专利名称：一种水产中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水产中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法，具体涉及一种检测水产中呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物以及呋喃它酮代谢物的快速检测方法。
背景技术：
硝基呋喃类药物是一类人工合成的抗菌药物，主要指呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林以及呋喃它酮。硝基呋喃类药物对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，而且价格低、药效好，曾经在水产养殖业中广泛使用。大剂量或长时间使用硝基呋喃类药物均能对养殖动物产生毒性作用和“三致”作用。“三致”作用指致癌、 致畸、致突变作用。硝基呋喃类化合物是直接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细菌的突变。呋喃它酮为强致癌性药物，呋喃唑酮具中等强度致癌性。高剂量饲喂食用鱼和观赏鱼，可诱导鱼的肝脏发生肿瘤。繁殖毒性结果表明，呋喃唑酮能减少精子的数量和胚胎的成活率。当含有硝基呋喃类抗生素残留的水产品为人所食用后，这些代谢物就可以在胃酸作用下从蛋白质中释放而被人体吸收，造成严重危害。硝基呋喃类药物在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，可长期保持稳定。所以在食品安全的检测中主要是检测硝基呋喃代谢物。 近几年因为硝基呋喃类药物残留超标阻碍我国水产品出口贸易的事例屡见报道。 2002年3月，欧盟以从我国进口的某些水产品测出呋喃西林等硝基呋喃类药物残留为原由，开始全面停止进口我国动物源性产品。造成大量产品积压和企业停产。2005年11月， 日本对中国大陆和台湾省的烤鳗分别检测出硝基呋喃类代谢产物AOZ超标。2006年2月， 宁波慈溪某进出口公司的27. 5t冻烤鳗由于被检出硝基呋喃类代谢产物AOZ超标，被日本方面全部退回，损失达54. 6万美元。鉴于硝基呋喃类药物残留的严重危害，欧盟已于1995年禁止在食用物中使用，并决定自2002年3月开始对进口的食品类产品进行此类药物的现场检测。2003年欧盟委员会通过决议，确定水产品中硝基呋喃类药物及代谢物的限值为不得检出。我国农业部也于 2002年4月发布193号公告，公布了《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》，规定硝基呋喃类抗生素在所有食品动物中禁止使用，2003年又将水产品硝基呋喃代谢物纳入残留监控计划。目前用于检测此类药物及其代谢物残留的方法主要有高效液相色谱法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。高效液相色谱法及其联用技术是目前国内测定硝基呋喃类代谢物使用最多、也是比较权威的方法，灵敏度高、精度高。但该法的样品前处理相对复杂，检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多、操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求。分光光度法可以判定水产品中是否存在硝基呋喃类代谢物，且不需昂贵的仪器与试剂，样品前处理操作简单，有较好的推广及应用价值，缺点是测定结果准确度较低。酶联免疫吸附法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定硝基呋喃类代谢物的免疫分析方法，具有特异性高、灵敏度高、快速、简便等优点。但是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。此外ELISA试剂寿命短，因此需要低温保藏。
发明内容
本发明针对水产中的硝基呋喃类代谢物残留展开研究，提供一种用于现场快速筛选水产中呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物以及呋喃它酮代谢物的方法，制备检测呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物以及呋喃它酮代谢物的免疫胶体金快速检测试剂板。本发明试剂板操作简单便捷，灵敏度高，实验结果肉眼可直观判断，无需配备仪器设备，检测既可在实验室中进行，也可在野外、水产市场等地方进行， 5-10min完成对样品中硝基呋喃类代谢物的定性和半定量测定。本发明制备一种免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有l_2mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。胶体金结合垫上包被有抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品 垫到吸水垫方向依次包被有硝基呋喃类代谢物-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。偶联硝基呋喃类代谢物的载体蛋白可为牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。本发明制备一种免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测水产中的硝基呋喃类代谢物残留。如果样品溶液含有硝基呋喃类代谢物残留，硝基呋喃类代谢物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的硝基呋喃类代谢物占据而无法与检测线上硝基呋喃类代谢物特异性抗原结合；当样品中的硝基呋喃类代谢物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中硝基呋喃类代谢物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。本发明制备一种免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板的各部分组成成分与功能如下塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。
硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。本发明试剂板具有如下有益效果(1)特异性好。本发明试剂板的抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体对硝基呋喃类代谢物的交叉反应率均为100%，与其他种类的抗生素包括磺胺类药物、氯霉素、孔雀石绿等没有交叉反应。(2)灵敏度高。本发明试剂板的灵敏度可达到0. 5 μ g/kg，符合国家检测要求，完全可以满足市场的检测需求。(3)操作简便快速。本发明试剂板将免疫层析反应所需的大部分原料已整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，滴样后5 8分钟内即可读取结果。本发明试剂板的操作不需任何专业培训，普通人员均可操作，只需按说明滴样后用肉眼判读即可。(4)不依赖于实验设备。本发明试剂板在直接滴样跑板后，通过肉眼判断硝酸纤维素膜上检测线和控制线的颜色深浅对比来判读结果，整个检测过程无需用到任何实验设备，真正做到了对实验设备零要求，尤其适合于野外及现场操作，易于推广。(5)成本低，效益好。本发明试剂板生产工艺简单，可实现单个样本检测，生产成本低，大大降低了检测费用。
图1为硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶， 8为PVC板。图2为硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。图3为硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。具体实施方法本发明试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备、抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体的制备、胶体金溶液、胶体金标记抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体的制备和硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板的组装。1.半抗原与载体蛋白的偶联硝基呋喃类代谢物对醛基苯甲酸衍生物合成称取3g对醛基苯甲酸于IOmL蒸馏水中，滴加二甲基甲酰胺(DMF)至对醛基苯甲酸完全溶解，搅拌中加入l.Og硝基呋喃类代谢物(呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物或者呋喃它酮代谢物)，室温反应2h，过滤水洗得白色固体即为硝基呋喃类代谢物对醛基苯甲酸衍生物。硝基呋喃类代谢物对醛基苯甲酸衍生物-牛血清蛋白(BSA)的合成称取23. 4mg 硝基呋喃类代谢物对醛基苯甲酸衍生物溶于2mLDMF，搅拌加入27. 5mg的DCC，14. 4mg的 NHS，4°C反应过夜，5000r/min离心lOmin，取上清液标记为A液。取170mg的BSA溶于IOmL 0. lmol/L的PBS (pH 8. 0)缓冲溶液，加入ImL的DMF溶解，标记为B液。将A液逐滴加入到B液中，同时搅拌。4°C下密封反应4h。5000r/min下离心lOmin，取上清液，4°C下PBS(pH 7. 4)透析3d，每天换液2次。反应产物_20°C冰箱保存备用。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备硝基呋喃类代谢物对醛基苯甲酸衍生物-卵清蛋白偶联物。2.抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C，5% CO2培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L BSA包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠 IgG-HRP(l 1000)，0PD显色。筛选出的阳性孔再用卵清蛋白偶联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X10_3mol/L硝基呋喃类代谢物溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0. Olmol/L、pH7. 4)替代硝基呋喃类代谢物溶液作对照，其余步骤同上。若硝基呋喃类代谢物阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X IOVmL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1% 柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体的制备取已制备好的胶体金溶液1001^，用0.111101/1碳酸钾溶液调？!1到8.0。边搅拌边加入2mg抗硝基呋喃类代谢物单抗，搅拌20min，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇 20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20，OOOrpm 离心 15min,弃上清液，加入 IOmL pH 7. 4 的 PBS 缓冲液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用IOmL #2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4) 溶解，用0. 22 μ m无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。5.硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板的组装用点膜机把适当浓度的载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记硝基呋喃类代谢物单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。检测试剂组成为一个PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法6. 1样品制备取一定量的去脂肪组织样本，用剪刀剪碎，称取2g剪碎样本于50mL离心管中，并加入4mL去离子水，0. 5mL lmol/L的盐酸，0. ImL样本衍生化试剂，充分混合3min ；60°C水浴条件下孵育lh，取出后加入5mL 0. lmol/L的磷酸氢二钾，0.4mL lmol/L的氢氧化钠，6mL 提取剂，充分混合lmin，4000r/min，离心5min，移取上层溶液3mL于5mL离心管中，60°C下空气吹干，向吹干的试管中加入ImL净化剂，加盖振荡lmin，然后加入0. 3mL复溶液，充分混勻，4000r/min，离心Imin (或静置至明显分层)，吸取0. 1 μ L下层溶液，待检。6. 2检测步骤吸取待检样品溶液100 μ L滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3 5min 读取，其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正面。6. 3结果判断读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面。阴性㈠T线显色(检测线，靠近加样孔一端)比C线(对照线)深或一样深，表示样品中硝基呋喃类代谢物残留含量低于检测限或不含硝基呋喃类代谢物残留。阳性⑴Τ线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中硝基呋喃类代谢物残留含量高于检测限，T线显色比C线越浅，表示样品中硝基呋喃类代谢物含量越高。无效未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。
权利要求
1.一种检测水产中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法，其特征在于所制备的试剂板的醋酸纤维膜上的胶体金结合垫上包被有抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体-胶体金标记物， 从样品垫到吸水垫方向依次是检测线和质控线，包被有硝基呋喃类代谢物-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG。
2.如权利要求1所说的快速检测方法，其特征在于将胶体金与抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体按一定比例混勻，使胶体金与抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体形成稳定的胶体金颗粒，通过浓缩形成抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体_胶体金标记物。
3.如权利要求书1所说的快速检测方法，其特征在于检测线上偶联硝基呋喃类代谢物的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
4.如权利要求1所说的快速检测方法，其特征在于样品中的硝基呋喃类代谢物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性；反之，当样品中硝基呋喃类代谢物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。
5.如权利要求1所说的快速检测方法，其特征在于工艺流程包括制备BSA偶联物、制备抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体、制备胶体金溶液、制备胶体金标记抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体和组装硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板。
全文摘要
本发明一种检测水产中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法，具体涉及一种检测水产中呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物以及呋喃它酮代谢物的快速检测方法。本发明制备一种免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需2h，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合工商部门、检验检疫机构、水产养殖、加工企业对水产中的硝基呋喃类代谢物进行大规模快速检测。
文档编号G01N33/577GK102175866SQ201010619520
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者周崇盈, 张少恩, 桑丽雅 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司