专利名称：鲁米诺衍生物电化学检测组装膜及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鲁米诺电化学检测传感器及其制备方法。
背景技术：
自从Havery等始于上世纪二十年代观察和报道鲁米诺(luminol)的电 化学发光现象以来，电化学发光分析技术以及电化学发光传感器的发展备受国内外研究者 的广泛关注。电化学发光分析技术(electrochemiIuminescence(ECL)),是利用电解技术 在电极表面产生某些氧化还原物质而导致化学发光，具有方法容易控制、灵敏度高、选择性 强、线性范围宽等优点。在电化学发光的研究中，通过化学修饰的方法将直接或间接参与化 学发光反应的试剂固定在电极上，实验装置尽可能集成化和微型化，被称为电化学发光传 感器(ECL Sensor)。其不但保持了化学发光传感器的优点，如灵敏度高、溶液浓度响应范围 宽等，还表现出额外的优势。例如，可以通过控制产生化学发光反应的电极电位，来提高传 感器的灵敏度。此外，对电极附近产生发光的空间控制也可以提高对分析物的高灵敏检测。 目前，基于鲁米诺的ECL体系，由于发光量子产率高、电化学发光氧化电位低、廉价等优点， 已经被广泛应用构建ECL传感器，实现对生物活性物质以及药物成分的分析检测。由于鲁 米诺的ECL强度直接与鲁米诺或过氧化氢的数量成正比，而胆碱、葡萄糖等生物体内重要 的生物活性分子可以在相应的氧化酶(choline oxidase (CHOD) ；glucose oxidase (GOD)) 的催化下与溶解的氧气反应放出过氧化氢，所以人们不断尝试多种方法以期提高基于鲁米 诺的ECL传感器的性能。由于目前相关研究大都先将间接参加发光反应所需的底物氧化 酶通过适当的方式固定在电极上，然后进行电化学发光研究，所以研究工作集中于酶固定 方法和酶活性的改良。根据报道，酶可以固定在多种支撑底物上，如光诱导交联聚合物，溶 胶_凝胶合成物或预活化膜。但是由上述支撑底物构造的传感器大多存在电荷转移率低、 响应时间长、灵敏度不高、寿命较短等一系列问题，限制了其进一步广泛应用。发明内容本发明的目的是提供一种检测直接、快速高效、选择性好、使用寿命相 对较长、应用范围广的鲁米诺衍生物电化学检测组装膜及制备方法。本发明主要是将鲁米诺改性成为非水溶性衍生物并用其作为电化学检测组装膜 主成分的方法。本发明的具体内容是一、鲁米诺衍生物电化学检测组装膜是一种由鲁米诺衍生物和免疫球蛋白G 混合物作基体，其一侧附着在电极基板上，其另一侧附有氧化酶层的薄膜。该鲁米诺 衍生物为两亲性分子，如①N-鲁米诺-月桂酰胺，其分子式为N-(l，4-diOXO-l，2，3， 4-tetrahydrophthalazin-5-yl) dodecanamide (简称为 LCl 1)，② N-鲁米诺-13-双异丙醇 i^一烷氧基-3，6，9，12，15-五连乙氧基酰胺，其分子式为N- (1，4-dioxo-l，2，3，4-tetrahy drophthalazin-5-yl)-13-undecyloxymethyl-3,6,9,12,15-pentaoxahexacosanamide(简 称为TF46)，③N-鲁米诺-苯甲酰胺，④N-鲁米诺-硬脂酰胺。二、鲁米诺衍生物电化学检测组装膜的制备方法1、鲁米诺衍生物的制备(1)本发明中鲁米诺衍生物是鲁米诺与酰氯反应的产物，该酰氯可以是月桂酰氯、 苯甲酰氯、硬脂酰氯或由
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13-undecyloxymethyl-3,6,9,12，15-pentaoxahexacosanoic acid 制备的酉先氯。 上述反应中鲁米诺与酰氯的摩尔比为1 1.1-1.4。(2)在0°C将酰氯逐滴加入鲁米诺与吡啶的二甲基甲酰胺溶液，其中鲁米诺与吡 啶的摩尔比为1 1.5-2.0，二甲基甲酰胺用量与鲁米诺的关系为20-30mL:lg，搅拌过夜 后，加入是其体积10-15倍的碳酸氢钠饱和溶液混合，析出黄色沉淀。(3)沉淀水洗干燥后，经硅胶层析柱纯化，该洗脱剂为有机混合溶剂，其可以是石 油醚、乙酸乙酯及氯仿的混合溶剂，并且石油醚乙酸乙酯氯仿=1:2:1;其也可以是乙酸乙酯、氯仿的混合溶剂，并且乙酸乙酯氯仿=1 1;其也可以 是乙酸乙酯、氯仿及乙醇的混合溶剂，并且乙酸乙酯氯仿乙醇=2 2 1。纯化后得 到的浅黄色粉末状产物，即为具有两亲性分子的鲁米诺衍生物。2、膜的制备(1)使用计算机控制的LB膜仪，在恒温25士0. 5°C，将上述鲁米诺衍生物的二甲基 亚砜溶液(0. 5-0. 8mg/mL)与免疫球蛋白G (简称IgG)水溶液(3. 5-4. Omg/mL)的混合溶液 (体积比为1 5. 0-6. 0)铺展到磷酸盐缓冲液(PBS, IOmM, ρΗ7· 4)上；(2)待溶剂完全挥发后，用恒定速度压膜并同时记录其表面压-面积等温曲线，参 考曲线形状选择合适的表面压来转移薄膜。在适当的表面压(10-20mN/m)下用垂直提拉法 (速度2mm/min)将得到厚度约为l-3nm的有序组装膜转移到相应的电极基片上。3、氧化酶的固定将得到的鲁米诺衍生物和免疫球蛋白G的组装膜转移到固体电 极基板上后，继续浸于含有0. IM磷酸盐缓冲液(pH 7.4,0. 15M NaCl,lmg/mL BSA)的胆碱 氧化酶(缩写为CH0D)溶液(0. 7mg/mL)中，在4°C磁力搅拌18-25小时，然后用同样的缓冲 液清洗2次，得到表面固定氧化酶的电化学检测组装膜。本发明与现有技术相比具有如下优点1、该组装膜制备和检测都方便，消除了以 往固体石蜡碳糊电极等基体的制作、纳米粒子的制备与功能化、水溶性鲁米诺分子的添加 和氧化酶修饰等繁琐步骤；2、应用范围广，只要固定相应的氧化酶，便可以检测糖、胆碱、蛋 白质以及某些药物、毒物的生物转化过程；3、具有良好的选择性，归因于酶促反应特异性和 检测膜的高灵敏度，抗干扰作用较高；4、具有较好的稳定性和较长的使用寿命，制备的检测 薄膜在不使用时，电极放置在4°C冰箱中保存，结果表明，30天内电极响应基本不变，6个月 后检测强度仍保持原来的90%，说明检测膜能在微环境下保持氧化酶和鲁米诺衍生物的活 性，比以往手段的15-28天的使用寿命大大提高。
图1是本发明鲁米诺衍生物电化学检测组装膜的结构放大示意图。图2(a)是本发明鲁米诺衍生物LCll单层LB膜的原子力显微镜片图。图2(b)是本发明鲁米诺衍生物TF46单层LB膜的原子力显微镜片图。图3是本发明鲁米诺衍生物LCll (a)与TF46 (b)的组装膜对H2O2的ECL检测曲线 图。在图1中1-电极基板，2-鲁米诺两亲分子，3-免疫球蛋白G(缩写为IgG)，4_固 定的氧化酶。在图2所示的鲁米诺衍生物的单层LB膜的原子力显微镜片图中，由于取代基 团的差异，其微观形貌有所不同，如图(a)和(b)所示。在图3所示的鲁米诺衍生物的组装膜对H2O2的ECL检测曲线图中，采用鲁米诺衍生物的组装膜可以检测出溶液中过氧化氢的 含量，并且随取代基团的差异，检测强度也有所变化。
具体实施例方式实施例1取1. 08g月桂酰氯，在0°C逐滴加入含有797mg鲁米诺与0. 7mL吡啶的20mL 二甲 基甲酰胺溶液，搅拌过夜后，加入200mL碳酸氢钠的饱和溶液混合，析出黄色沉淀。沉淀水 洗干燥后，经硅胶层析柱纯化，其洗脱剂为石油醚乙酸乙酯氯仿=1 2 1，纯化后得 到的242毫克黄色粉末状产物N-鲁米诺-月桂酰胺，其分子式如下N-(l,4-dioxo-l,2,3,4-tetrahydrophthalazin-5-yl)dodecanamide (简禾尔为 LC11)，其结构式为
权利要求
一种鲁米诺衍生物电化学检测组装膜，其特征在于它是一种由鲁米诺衍生物和免疫球蛋白G混合物作基体，其一侧附着在电极基板上，另一侧附有氧化酶层的薄膜。
2.权利要求1所述的鲁米诺衍生物电化学检测组装膜的制备方法，其特征在于(1)鲁米诺衍生物的制备鲁米诺与酰氯反应，两者的摩尔比为1 1. 1_1.4，在01逐 滴加入鲁米诺与吡啶的二甲基甲酰胺溶液，其中鲁米诺与吡啶的摩尔比为1 1.5-2.0，二 甲基甲酰胺用量与鲁米诺的关系为20-30mL lg，搅拌过夜后，加入是其体积10-15倍的碳 酸氢钠饱和溶液混合，析出黄色沉淀；沉淀水洗干燥后，经硅胶层析柱纯化；(2)膜的制备使用计算机控制的LB膜仪，在恒温25士0.5°C，将上述0. 5-0. 8mg/mL鲁 米诺衍生物的二甲基亚砜溶液与3. 5-4. Omg/mL免疫球蛋白G水溶液的混合溶液，两者的体 积比为1 5.0-6.0，铺展到磷酸盐缓冲液？83，10福4!17.4上；待溶剂完全挥发后，用恒定 速度压膜并同时记录其表面压_面积等温曲线，在10-20mN/m表面压下用垂直提拉法，速度 2mm/min将得到厚度约为l-3nm的有序组装膜转移到相应的电极基片上；(3)氧化酶的固定将得到的鲁米诺衍生物和免疫球蛋白G的组装膜转移到固体电极 基板上后，继续浸于含有0. IM磷酸盐缓冲液pH 7.4,0. 15M NaCl,lmg/mL BSA的胆碱氧化 酶溶液0. 7mg/mL中，在4°C磁力搅拌18-25小时，然后用同样的缓冲液清洗2次，得到表面 固定氧化酶的电化学检测组装膜。
3.根据权利要求2所述的鲁米诺衍生物电化学检测组装膜的制备方法，其特征在于 硅胶层析柱纯化的洗脱剂为有机混合溶剂，其可以是石油醚、乙酸乙酯及氯仿的混合溶剂， 并且石油醚乙酸乙酯氯仿=1:2:1 ；其也可以是乙酸乙酯、氯仿的混合溶剂，并且 乙酸乙酯氯仿=1 1 ；其也可以是乙酸乙酯、氯仿及乙醇的混合溶剂，并且乙酸乙酯 氯仿乙醇=2:2:1。
全文摘要
一种鲁米诺衍生物电化学检测组装膜及其制备方法，其中组装膜是一种由鲁米诺衍生物和免疫球蛋白G混合物作基体，其一侧附着在电极基板上，另一侧附有氧化酶层的薄膜。上述组装膜的制备方法是(1)鲁米诺与酰氯反应制备具有两亲性的鲁米诺衍生物；(2)通过LB技术在固体电极基板上制备有序组装膜；(3)固定相应的氧化酶于组装膜表面。本发明解决以往水溶性鲁米诺小分子检测范围局限性，酶活性改良等苛刻问题，作为一种检测直接、快速高效、选择性好、应用范围广的电化学检测组装膜，是直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。
文档编号G01N27/327GK101936941SQ20101024276
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者刘广田, 周靖欣, 焦体峰, 邢媛媛 申请人:燕山大学