专利名称：用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置的制作方法
技术领域：
本实用新型是关于一种免疫分析用的装置，具体是指一种用于实施免疫纳米粒子 层析测定方法的装置，其包含经特殊设计的层析柱。
背景技术：
现在用于超微量的免疫分析方法有放射免疫分析、酶联免疫分析、荧光免疫分析、 时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析等，这些分析方法均需要将抗体或抗原通过化 学方法标记上相应的产生特殊信号的物质(例如碘-125、辣根过氧化物酶、荧光素、稀土元 素、化学发光物等)，通过相应的仪器或设备检测所述的特殊信号。该操作比较麻烦。而且， 所述标记物在免疫分析过程中，既是免疫试剂而直接参与免疫反应，又携带产生特殊信号 的物质，是超微量免疫测定中的关键物质，其质量一旦受到影响，就会给试剂盒的质量带来 十分不利的效果，甚至导致失败，而在化学法标记过程中，通常要经过氧化、还原等化学反 应的作用，有的还要受到辐射损伤(放射性同位素标记)，这些过程会对抗体或抗原的免疫 特性造成一定程度的损害，这必然会降低了检测试剂盒的质量。而且上述的免疫分析方法 一次实验均只能检测一个项目或指标。近年来发展起来的斑点免疫金渗滤测定法(金标免疫渗滤法，DotImmunogold Filtration Assay, DIGFA)虽然简化了操作方法，缩短了反应时间，操作快速简便，但由于 “斑点”量微的局限性，其检测灵敏度仍未达到理想水平。相应的检测装置为检测试纸或检 测芯片，其中是预先把检测项目固定在试纸或芯片上，不能变更检测项目或指标，应用不够 灵活。
实用新型内容本实用新型的设计人针对现有免疫分析方法所存在的不足，研究提供了一种将 纳米技术和免疫层析技术相结合的超敏免疫分析方法，可称为免疫纳米粒子层析测定 (Immunonanoparticles chromatographic assay, INCA)方法,本实用新型的主要目的在于 提供一种用于实施该免疫纳米粒子层析测定方法的装置，提高检测灵敏度。为达上述目的，本实用新型提供了一种用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装 置，该装置包括至少一个层析柱，所述层析柱设置有上段加样区、中段活性区以及下段排液 区，所述中段活性区内填充有用于捕捉固定待测物质的免疫吸附剂。本实用新型中，层析柱设计的结构特点是具有巨大的免疫浓缩 (immunoconcentration)效应。根据本实用新型的具体实施方案，本实用新型中，所述层析 柱上段加样区到中段活性区通过缩径结构连接，所述中段活性区到下段排液区通过缩径结 构连接，所述层析柱上段加样区内径6 10mm、高8 14mm优选10 14mm，中段活性区内 径2 4mm、高6 10mm，下段排液区内径1 2mm、高2 4mm，上段加样区过度到中段活性 区的缩径结构部分高3 5mm，中段活性区过度到下段排液区的缩径结构部分高2 4mm。 该实施方案中，上段主要是用于加样；中段细而长的填充有特定免疫吸附剂的活性区，可以
3有效地将待测样品中相应的抗体或抗原捕获、浓缩、集聚，而进行测定；下段主要是用于排 出剩余物(废液)，孔径细小有控制流速的作用。根据本实用新型的具体实施方案，本实用新型中，所述层析柱中段活性区的上下 两端还可嵌有与层析柱中段活性区的上下两端端口内径大小一致的多孔圆片，用以固定活 性区的免疫吸附剂，可以理解，多孔圆片的厚度在保证多孔圆片支撑强度的前提下越薄越 好，一般厚Imm或更薄。另外，在层析柱上、下端均可设置有弹性胶质封口帽，便于密封和抽 真空，利于保存。根据本实用新型的具体实施方案，本实用新型中，所述层析柱的活性区结构可有 多种形式，只要具有浓缩、集聚效果并有足够容量即可，浓缩、集聚作用是把极稀的被测物 集中在一起，足够容量是保障所捕获的被测物的量能被检测出来，例如可把活性区做成无 封闭孔的多孔圆柱体、方形柱体，或是填充有圆片、方片、圆球、椭圆体或无封闭孔的规则或 不规则形状的多孔介质等，也可以是填充无封闭孔的多孔(塑料)海绵、微球、烧结的玻璃 砂、纤维素(微晶、薄膜等)、葡聚糖、琼脂糖...等等，凡可用于物理或化学方法制备免疫吸 附剂的材料均可用于加工层析柱的活性区。根据本实用新型的具体实施方案，本实用新型中，所述层析柱下部设有将该层析 柱与另一层析柱叠加串接的结构。所述将层析柱与另一层析柱叠加串接的结构可以为卡扣 结构或螺接结构。例如，在本实用新型的一优选实施方案中，在所述层析柱上段柱体外表 侧设有外螺纹，该层析柱上段柱体的下端向下延伸出一筒体结构，且该延伸出的筒体结构 设有内螺纹，该延伸出的筒体结构的内螺纹能与另一层析柱上段柱体外表侧的外螺纹螺接 而实现两个层析柱的串联，且串联后上面的层析柱的底端高于下面的层析柱的活性区的上 端。根据本实用新型的具体实施方案，本实用新型中，所述层析柱中段的活性区分为 多个区带，分别填充有用于捕捉固定不同待测物质的免疫吸附剂，各区带之间有无活性的 隔罔层。应用本实用新型的装置实施免疫纳米粒子层析测定方法时，可以按照以下方法进 行将待测样品从加样区加入所述层析柱，并流经所述活性区；然后将悬浮有纳米粒子的 溶液从所述加样区加入层析柱，并流经所述活性区，其中所述纳米粒子披覆有能与所述待 测物质相结合的物质。所述纳米粒子可以为发光纳米粒子，也可以是有色纳米粒子。在将 悬浮有纳米粒子的溶液从所述加样区加入层析柱并流经所述活性区后，可根据层析柱活性 区内颜色变化或荧光变化对样品中待测物质进行定性或定量分析。还可根据需要增加流 经所述活性区的待测样品量，根据层析柱活性区内颜色变化或荧光变化对样品中待测物质 进行定性或定量分析。利用本实用新型的包含层析柱的装置进行免疫纳米粒子层析测定方法，测定原理 主要可应用各种免疫法如夹心法、竞争法等。例如，应用夹心法测定原理测定样品中的乙型肝炎病毒前Sl抗原(HBVPre SlAg)，在层析柱的活性区填充足够量的包被有HBV Pre SlAb (Si抗体)的免疫吸附剂，加 入待测样品后，当待测样品流经活性区时，如果待测样品中含有HBV Pre SlAg，该HBV Pre SlAg会与活性区内的其抗体结合而被固定下来；然后加入携带有发光纳米粒子(如荧光纳 米粒子)的Anti-HBs，其流经活性区时会与固定在抗体上的Sl抗原结合，形成带有荧光的免疫复合物；没有结合的发光纳米粒子经洗液洗涤而分离，通过测定荧光强度即可判定所 测样品中是否存在Sl抗原。显然，样品中抗原含量与荧光强度呈正相关，据此可以将所测 结果与用已知浓度的校准品进行比较，可定量测定样品中的HBV Pre SlAg含量；也可以将 校准品换成阴性、阳性对照品，可做定性测定。再如，采用间接法即采用二抗的夹心法测定样品中的抗巨细胞病毒IgG抗体 (Anti-CMV[IgG])，在活性区填充足够量的包被有CMV抗原的免疫吸附剂，当待测样品 加进层析柱后，样品流过包被有抗原的活性区，若样品中存在有Anti-CMV(IgG)，其将 会与其抗原结合而被固定下来；然后加入携带有发光纳米粒子(如荧光纳米粒子)的 Anti-IgG (人)，与固定在抗原上的IgG结合，形成带有荧光的免疫复合物；没有结合的荧光 粒子，经洗涤而除去；测定荧光强度即可判定血清样品中是否存在相应抗体。显然，样品中 抗原含量与荧光强度呈正相关，据此可以将所测结果与用已知浓度的校准品进行比较，可 定量测定样品中的抗体的含量；也可以将校准品换成阴性、阳性对照品，可做定性测定。上述应用夹心法测定原理的方案在实际测定时，如果待测样品中待测物质含量 微小，只需要几次加样，即重复加被测样品、发光纳米粒子和洗液的步骤，即可直接测量荧 光信号，省去了传统的温育和分离程序。又如，以测定样品中的游离甲状腺素(FT4)为例来说明应用竞争法测定原理的 具体操作。其中是在活性区填充足够量的包被有Anti-T4(鼠单克隆抗体)的免疫吸附 剂，当待测样品加进层析柱后，样品流过包被有抗体的活性区，样品中的FT4将会与其抗 体结合而被固定下来，然后加入足够量的携带有发光纳米粒子(如荧光纳米粒子)的 Anti-IgG(鼠)，与免疫吸附剂上剩余的抗体结合，形成带有荧光的免疫复合物；没有结合 的荧光粒子，经洗涤而除去；测定荧光强度即可判定样品中FT4的浓度。显然，样品中F T4 含量与荧光强度呈负相关，据此与已知浓度的校准品比较，可定量测知样品中FT4的含量。所述的发光纳米粒子可以用有色纳米粒子替代。用人眼观察层析柱活性区内颜色 变化判定结果，即可对样品中待测物质进行定性或定量分析。有色纳米粒子可根据需要或 嗜好选择不同的颜色。例如，根据人眼对光色彩的最敏感部位在490nm及590nm附近和色 差分辨特性，当用透明或半透明物做固相载体时，通常选用(草)绿色、青色、橙黄色、红色 等纳米粒子(如纳米陶瓷、纳米氧化镍、纳米金等)更敏感；当用白色物做固相载体时，以黑 色纳米粒子(如纳米银、铜、铁等)较佳(色差分辨)。应用本实用新型的装置实施免疫纳米粒子层析测定，其中结合运用了纳米技术和 免疫层析技术，检测灵敏度高。利用本实用新型的装置进行免疫纳米粒子层析测定，可以一次实验检测多项指 标。可以是利用装置中所述层析柱中段的活性区分为多个区带，分别填充有用于捕捉固 定不同待测物质的免疫吸附剂，各区带之间有无活性的隔离层。以利用本实用新型的包 含层析柱的装置一次实验检测Torch 5项抗体指标为例，该方案中，所述层析柱活性区分 为5个区带，每个区带检测1个项目(1项指标)，由上往下依次为测定Anti-CMV(IgG)、 Anti-HSV-I (IgG)、Anti-HSV-II (IgG)、Anti-RV(IgG)和 Anti-TOXO(IgG)，第一区带的填 充物包被有CMV，第二区带的填充物包被有HSV-I，第三区带的填充物包被有HSV-II，第四 区带的填充物包被有RV，第五区带的填充物包被有TOXO ；各区带之间有无活性的隔离层， 以便观察结果。测定时各区带的抗原分别与相应的抗体结合。以采用间接法(采用二抗的夹心法为例，实际测定方法可分两步进行加样品流过层析柱；洗涤后加粘附有纳米粒 子的二抗流过层析柱，洗涤后观察层析柱各区带的颜色判定结果。具体地，当待测样品加 进层析柱后，样品依次流过包被有抗原的5个区带，若样品中存在有相对应的抗体，将会 与各自的抗原结合而被固定下来；然后加入携带有色纳米粒子(如纳米氧化镍粒子)的 Anti-IgG (人)，与固定在抗原上的IgG结合，形成(草)绿色免疫复合物；没有结合的有色 粒子，经洗涤而分离；用人眼观察各区带的颜色即可判定所测样品中是否存在相应抗体。显 然，样品中的某种抗体越多，结合上的二抗就越多，因而结合上去的(草)绿色粒子就越多， 即色带颜色越深、越长，也就是说，样品中抗体含量与形成的色带颜色的深度和长度呈正相 关，据此与已知浓度的校准品进行比较，原则上也可用色谱扫描定量测知样品中抗体的含 量。根据本实用新型的具体实施方案，也可以是将所述层析柱下部设有将该层析柱与 另一层析柱叠加串接的结构，通过多个串接的层析柱进行一次实验测定多个项目。根据本实用新型的具体实施方案，本实用新型的用于实施免疫纳米粒子层析测定 方法的装置为一种试剂盒，该试剂盒包括多个所述的层析柱；阴性对照、阳性对照试剂和 /或校准试剂；纳米金；以及相应的洗液。本实用新型的装置，实际应用中设计成各个单独的又可叠加(串联)的层析柱，可 根据使用者需要任意组合成多项进行一次测定，测定更加方便。综上所述，归纳本实用新型的主要有益效果优势包括本实用新型的层析柱，活性区带很细(狭窄)而长，具有浓缩和集聚被测物质的 功能，检测灵敏度高；本实用新型的层析柱，能保存所用关键试剂(抗体、抗原等)原来所处的环境，有 利于保存，增加了稳定性；本实用新型结构简单，制备难度低，这既避免了昂贵的原料的损耗，降低了生产成 本，也减少了劳动和时间；本实用新型的层析柱可设计为可串接的式样，可一次实验测定多项指标，比预先 把检测项目固定死的免疫检测芯片优越，一是灵敏度高，二是应用灵活，可以根据需要随意 叠加组合层析柱进行一次多项测定；本实用新型的层析柱通过免疫浓缩作用，使存在于样品中的被测物如某种抗原与 固相载体上的对应抗体有零距离接触机会，大大缩短了抗原抗体结合反应的时间，检测快 速，整个检测可在几分钟内完成。
图1为本实用新型的装置中层析柱的结构示意图。图2为本实用新型的两个层析柱串联的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本实用新型的技术方案，但本实用新型并不 因此而受到任何限制。实施例1
6[0033]请参见图1所示，本实施例提供了一种层析柱，该层析柱设置有上段加样区11、中 段活性区12以及下段排液区13，这三段均为圆筒状。所述上段加样区11到中段活性区12 通过第一缩径结构14连接，所述中段活性区12到下段排液区13通过第二缩径结构15连 接。上段加样区11内径8mm、高8mm，中段活性区12内径2mm、高10mm，活性区内填充有用 于捕捉固定待测物质的免疫吸附剂，上段加样区过度到中段活性区的第一缩径部分14高 4mm，下段排液区13内径1mm、高6mm，中段活性区过度到下段排液区的第二缩径部分15高 约3mm。中段活性区12的上下两端嵌有与对应处层析柱内径大小一致的多孔圆片16、17 (中 段活性区下端口的多孔圆片17直径可比上端口的多孔圆片16的直径略小)，用以固定活性 区的免疫吸附剂；层析柱上下端均可设置有弹性胶质封口帽18、19，便于密封和抽真空，利 于保存(使用层析柱时应摘下封口帽)。此外，中段活性区柱体与下段排液区柱体也可设计 成分别与其上过度段的缩径结构相互螺接的结构，方便拆卸清洗。图1中显示的层析柱上 段加样区柱体11的下端向下延伸出环绕在所述第一缩径结构14外的筒体结构20，且该筒 体结构20设有内螺纹，该层析柱的所述筒体结构20的内螺纹能与另一层析柱上段柱体外 表侧的外螺纹螺接而实现两个层析柱的串联。实施例2请参见图2所示，本实施例的装置中包括两个串联的层析柱，每一层析柱设置有 上段加样区11、中段活性区12(所述中段活性区内填充有用于捕捉固定待测物质的免疫吸 附剂)以及下段排液区13，所述上段加样区11到中段活性区12通过第一缩径结构14连 接，所述中段活性区12到下段排液区13通过第二缩径结构15连接；上段内径约为10mm， 高约12mm ；中段内径4mm，高6mm，第一缩径部分高约4mm，第二缩径部分高约3mm;下段内径 1mm，高2mm;中段的上下两端嵌有与对应处层析柱内径大小一致的多孔圆片16、17，用以固 定活性区的免疫吸附剂，层析柱上下端均可设有封口帽18、19 ；所述层析柱上段柱体11的 下端向下延伸出环绕在所述第一缩径结构14外的筒体结构20，且该筒体结构20设有内螺 纹，上面的层析柱通过所述筒体结构20的内螺纹与下面另一层析柱上段柱体外表侧的外 螺纹螺接而实现两个层析柱的串联，且串联后上面的层析柱的底端高于下面的层析柱的活 性区的上端。应用实例1、测定样品中HBsAg指标1.试剂组成系列校准品，各1瓶；测定HBsAg层析柱，50或100支，其结构如实施例1 ；荧光纳米粒子(被覆有Anti-HBs)，1瓶；浓缩洗液，1瓶。2.测定程序(1).取下层析柱上下封盖，设校准品和样品层析柱；(2).各自层析柱中加校准品、样品200μ 1，待样品液流过层析柱活性区带后，加 稀释后的洗液500 μ 1洗管；(3).各管加荧光纳米粒子100μ 1，待样品液流过层析柱活性区带后，同上洗孔；(4).用专用荧光测定仪测量各柱的荧光强度。3.结果判定
7[0048](1).按l0g(d0Se) Iog(B-Bo)做出校准品的剂量-反应曲线，要求相关系数r > 0. 9900，实验可靠；(2).从剂量-反应曲线求出被测样品的HBsAg浓度；(3).正常值参考正常人血清< 0. 05IU/ml。应用实例2、一次实验测定样品中HBsAg和HBeAg两项指标1.试剂盒组成1. 1.阴、阳性对照，各1瓶；1. 2.测定HBsAg和HBeAg层析柱，其结构同实施例2 ；各50或100套(每两支串 联在一起的层析柱为一套)；1. 3.纳米金(分别被覆有Anti-HBs和Anti-HBe)，各1瓶；1.4.浓缩洗液，1瓶。2.试剂盒制备2. 1.层析柱的制备2. 1. 1.层析柱的基本结构参数请参见实施例2。2. 1. 2.制备免疫吸附剂(immunoadsorbents)以透明无色的聚氯乙烯或尼龙微球或聚苯乙烯(<2 < Imm)为载体，用物理吸附法 制备，微球分别被覆Anti-HBs和Anti-HBe，除去包被液，封闭后晾干备用。2. 1. 3.装配层析柱将一多孔小圆片放进柱中段底部，中段加满免疫吸附剂，崁入多孔小圆片(固定 牢固)，两端盖好封口帽(无毒橡胶)，从上帽抽适度真空后，在上段贴好标签。于2 8°C 下保存。2. 2.抗体纳米金2. 2. 1. Anti-HBs纳米金(也可商购获得)将IOml浓度为0. lmg/ml氯金酸溶液加热煮沸，加入浓度为10mg/ml柠檬酸三 钠 0. 15ml，用 0. lmol/L HCl 调 pH 至 6. 0，加入 Anti-HBs 0. lmg，搅拌 lOmin，3000r/min 离 心 20min，取上清，12000r/min 离心 20min，将沉淀悬于 100ml (调试)含 BSA,0. 2mg/ml NaN3的PBS中，每瓶分装10ml，贴好标签后置2 8°C下保存。2. 2. 2. Anti-HBe 纳米金通2. 2.1项制备。2.3.对照品阳性对照含适量HBsAg和HBeAg，阴性对照为正常人血清和小牛血清混合而成。各 按Iml/瓶分装。贴好标签后于2 8°C下保存。2.4.浓缩洗液同前。3.试剂盒使用3. 1.测定程序3.1.1.取下层析柱上下的封口帽，叠加组成2层(参见图2)，设对照和样品层析 柱；3. 1. 2.各自层析柱中加对照、样品200 μ 1，待样品液流过下层层析柱区带后，加
8稀释后的洗液500 1000 μ 1洗管；3. 1. 3.各管加纳米金4滴(约200 μ 1)，待样品液流过第1层层析柱区带后，同上 洗孔；3.2.结果判定3. 2. 1.阳性对照管显2条红色带，而阴性对照管基本无色，实验可靠；3. 2. 2.显红色带的样品管为阳性，按区带判定是HBsAg和HBeAg ；3. 2. 3.根据色带的深浅、长短可做大致定量判定，色深而长的阳性强。
权利要求一种用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于该装置包括至少一个层析柱，所述层析柱设置有上段加样区、中段活性区以及下段排液区，所述中段活性区内填充有用于捕捉固定待测物质的免疫吸附剂。
2.根据权利要求1所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 所述层析柱上段加样区到中段活性区通过缩径结构连接，所述中段活性区到下段排液区通 过缩径结构连接，所述层析柱上段加样区内径6 10mm、高8 14mm，中段活性区内径2 4mm、高6 10mm，下段排液区内径1 2mm、高2 4mm，上段加样区过度到中段活性区的缩 径结构部分高3 5mm，中段活性区过度到下段排液区的缩径结构部分高2 4mm。
3.根据权利要求1所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 所述层析柱中段活性区的上下两端嵌有与层析柱中段活性区的上下两端端口内径大小一 致的多孔圆片。
4.根据权利要求1所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 所述层析柱上、下端均设置有弹性胶质封口帽。
5.根据权利要求1所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 所述层析柱的中段活性区为无封闭孔的多孔圆柱体、方形柱体，或填充有圆片、方片、圆球、 椭圆体或无封闭孔的多孔介质。
6.根据权利要求1所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 所述层析柱下部设有将该层析柱与另一层析柱叠加串接的结构。
7.根据权利要求6所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 所述将层析柱与另一层析柱叠加串接的结构为卡扣结构或螺接结构。
8.根据权利要求7所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 在所述层析柱上段柱体外表侧设有外螺纹，该层析柱上段柱体的下端向下延伸出一筒体结 构，且该延伸出的筒体结构设有内螺纹，该延伸出的筒体结构的内螺纹能与另一层析柱上 段柱体外表侧的外螺纹螺接而实现两个层析柱的串联，且串联后上面的层析柱的底端高于 下面的层析柱的活性区的上端。
9.根据权利要求1所述的用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，其特征在于 所述层析柱中段的活性区分为多个区带，分别填充有用于捕捉固定不同待测物质的免疫吸 附剂，各区带之间设有无活性的隔离层。
10.根据权利要求1所述的装置，该装置为试剂盒。
专利摘要本实用新型提供了一种用于实施免疫纳米粒子层析测定方法的装置，该装置包括至少一个层析柱，所述层析柱设置有上段加样区、中段活性区以及下段排液区，所述活性区内填充有用于捕捉固定待测物质的免疫吸附剂。该装置结构简单，操作便捷，应用本实用新型的装置实施免疫纳米粒子层析测定，检测灵敏度高，且可一次测定多个项目。
文档编号G01N33/52GK201707334SQ20102015135
公开日2011年1月12日 申请日期2010年4月2日 优先权日2010年4月2日
发明者王立莉 申请人:王立莉