专利名称：促甲状腺激素定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及体外免疫检测技术，尤其是涉及一种将酶促化学发光技术与磁分离技 术相结合的促甲状腺激素定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
促甲状腺激素(thyrotropin, thyroid stimulating hormone, TSH)是腺垂体分泌、 的促进甲状腺生长和机能的激素。人类的TSH为一种糖蛋白，是由垂体前叶分泌的一种糖 蛋白激素，含211个氨基酸，糖类约占整个分子的15%，整个分子由两条肽链——α链和β 链组成，分子量为28000D。TSH分子α亚基的氨基酸序列与其他的糖蛋白激素如促黄体素 (LH)、促卵泡素(FSH)和人绒毛膜促性腺素(HCG)的α亚基基本相同。β亚基为TSH所特 有的，决定TSH的特异性。血清中除有生物活性的整分子TSH外，还有无生物活性的α及 β亚基。TSH全面促进甲状腺的机能，稍早出现的是促进甲状腺激素的释放，稍晚出的为促 进Τ4、Τ3的合成，包括加强碘泵活性，增强过氧化物酶活性，促进甲状腺球蛋白合成及酪氨 酸碘化等各个环节。TSH促进甲状腺上皮细胞的代谢及胞内核酸和蛋白质合成，使细胞呈高 柱状增生，从而使腺体增大。腺垂体分泌TSH，一方面受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激 素(TRH)的促进性影响，另方面又受到Τ3、Τ4反馈性的抑制性影响，二者互相拮抗，它们组 成下丘脑-腺垂体-甲状腺轴。正常情况下，下丘脑分泌的TRH量，决定腺垂体甲状腺轴反 馈调节的水平。TRH分泌多，则血中Τ3、Τ4水平的调定点高，当血中Τ3、Τ4超过此调定水平 时，则反馈性抑制腺垂体分泌TSH，并降低腺垂体对TRH的敏感性，从而使血中Τ3，Τ4水平保 持相对恒定。骤冷等外界刺激经中枢神经系统促进下丘脑释放TRH，再经腺垂体甲状腺轴， 提高血中Τ3、Τ4水平。血清中TSH从各方面控制甲状腺的功能从吸碘作用，甲状腺球蛋白的合成和分 泌，直至甲状腺素的释放等。因此，整分子TSH的准确测定，是判断甲状腺和下丘脑-垂 体-甲状腺轴的功能是否正常的首选指标。从检测技术上来讲，过去以放免为代表的第一代TSH诊断试剂盒，因其最低检测 限接近正常值下限，临床价值受到很大限制，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免 疫技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代，是继酶联免疫技术和放免 技术之后发展起来的新兴技术，由于其较高的灵敏度和特异性，同时方法也简便、快速，标 记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。免疫磁微粒 技术是近几年新兴技术，它是利用高分子合成一定粒度大小的磁性固相微粒做载体，载体 表面修饰有一定数量的化学功能团，可通过化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的免 疫活性物质(抗原或抗体)，具有分离速度快、效率高、可重复性好、反应均相等诸多优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促甲状腺激素定量检测试剂盒，该试剂盒将酶促化学 发光技术与磁分离技术相结合，成本低廉、简便快速且结果准确；本发明还提供该试剂盒的制备方法。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案本发明所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒，它包括包被有抗促甲状腺激素单克 隆抗体的磁微粒混悬液、促甲状腺激素系列校准品、辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激 素单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液。所述磁微粒混悬液中的磁微粒粒径为0. 8-1. 5um,表面含有浓度为20-30ueq/g的 羧基活性基团。采用活化剂对其羧基进行活化，然后与抗促甲状腺激素单克隆抗体上的氨 基进行连接；所述促甲状腺激素系列校准品是采用PH为7. 4的Tris-NaCl缓冲液(三(羟甲 基)氨基甲烷-盐酸缓冲液)基质，加入促甲状腺激素纯品、牛血清白蛋白及稳定剂配制而 成。所述辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体采用的标记方法为碳二 亚胺法。所述发光底物A液由0.2M TriS-Hcl (三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液)、 0. 15mM Luminol (鲁米诺)、0.59mM羟基香豆素、0.35mM没食子酸组成；发光底物B液由 0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20 (表面活性剂)、0. 5mM DTPA (二乙烯三胺五乙酸)、 0. 12mM维生素C组成。所述浓缩洗液为含有稳定剂和表面活性剂的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)。本发明所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒的制备方法，它包括下述步骤第一步，包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备根据使用量取羧基磁微粒，用过量的EDC(l-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚 胺)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)在酸性条件下进行活化，活化完成后，加磁场，静置使磁 微粒与液体分开，弃去上清，用PH7. 6的0. OlM的PBS缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂；加 入抗促甲状腺激素单克隆抗体，使其浓度为2ug/mg磁微粒，在酸性条件下震荡反应；反应 结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1 %牛血清白蛋白的0. OlM的 PBS缓冲液进行封闭，并加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为0. 5mg/ml ；将该 磁微粒混悬液置于2-8度保存，以备使用；第二步，促甲状腺激素系列校准品的制备用含有-3% BSA(牛血清白蛋白)和 0. 1-0. 3% PC300 (防腐剂)^Tris-NaCl 缓冲液将促甲状腺激素纯品配制成标示浓度为ο μ IU/ml、0. 1 μ IU/ml、0. 5 μ IU/ml、2 μ IU/ ml UO μ IU/ml,50 μ IU/ml UOO μ IU/ml 的一系列校准品；第三步，辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体的制备将鼠抗促甲状腺激素单克隆抗体上的羧基与辣根过氧化物酶分子的氨基经EDC 的作用缩合为酰胺化合物，透析后既得促甲状腺激素酶标抗体；在标记好的溶液中，等比加 入甘油-20度保存备用；第四步，发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液的配制发光底物A 液由 0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM 羟基香豆素、0. 35mM 没 食子酸配制而成；发光底物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM维生
4素C配制而成；浓缩洗液由NaH2P04 · 2H20 4. 06g, Na2HP04 · 12H20 62. 32g, Tween202_10ml，蒸 馏水1000ml配制而成。本发明的优点在于采用双抗体夹心的一步法反应模式，从大量的活性材料中优选 出一对特异性较高、亲和力较强的单克隆抗体分别作为本试剂盒的包被抗体和酶标记抗 体，使得本试剂盒的诊断灵敏度明显优于同类试剂盒。本发明的主要创新之处在于1、研制了一种新的定量检测血清中促甲状腺激素含量的试剂盒，该试剂盒将化学 发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，使得TSH检测性能大大 提高(灵敏度、精密性、检测范围等)，反应时间大大缩短(从开始加样到检测结果，时间少 于 25min)；2、发明了一种新的抗促甲状腺激素单克隆抗体与免疫磁微粒的偶联方法，该方法 偶联效率较高，结合牢固，且工艺稳定，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本；3、试剂盒中的校准品、酶结合物、浓缩洗液、及发光底物配方均是该反应体系下的 最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
图1是本发明试剂盒的标准曲线线形图。图2是本发明试剂盒与同类产品对照图。
具体实施例方式本发明所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒，它包括包被有抗促甲状腺激素单克 隆抗体的磁微粒混悬液，所述磁微粒混悬液中的磁微粒粒径为0. 8-1. 5um，表面含有浓度 为20-30ueq/g的羧基活性基团，采用活化剂对其羧基进行活化，然后与抗促甲状腺激素 单克隆抗体上的氨基进行连接；采用PH为7. 4的Tris-NaCl缓冲液基质，加入促甲状腺 激素纯品、牛血清白蛋白及稳定剂配制而成的促甲状腺激素系列校准品；辣根过氧化物酶 标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体，标记方法采用碳二亚胺法；由0. 2M Tris-HcUO. 15mM LuminoUO. 59mM羟基香豆素、0. 35mM没食子酸组成的发光底物A液，由0. 85mM氨基酸氧化 酶、0. 8% Tween-20,0. 5mM DTPA、0. 12mM维生素C组成的发光底物B液及加有稳定剂和表 面活性剂的PBS缓冲浓缩洗液。本发明所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒的制备方法，它包括下述步骤第一步，包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备根据使用量取适量的羧基磁微粒，用过量的EDC和NHS在酸性条件下 (PH4. 5-PH5. 5)进行活化，活化缓冲液为0. 05M-0. IM的MES (2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲 液，活化时间为30min，活化完成后，加磁场，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，用 PH为7. 6的0. OlM的PBS缓冲液洗涤两遍以洗去多余的活化剂；加入适量的抗促甲状腺激 素单克隆抗体，使其浓度为2ug/mg磁微粒，在0. 05M-0. IM的MES缓冲液中(PH4. 5-PH5. 5) 震荡反应Ih ；反应结束后加磁场，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1 %牛 血清白蛋白(BSA)的0. OlM的PBS缓冲液(PH7. 6)进行封闭，反复封闭5次，每次IOmin ；封闭结束后，加入适量的封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为0. 5mg/ml ；将该磁 微粒混悬液置于2-8度保存，以备使用；第二步，促甲状腺激素系列校准品的制备依据WHO的促甲状腺激素标准品，用含有1 % -3 % BSA和0. 1-0. 3 % PC300的Tri S-NaCl缓冲液将促甲状腺激素纯品配制成标示浓度为0μ IU/ml、0. 1μ IU/ml、0. 5μ IU/ ml、2y υ/πι1、10μ IU/ml、50y υ/πι1、100μ IU/ml的一系列校准品，瓶盖颜色依次为白、黄、 绿、蓝、红、紫、黑；第三步，辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体的制备将鼠抗促甲状腺激素单克隆抗体上的羧基与辣根过氧化物酶(HRP)分子的氨基 经EDC的作用缩合为酰胺化合物，透析后既得促甲状腺激素酶标抗体；在标记好的溶液中， 等比加入甘油-20度保存备用；将标记好的酶标抗体按照1 2000—1 5000的比例加入到含有20%—50%小 牛血清和Pc300 (0. 15% -0. 25% )的PH 7. 4Tris_NaCl缓冲液中，混合均勻，即得到该试剂 盒的酶结合物；第四步，发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液的配制发光底物A 液由 0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM 羟基香豆素、0. 35mM 没 食子酸配制而成；发光底物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM维生 素C配制而成；浓缩洗液由NaH2P04 · 2H20 4. 06g, Na2HP04 · 12H20 62. 32g, Tween202_10ml，蒸 馏水1000ml配制而成。本发明促甲状腺激素定量检测试剂盒的使用操作程序如下1、样本采集采用正确医用技术收集血清(严重溶血或脂血的样本不能用于测定)，收集后的 样本在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置于2 8°C的冰箱 中；若需72小时以上保存或运输，则应冻存于-20°C以下，避免反复冻融。使用前恢复到室 温，轻轻摇动混勻。2、实验前准备①取1瓶浓缩洗液按标签上标识的稀释比例要求稀释备用。②将恒温箱或水浴锅温度调至37°C，待温度稳定后使用。③将磁微粒混悬液充分混勻至无肉眼可见沉淀。3、实验方法①取出一定量的反应容器，编号。根据实验要求加入50 μ 1校准品/质控品/临 床血清。②摇勻磁微粒混悬液，每孔分别加入20 μ 1。③每孔分别加入酶标记物50 μ 1。④将反应容器内溶液混合均勻，37°C温育15分钟。⑤使用磁分离及洗涤设备，将反应容器中磁微粒用洗液洗涤5次。⑥将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
⑦每孔加入发光底物A和发光底物B各50 μ 1，振荡混勻后避光室温反应5分钟。⑧化学发光检测仪检测发光强度。⑨采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为X轴，以校准品发光强度对数值为Y 轴，建立定标曲线。根据待测样本的发光强度值回算相应的浓度值。本发明促甲状腺激素定量检测试剂盒的方法学鉴定结果按照上述操作方法对该试剂盒进行方法学鉴定，该试剂盒可达到如下指标标准曲线线性R大于0. 999 (如附图1所示)最低检出限小于0. 005 μ IU/ml精密性分析内变异、分析间变异及批间变异均小于10% (见表1)表1.精密性数据表a)、分析内和分析间变异数据表
权利要求
一种促甲状腺激素定量检测试剂盒，其特征在于它包括包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液、促甲状腺激素系列校准品、辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液。
2.根据权利要求1所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒，其特征在于所述磁微粒混 悬液中的磁微粒粒径为0. 8-1. 5um，表面含有浓度为20-30ueq/g的羧基活性基团。
3.根据权利要求1所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒，其特征在于所述促甲状腺 激素系列校准品是采用PH为7. 4的Tris-NaCl缓冲液基质，加入促甲状腺激素纯品、牛血 清白蛋白及稳定剂配制而成。
4.根据权利要求1所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒，其特征在于所述辣根过氧 化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体采用的标记方法为碳二亚胺法。
5.根据权利要求1所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒，其特征在于所述发光底物 A液由0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM羟基香豆素、0. 35mM没食子酸组成；发光底 物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM维生素C组成。
6.根据权利要求1所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒，其特征在于所述浓缩洗液 为含有稳定剂和表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的促甲状腺激素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于它 包括下述步骤第一步，包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备根据使用量取羧基磁微粒，用过量的EDC和NHS在酸性条件下进行活化，活化完成后， 加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用PH为7. 6的0. OlM的PBS缓冲液洗涤以洗 去多余的活化剂；加入抗促甲状腺激素单克隆抗体，使其浓度为2ug/mg磁微粒，在酸性条 件下震荡反应；反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有牛血 清白蛋白的0. OlM的PBS缓冲液进行封闭，并加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓 度为0. 5mg/ml ；将该磁微粒混悬液置于2_8度保存，以备使用；第二步，促甲状腺激素系列校准品的制备用含有1 % "3 % BSA和0. 1-0.3% PC300的Tris-NaCl缓冲液将促甲状腺激素纯品 配制成标示浓度为 0μ IU/ml、0. 1 μ IU/ml、0. 5μ IU/ml、2y IU/mlU0y IU/ml、50y IU/ml、 100 μ IU/ml的一系列校准品；第三步，辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体的制备将鼠抗促甲状腺激素单克隆抗体上的羧基与辣根过氧化物酶分子的氨基经EDC的作 用缩合为酰胺化合物，透析后既得促甲状腺激素酶标抗体；在标记好的溶液中，等比加入甘 油-20度保存备用；第四步，发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液的配制发光底物A液由0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM羟基香豆素、0. 35mM没食子 酸配制而成；发光底物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM维生素C 配制而成；浓缩洗液由 NaH2P04 · 2H20 4. 06g, Na2HP04 · 12H20 62. 32g, Tween20 2-lOml，蒸馏水 1000ml配制而成。
全文摘要
本发明公开了一种促甲状腺激素定量检测试剂盒，它包括包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液、促甲状腺激素系列校准品、辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液；本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明的优点在于采用双抗体夹心的一步法反应模式，从大量的活性材料中优选出一对特异性较高、亲和力较强的单克隆抗体分别作为包被抗体和酶标记抗体，使得本试剂盒诊断灵敏度、精密性和检测范围明显优于同类试剂盒，反应时间大大缩短，同时本发明采用抗促甲状腺激素单克隆抗体与免疫磁微粒的偶联方法，偶联效率较高，结合牢固，工艺稳定，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。
文档编号G01N33/535GK101949943SQ201010243049
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者付光宇, 刘保鑫, 吴学炜, 渠海, 苗拥军, 陈晓玲, 项立红, 马建军, 高晓丹 申请人:郑州安图绿科生物工程有限公司