧基，使上述的纳米金标记的抗体修饰到金电极表面，而后用小牛血清白蛋白封闭非特异性的位点，即得到阻抗型传感器。所述步骤1)中胶体金中加入0. lmg-2mg/mL抗体溶液和pH 6. 8-7. 4磷酸盐缓冲液；所述抗体为硫酸盐还原菌的抗体，大肠杆菌的抗体或沙门杆菌的抗体。步骤幻中金电极通过电化学方法处理是先用砂纸和抛光粉依次打磨，然后用超纯水和乙醇清洗干净， 洗净后将电极在硫酸中以-0. 2V-1. 6V之间反复高速扫描，待获得稳定的循环伏安图后，待用。步骤2~)中所述交联剂为1-乙基-3- (3- 二甲氮基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羧基硫代琥珀亚胺(NHS)。本发明所具有的优点本发明提供的纳米颗粒标记的信号放大的阻抗型传感器， 其是结合微生物与抗体的特异性识别和纳米金的信号放大的技术，用其检测SRB和控制微生物种群的变化，能够快速检测对人体和环境有害的微生物。并且对所检测的微生物具有显著的特异性，同时准确性高，与传统的最大可能数法比较具有检测时间短、同时成本低。
图1为本发明实施例阻抗型传感器构建示意图，其中a为抗体直接修饰的传感器， b为纳米金标记的传感器。图2为本发明实施例纳米金颗粒标记的抗体的透射电镜图。图3为本发明实施例纳米金标记传感器的特异性检测结果图。图4为为本发明实施例纳米金标记传感器(黑框)和对照(篮框)检测硫酸盐还原菌的信号图
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步说明。实施例1:1)金电极的活化通过电化学方法处理，即将在铝粉上打磨好的金电极在0. 05M 硫酸溶液中，扫描电位从-0. 2V到1. 6V连续扫描直到其处于稳定2)纳米金标记的抗体(参见图2) 3. 75ml 柠檬酸钠加入到0. 01%沸腾的氯金酸中，强烈搅拌，直至溶液变为棕红色，即可使得到尺寸为10 30nm的胶体金。然后用碳酸钾把胶体溶液的PH调为8. 5左右。取Iml胶体溶液用超纯水清洗，然后加入100 μ 1浓度为lmg/ml的抗体溶液，然后再加入100 μ 1磷酸盐缓冲液，在4°C冰箱中过夜。然后用1 % 小牛血清白蛋白封闭胶体金表面非特异性的位点，待用；所述磷酸盐缓冲液为0. IM KH2PO4, 0. IM K2HPO4然后用HCl或者NaOH来调节缓冲溶液pH，使其pH为6. 8-7. 4。所述抗体为硫酸盐还原菌的特异性抗体(市购)。3)构建阻抗型传感器将通过活化后的金电极浸泡在50mM的MPA中，然后用 IOOmM的EDC和25mM的NHS激活羧基，使上述纳米金标记的抗体修饰到金电极表面，而后用
小牛血清白蛋白封闭胶体金表面非特异性的位，即得到阻抗型传感器；阻抗型传感器以金电极作为载体，用0. l-2mg/ml的纳米金标记的抗体作为识别元件构建而成。所述胶体金中加入0. 5mg-2mg/L抗体溶液和pH 6. 8-7. 4磷酸盐缓冲液。将上述所得纳米金标记的阻抗型传感器被用于检测硫酸盐(1. 8X 107cfu/ml)还原菌。传感器具有很好的特异性，对于硫酸盐还原菌来说其信号强度可以达到310% (参见图3)，图三展示构建纳米金标记的传感器对于硫酸盐还原菌的信号具有显著响应。采用大肠杆菌抗体用于此纳米金标记的传感器，阻抗信号强度会达到120-350%，同样采用沙门杆菌强度的信号会达到100-300%，所以说用纳米金标记的抗体的阻抗传感器会显著的加强。实施例2用实施例1构建的传感器检测一系列的硫酸盐还原菌浓度，从IO1到107cfu/ml。 同时采用未标记纳米金抗体修饰的电极作为对照；所述对照为用上述0. Ι-aiig/mL硫酸盐还原菌的特异性抗体修饰到电化学处理的金电极表面，然后用l_5mg的小牛血清白蛋白封闭非特异性的活性位点，将实施例1传感器和对照传感器电极上分别点加5-50微升的硫酸盐还原菌的菌液，反应池。然后用电化学交流阻抗谱，在0. I-IO5Hz的频率范围，振幅为 25mV,在开路电位下进行电化学实验的测试(参见图4)，实施例1阻抗型传感器检测得到的线性范围是IO2到107cfu/ml，对照传感器的线性范围为IO3到106cfu/ml。由图中可见本本发明传感器具有很好的信号响应。实施例3根据实施例(1)中构建的传感器，用来控制硫酸盐还原菌在增长期的微生物种群变化。同时我们也用传统的最大可能法来控制微生物种群的变化，发现这两种方法具有很好的吻合度。这说明这种纳米金标记的阻抗传感器的信号检测室可靠的，与传统的方法比较，检测所需要时间短，本方法只需要一天时间就可以检测硫酸盐还原菌，而传统的方法需要半个月时间。若想两相比较请具体将实验过程简述，并用数据显示。本发明提供了一种快速而灵敏的检测技术。而且相对于传统的传感器技术来说显著提高了其检测信号强度。并且构建技术方便，参数比较容易控制。相对于利用传统的最大可能数法控制的微生物种群的变化来说，具有很好的控制检测的力度。
权利要求
1.一种快速检测微生物的阻抗型传感器，其特征在于阻抗型传感器以金电极作为载体，载体负载0. l-2mg/ml的纳米金标记的抗体作为识别元件。
2.按权利要求1所述的快速检测微生物的阻抗型传感器，其特征在于所述纳米金标记的抗体是10 30nm胶体金中加入抗体溶液和磷酸盐缓冲液，而后将胶体金表面非特异性的位点通过小牛血清白蛋白封闭。
3.按权利要求2所述的快速检测微生物的阻抗型传感器，其特征在于所述胶体金中加入0. lmg-2mg/mL抗体溶液和pH 6. 8-7. 4磷酸盐缓冲液。
4.按权利要求2所述的快速检测微生物的阻抗型传感器，其特征在于所述抗体为硫酸盐还原菌的抗体，大肠杆菌的抗体或沙门杆菌的抗体。
5.一种按权利要求1所述的快速检测微生物的阻抗型传感器的构建，其特征在于1)纳米金标记的抗体10 30nm胶体金中加入抗体溶液和磷酸盐缓冲液，而后将胶体金表面非特异性的位点通过小牛血清白蛋白封闭，待用；金电极的活化2)构建阻抗型传感器将通过电化学方法处理的金电极浸泡在11-羧基硫醇(MPA) 中，然后用交联剂活化羧基，使上述的纳米金标记的抗体修饰到金电极表面，而后用小牛血清白蛋白封闭非特异性的位点，即得到阻抗型传感器。
6.按权利要求5所述的快速检测微生物的阻抗型传感器的构建，其特征在于所述步骤1)中胶体金中加入0. lmg-aiig/mL抗体溶液和pH 6. 8-7. 4磷酸盐缓冲液；所述抗体为硫酸盐还原菌的抗体，大肠杆菌的抗体或沙门杆菌的抗体。
7.按权利要求5所述的快速检测微生物的阻抗型传感器的构建，其特征在于步骤2) 中金电极通过电化学方法处理是先用砂纸和抛光粉依次打磨，然后用超纯水和乙醇清洗干净，洗净后将电极在硫酸中以-0. 2V-1.6V之间反复高速扫描，待获得稳定的循环伏安图后，待用。
8.按权利要求5所述的快速检测微生物的阻抗型传感器的构建，其特征在于步骤2) 中所述交联剂为1-乙基-3-(3- 二甲氮基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羧基硫代琥珀亚胺(NHS)。
全文摘要
本发明涉及到对于环境或者人体有害微生物的快速检测，特别是一种快速检测微生物的阻抗型传感器及其构建。阻抗型传感器以金电极作为载体，载体负载0.1-1mg/ml的纳米金标记的抗体作为识别元件。构建将通过电化学方法处理的金电极浸泡在MPA中，然后用交联剂活化羧基，使上述的纳米金标记的抗体修饰到金电极表面，而后用小牛血清白蛋白封闭非特异性的位点，即得到阻抗型传感器；本发明提供的纳米颗粒标记的信号放大的阻抗型传感器，其是结合微生物与抗体的特异性识别和纳米金的信号放大的技术，用其检测SRB和控制微生物种群的变化，能够快速检测对人体和环境有害的微生物。并且对所检测的微生物具有显著的特异性，同时准确性高。
文档编号G01N27/327GK102213687SQ201010146750
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者万逸, 张盾 申请人:中国科学院海洋研究所