专利名称：竹叶提取物及其制品中黄酮含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及天然产物的测定方法，具体涉及天然产物中黄酮类物质的测定方法， 更特别地涉及竹叶提取物及其制品中黄酮含量的测定方法。
背景技术：
竹叶作为一种“药食两用的天然植物”已被广大消费者所接受，竹叶提取物主要功 能性成分为黄酮糖苷，具有抗氧化和抑菌活性，可以作为一种生物黄酮类保健营养素进行 开发。以竹叶为原料，利用硅胶柱层析、大孔树脂柱层析、有机溶剂液液萃取等方法制备的 竹叶黄酮粉产品已经上市，因此，竹叶提取物在食品、化工、医药、农业等领域具有广阔的市 场前景。目前，用于测定竹叶提取物及其制品中黄酮含量的方法是分光光度法，分光光度 法是利用黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性羰基能够与金属盐试剂形成有色络合 物原理进行测定。此法设备价廉，操作简便，但样品未经分离纯化，受花色素、酚酸及其它酚 性成分的干扰，误差较大，结果高于实际含量。此外，由于竹叶提取物及其制品中的黄酮类 成分比较复杂，不同种类的黄酮化合物相互之间的的含量亦相差非常大，分光光度法的另 一项重要缺点是难以了解竹叶提取物及其制品中各种黄酮化合物的分布及其具体含量、比 例等，而对这些参数的了解对于产品的深入开发和评价具有重要意义。尽管我国林业科研人员对竹叶提取物的开发利用已进行了一定的研究，由于行业 中仍缺乏测定竹叶提取物及其制品中黄酮含量的明确而有效的方法，这在一定程度上制约 了竹叶提取物的开发利用。因此，建立一个更精准的测定竹叶提取物及其制品中黄酮含量 的方法具有重要意义。
发明内容
本发明人令人惊奇地发现，通过将竹叶提取物或其制品进行酸水解处理，然后采 用特定的色谱条件进行高效液相色谱分析，可以准确地测定竹叶提取物或其制品中的黄酮 化合物的组成分布及其含量。本发明基于上述发现而得以完成。发明概述因此，本发明第一方面涉及测定竹叶提取物或其制品中黄酮化合物种类和/或含 量的方法，其包括以下步骤(a)使竹叶提取物或其制品进行酸解处理；(b)提供用于HPLC 分析用的反相高效液相色谱系统；(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱系统，进行 色谱分离；(d)将步骤(a)酸解溶液注入液相色谱系统，进行色谱分离；(e)对竹叶提取物 或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，(f)对竹叶提取物或其制品中的黄 酮类化合物进行定量表征。本发明第二方面提供了一种信息说明资料，其中记载了本发明第一方面任一项所 述的方法。发明详述
本发明第一方面涉及测定竹叶提取物或其制品中黄酮化合物种类和/或含量的 方法，其包括以下步骤(a)使竹叶提取物或其制品在盐酸甲醇溶液中加热，进行酸解处理，过滤，得酸解 溶液；(b)提供反相高效液相色谱系统，其包括色谱柱、流动相、包括等度和/或梯度的 洗脱程序、以及装配有二极管阵列检测器或紫外检测器的色谱仪；(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱系统，进行色谱分离，所述各标准品溶 液独立地包含一种或多种选自下列7个的标准品异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木 犀草素-6-C-阿拉伯糖苷、木犀草素、苜蓿素；(d)将步骤(a)所得酸解溶液注入液相色谱系统，进行色谱分离；(e)根据步骤(C)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色 谱响应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，(f)根据步骤(C)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色 谱响应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定量表征。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述盐酸甲 醇溶液是甲醇与25%盐酸的混合物。在一个实施方案中，所述甲醇与25%盐酸的混合物是 二者以体积比O 6) 1“2 5) 1、或约4 1的混合物，优选是约4 1的混合物。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述加热是 在沸水浴中加热。在一个实施方案中，所述加热是在沸水浴中回流。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述酸解处 理的时间为1 3小时。在一个实施方案中，所述酸解处理的时间为1. 5 2. 5小时。在 一个实施方案中，所述酸解处理的时间为约2小时。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述竹叶提 取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为50mg (IOml 50ml)。在一个实施方案中，所述竹 叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为50mg (15ml 40ml)、50mg (20ml 30ml)、 或约50mg 25ml，优选的比为约50mg 25ml。本领域技术人员理解，根据所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物的含量 不同，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比可以作适当的改变，以获得较佳的酸 解效果；类似地，其它因素亦可作适当改变。在一个实施方案中，在步骤(a)中，所述盐酸 甲醇溶液是甲醇与25%盐酸二者以体积比约4 1的混合物，所述加热是在沸水浴中回 流，所述酸解处理的时间为约2小时，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为约 50mg 25ml。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱柱 是ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5 μ m粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中， 所述色谱柱是5 μ m粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5 μ m粒度填料的 YMC-Pack ODS AQ型色谱柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5 μ m粒度填料的YMC-Pack ODS AQSG. 6mm x 250mm)色谱柱，或者是具有在本发明所述色谱条件下与该5 μ m粒度填 料的YMC-Pack ODS AQ型6mm χ 250mm)色谱柱分离效果相当的色谱柱。在一个实施方 案中，所述色谱柱是ODS柱，并且其在在本发明所述色谱条件下可以使下列标准品相互之间的分离度达到1. 0以上异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-阿拉伯糖 苷、木犀草素、苜蓿素。优选地，该色谱柱可使上述7个标准品相互之间的分离度达到1. 1 以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上、或2.0以上。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述流动相 包括流动相A和流动相B，所述流动相A是乙腈，所述流动相B是0.5% (V/V)磷酸水溶液。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述洗脱程 序是以0. 5 2ml/min(优选约lml/min)的流速，在第一洗脱时间段内以包含10 15% 流动相A和加至100%流动相B的混合液中进行等度洗脱，然后在第一洗脱时间段内从上 述混合液经线性梯度变化到包含40 50%流动相A和加至100%流动相B的混合液中进 行梯度洗脱。在一个实施方案中，所述第一洗脱时间段使用的洗脱液是包含约12%流动相 A和约88%流动相B (本领域技术人员理解，(1) 二者之和为100%，和/或⑵两种流动相 的比例可作适当调整以获得更佳的分离效果；此(1)和(2)在其它情况下亦是适用的)的 混合液。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段使用的梯度洗脱液是包含约12%流动相 A和约88%流动相B的混合液经线性梯度变化到包含约45%流动相A和约55%流动相B 的混合液。在一个实施方案中，所述第一洗脱时间段为30 60min，优选35 55min，优选 40 50min，优选约45min。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段为30 60min，优选 35 55min，优选40 50min，优选约45min。本领域技术人员理解，在优选的情况下，所述 第一洗脱时间段洗脱操作完毕后，即刻开始所述第二洗脱时间段。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱系 统设定的检测波长为320 380nm，优选330 370nm，优选340 360nm，优选约350nm。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱柱 的柱温控制在15 45°C，优选20 40°C，优选25 35°C，优选约30°C。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱系 统的进样体积为5 50 μ L，优选5 40 μ L，优选5 30 μ L，优选10 20 μ L，优选IOyL 或 10μ L。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(C)中，所述标准品 溶液包括仅包含7个标准品之一的溶液，这种包含单一标准品的溶液可以方便地用于定性 测定，亦可用于定量测定。在一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述标准品溶液包括仅 包含7个标准品之一的溶液，并且包含某一个标准品的溶液可以具有不同的溶质浓度，即 对于某一标准品的溶液可以配制有多个，它们之间的浓度分布在一定范围内，例如各溶质 浓度独立地分布在0. 0001mg/mL到lmg/mL的范围内，优选分布在0. 001mg/mL到0. lmg/mL 的范围内。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(C)中，所述标准品 溶液包含全部7个标准品，这种包含全部7个标准品的溶液可以方便地用于定量测定。在 一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述标准品溶液包含全部7个标准品，并且该标准 品溶液可以具有不同的溶质浓度，即该标准品溶液可以配制有多个，各标准品溶液之间 以及每一标准品中的具体溶质的浓度分布在一定范围内，例如各溶质浓度独立地分布在 0. 0001mg/mL到lmg/mL的范围内，优选分布在0. 001mg/mL到0. lmg/mL的范围内。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(c)中，对于不论是包含全部7个标准品的标准品溶液，还是包含单个标准品的标准品溶液，其中牡荆苷、木犀草 素-6-C-阿拉伯糖苷、木犀草素、和苜蓿素的浓度各自独立地分布在0. OOOlmg/mL到0. 2mg/ mL的范围内，优选分布在0. 001mg/mL到0. 02mg/mL的范围内。在一个实施方案中，在步骤 (c)中，对于不论是包含全部7个标准品的标准品溶液，还是包含单个标准品的标准品溶 液，其中荭草苷和异牡荆苷的浓度各自独立地分布在0. 0005mg/mL到0. 4mg/mL的范围内， 优选分布在0. 005mg/mL到0. 04mg/mL的范围内。在一个实施方案中，在步骤(c)中，对于 不论是包含全部7个标准品的标准品溶液，还是包含单个标准品的标准品溶液，其中异荭 草苷的浓度分布在0. 002mg/mL到lmg/mL的范围内，优选分布在0. 02mg/mL到0. lmg/mL的 范围内。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(d)中，所述注入液相色 谱系统的所述酸解溶液可任选地用流动相稀释。该稀释优选地可以使该酸解溶液中的黄酮 类化合物的浓度与步骤(C)的标准品溶液中的黄酮类化合物的浓度基本上相当的范围。在 一个实施方案中，该稀释优选地可以使该酸解溶液中的各黄酮类化合物的浓度独立地分布 在0. 0001mg/mL到lmg/mL的范围内，优选分布在0. 001mg/mL到0. lmg/mL的范围内。在一 个实施方案中，该流动相可以为包含10 15%流动相A和加至100%流动相B的混合液， 优选可以为包含约12%流动相A和约88%流动相B的混合液。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(C)和/或步骤(d)中，所 述色谱分离是根据步骤(b)所述洗脱程序进行洗脱的。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(e)中，所述定性表征是 根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属。 由此可以确定所述竹叶提取物或其制品中包含的黄酮类化合物的种类。本领域技术人员理 解，在上述通过色谱峰显示的保留时间确定色谱峰归属时，标准品的保留时间与样品相应 物质的保留时间之间，以及同一样品不同进样批次的保留时间之间，可以容许有本领域技 术人员可理解和接受的误差，例如与对照品的保留时间相比，样品相应物质的保留时间可 以有例如 士0. 5min、士0. 25min、士0. lmin、或 士0. 05min 的偏差。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(f)中，所述定量表征是 根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间和响应强度(例如峰高、峰面积，优选峰面 积)，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属以及其在色谱进样溶液中的浓度，进一步确 定所述竹叶提取物或其制品中包含的黄酮类化合物的种类及其各自的含量，进一步确定所 述竹叶提取物或其制品中包含的总黄酮含量。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(f)中，所述定量表征酸 水解溶液中各色谱峰所归属的黄酮在色谱进样溶液中的浓度，其是根据步骤(C)所得各标 准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响应值，通过外标法或标准曲线法 换算获得的。在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(f)中，所述定量表征竹 叶提取物或其制品中所含黄酮类化合物[例如，各黄酮化合物可分别表示为异荭草苷 (X1)、荭草苷(X2)、牡荆苷(X3)、异牡荆苷(x4)、木犀草素-6-C-阿拉伯糖苷(X5)、木犀草素 (X6)、苜蓿素(X7)]的各自含量，该各自含量是通过以下式(1)计算确定的
权利要求
1.测定竹叶提取物或其制品中黄酮化合物种类和/或含量的方法，其包括以下步骤(a)使竹叶提取物或其制品在盐酸甲醇溶液中加热，进行酸解处理，过滤，得酸解溶液；(b)提供反相高效液相色谱系统，其包括色谱柱、流动相、包括等度和/或梯度的洗脱 程序、以及装配有二极管阵列检测器或紫外检测器的色谱仪；(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱系统，进行色谱分离，所述各标准品溶液独 立地包含一种或多种选自下列7个的标准品异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草 素-6-C-阿拉伯糖苷、木犀草素、苜蓿素；(d)将步骤(a)所得酸解溶液注入液相色谱系统，进行色谱分离；(e)根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响 应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，(f)根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响 应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定量表征。
2.根据权利要求1的方法，在步骤(a)中，该方法具有以下(i)至(ν)中的任一项或多 项所述特征(i)所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25%盐酸的混合物；( )所述加热是在沸水浴中加热；(iii)所述酸解处理的时间为1 3小时；(iv)所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为50mg (IOml 50ml);(ν)所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25%盐酸二者以体积比约4 1的混合物，所述加热 是在沸水浴中回流，所述酸解处理的时间为约2小时，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲 醇溶液的比为约50mg 25ml。
3.根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，该方法具有以下(i)至(iv)中的任一项或 多项所述特征(i)所述色谱柱是ODS柱；( )所述色谱柱是5 μ m粒度填料的ODS柱；(iii)所述色谱柱是5μ m粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型色谱柱；(iv)所述色谱柱是ODS柱，并且其在色谱条件下可以使下列标准品相互之间的分离度 达到1. 0以上异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-阿拉伯糖苷、木犀草 素、首猜素。
4.根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，该方法具有以下(i)至(ix)中的任一项或 多项所述特征(i)所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是乙腈，所述流动相B是0. 5% (V/V)磷酸水溶液；( )所述洗脱程序是以0. 5 2ml/min(优选约lml/min)的流速，在第一洗脱时间段 内以包含10 15%流动相A和加至100%流动相B的混合液中进行等度洗脱，然后在第一 洗脱时间段内从上述混合液经线性梯度变化到包含40 50%流动相A和加至100%流动 相B的混合液中进行梯度洗脱；(iii)所述第一洗脱时间段使用的洗脱液是包含约12%流动相A和约88%流动相B的混合液；(iv)所述第二洗脱时间段使用的梯度洗脱液是包含约12%流动相A和约88%流动相 B的混合液经线性梯度变化到包含约45%流动相A和约55%流动相B的混合液； (ν)所述第一洗脱时间段为30 60min (vi)所述第二洗脱时间段为30 60min；(vii)所述色谱系统设定的检测波长为320 380nm；(viii)所述色谱柱的柱温控制在15 45°C；(ix)所述色谱系统的进样体积为5 50μ L。
5.根据权利要求1的方法，在步骤(c)中，该方法具有以下(i)至(ii)中的任一项或 多项所述特征(i)所述标准品溶液包括仅包含7个标准品之一的溶液，并且包含某一个标准品的溶 液，其溶质浓度独立地分布在0. 0001mg/mL到lmg/mL的范围内；( )所述标准品溶液包含全部7个标准品，并且其中各溶质浓度独立地分布在 0. 0001mg/mL 到 lmg/mL 的范围内；
6.根据权利要求1的方法，在步骤(c)和/或步骤(d)中，所述色谱分离是根据权利要 求4所述特征进行洗脱的。
7.根据权利要求1的方法，该方法具有以下(i)至(iii)中的任一项或多项所述特征 (i)在步骤(e)中，所述定性表征是根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属；( )在步骤(f)中，所述定量表征是根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间和响 应强度，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属以及其在色谱进样溶液中的浓度，进一 步确定所述竹叶提取物或其制品中包含的黄酮类化合物的种类及其各自的含量，进一步确 定所述竹叶提取物或其制品中包含的总黄酮含量。(iii)在步骤(f)中，所述定量表征酸水解溶液中各色谱峰所归属的黄酮在色谱进样 溶液中的浓度，其是根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶 液的色谱响应值，通过外标法或标准曲线法换算获得的。
8.根据权利要求1-7任一项的方法中，在步骤(f)中，所述定量表征竹叶提取物或其制 品中所含黄酮类化合物的各自含量，该各自含量是通过以下式(1)计算确定的z/(o/0) = ^iLpI χ ιοο%m...............(1)式中Xi—样品中各个标准品黄酮单一组分的质量百分含量(％ )； Ci—根据标准曲线得出的样品中各个标准品黄酮(异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡 荆苷、木犀草素-6-C-阿拉伯糖苷、木犀草素、苜蓿素)的浓度(mg/mL)； V——样品溶液定容体积(mL)； m-样品质量数(mg)。
9.根据权利要求1-7任一项的方法中，在步骤(f)中，所述定量表征竹叶提取物或其制 品中包含的总黄酮含量，该总黄酮含量是通过以下式(2)计算确定的X = X1+X2+X3+X4+X5+ (X6+X7) X 1. 53......... (2)式中X—样品中总黄酮苷质量百分含量(％)；XI—样品中异荭草苷质量百分含量(％)； X2—样品中荭草苷质量百分含量(％ )； X3—样品中牡荆苷质量百分含量(％ )； X4—样品中异牡荆苷质量百分含量(％ )；X5——样品中木犀草素-6-C-阿拉伯糖苷质量百分含量(％)； X6——样品中木犀草素质量百分含量(％ )； X7——样品中苜蓿素质量百分含量(％ )； 1. 53——苷元分子质量与糖苷分子质量的换算因子。
10. 一种信息说明资料，其中记载了权利要求1-9任一项所述的方法。进一步地，该信 息说明资料是呈选自下列的形式纸质文件(包括但不限于文件单页、小册子、刊物)、磁介 质、光盘、软盘、电子出版物、网络出版物等，以及它们的组合。
全文摘要
本发明涉及竹叶提取物及其制品中黄酮含量的测定方法，具体地说，其包括以下步骤(a)使竹叶提取物或其制品进行酸解处理；(b)提供用于HPLC分析用的反相高效液相色谱系统；(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱系统，进行色谱分离；(d)将步骤(a)酸解溶液注入液相色谱系统，进行色谱分离；(e)对竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，(f)对竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定量表征。本发明的方法可以准确地测定竹叶提取物或其制品中的黄酮化合物的组成分布及其含量。
文档编号G01N30/89GK102141558SQ20101060552
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者姚曦, 岳永德, 汤锋, 王进, 郭雪峰 申请人:国际竹藤网络中心