专利名称：一种检测饲料中植酸酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测饲料中植酸酶活性的方法，属于饲料的化学成分分析技术领 域。
背景技术：
植酸酶为生物大分子蛋白类物质，纯品状态下，由于植酸酶可在一定温度和PH条 件下，将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色 的复合物，于波长415nm下进行比色测定。目前已形成国标GB/T 18634-2009《饲用植酸 酶活性的测定分光光度法》。然而，饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题饲料中的植 酸酶不同于纯品植酸酶，其中存在大量物质可在酸性条件下与钒钼酸铵发生显色反应，干 扰415nm波长下的比色反应。因此，背景干扰除杂是测定饲料中植酸酶活性的关键。GB/T 18634-2009中并未建立背景干扰除杂的步骤；同时，中国专利CN101493418A(添加在饲料 中植酸酶的微量测定方法，
公开日2009年07月四日)中虽选用透析的方式进行背景干扰 除杂，但并未指出透析袋的截留分子量，并且该文献公开的检测方法涉及透析处理，检测步 骤多，周期长。发明内容
本发明的目的在于提供一种检测饲料中植酸酶活性的方法，该方法可以将饲料中 的植酸酶完全浸提出来，同时成功地解决了背景干扰除杂的问题，具有检测周期短、灵敏度 高、相对误差小的优点。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量的试验摸索，最终获得了如下技术方 案
一种检测饲料中植酸酶活性的方法，包括如下步骤
(1)绘制标准曲线准确称取0.6804g在105°C烘至恒重的基准磷酸二氢钾于 IOOml容量瓶中，用稀释液溶解并定容后形成磷标准溶液；将磷标准溶液用稀释液稀释成 1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. Ommol/L的溶液；各浓度溶液分别取2ml，37°C预热5min，加入6ml显 色液，37°C保温30min，加入已预热至37°C的植酸钠溶液加1，反应后在水浴中静置lOmin， 4000r/min离心IOmin ；取上清液，以空白为参比，在波长415nm处分别测定样品溶液的吸光 值，绘制标准曲线；
(2)样品处理将含有植酸酶的饲料粉碎，0.45mm过筛，取0.5g入150ml锥形瓶 中，加入50ml提取液，在摇床上振荡30min，4000r/min离心IOmin ；
(3)样品稀释液的制备取步骤(1)所得的上清液0. 5-1. Oml入50ml容量瓶中，用稀释液定容，摇勻；
(4)反应取2ml样品稀释液，37°C预热5min，加入已预热至37°C的植酸钠溶液 anl，37°C保温30min，加入6ml显色液，反应后在水浴中静置lOmin，4000r/min离心IOmin ； 取上清液，以样品空白为参比，在波长415nm处测定样品溶液的吸光值；
(5)用直线回归方程计算磷的含量，根据磷含量按下式计算植酸酶活性C
权利要求
1.一种检测饲料中植酸酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤(1)绘制标准曲线准确称取0.6804g在105°C烘至恒重的基准磷酸二氢钾于IOOml容 量瓶中，用稀释液溶解并定容后形成磷标准溶液；将磷标准溶液用稀释液稀释成1. 0,2. 0、 3. 0,4. 0,5. Ommol/L的溶液；各浓度溶液分别取anl，37°C预热5min，加入6ml显色液，37°C 保温30min，加入已预热至37°C的植酸钠溶液^il，反应后在水浴中静置lOmin，4000r/min 离心IOmin ；取上清液，以空白为参比，在波长415nm处分别测定样品溶液的吸光值，绘制标 准曲线；(2)样品处理将含有植酸酶的饲料粉碎，0.45mm过筛，取0. 5g入150ml锥形瓶中，加 入50ml提取液，在摇床上振荡30min，4000r/min离心IOmin ；(3)样品稀释液的制备取步骤(1)所得的上清液0.5-1. Oml入50ml容量瓶中，用稀 释液定容，摇勻；(4)反应取2ml样品稀释液，37°C预热5min，加入已预热至37°C的植酸钠溶液^il, 37°C保温30min，加入6ml显色液，反应后在水浴中静置lOmin，4000r/min离心IOmin ；取上 清液，以样品空白为参比，在波长415nm处测定样品溶液的吸光值；(5)用直线回归方程计算磷的含量，根据磷含量按下式计算植酸酶活性 CU/g= ~^X30X N其中U-样品植酸酶活力，U/g;C-样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应磷的浓度(mmol/L)；N-样品溶液反应前的总稀释倍数；m-样品质量(g)；30-反应时间，min ；上述各步骤中所述的提取液的配置方法如下称取46. 06g 一水草酸钾，9. Sg醋酸钾，于1000ml容量 瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5. 50，加入0. 25g牛血清白蛋白溶解，用蒸 馏水定容至1000ml，室温下存放1个月有效；所述的稀释液的配置方法如下称取8. 2g无水乙酸钠，0. 25g牛血清白蛋白于1000ml 容量瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5. 50，并用蒸馏水定容至1000ml，室温 下存放1个月有效；所述的植酸钠溶液的配置方法如下称取0. 9239g植酸钠、0. 82g无水乙酸钠于IOOmL 容量瓶中，加入90ml水溶解，用冰乙酸调pH值至5. 50，并用蒸馏水定容；所述显色液的配置方法如下在搅拌下将钼酸铵溶液缓缓倒入钒酸铵溶液中，用水稀 释至750ml ；其中，钼酸铵溶液为20g四水钼酸铵溶入于200ml水中而成，钒酸铵溶液为 0. 75g钒酸铵溶于100ml水中，缓缓加入85ml硝酸溶液而成。
2.如权利要求1检测饲料中植酸酶活性的方法，其特征在于步骤(2)所述饲料粉碎 过筛后，对饲料进行50000道尔顿截留分子量的分子筛浸提预处理。
3.如权利要求1检测饲料中植酸酶活性的方法，其特征在于所述的稀释液中含有氯 化钙。
全文摘要
本发明涉及一种检测饲料中植酸酶活性的方法，属于饲料的化学成分分析技术领域。该方法通过一种新的提取液、稀释液以及检测流程，将饲料中的植酸酶完全浸提出来，同时消除了饲料中本身存在的无机磷对测定的干扰，检测结果的变异系数小，具有检测周期短、灵敏度高、重复性和准确性好的优点。
文档编号G01N21/78GK102033064SQ201010533670
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月6日 优先权日2010年11月6日
发明者詹志春, 邹大琼 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司