专利名称：荧光检测装置和荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光检测装置和荧光检测方法，其中，接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对获得自该荧光的荧光信号进行信号处理。
背景技术：
用于医疗、生物领域的流式细胞仪，其为接收测量对象物被光照射后发出的光、并对测量对象物的种类进行特定和分析的装置。具体来说，流式细胞仪中，采用荧光试剂使包括细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等活体物质的浑浊液标签化，然后施加压力以使测量对象物流动在以每秒IOm以下程度的速度在管道内流动的鞘液中流动，由此形成分层鞘流。通过朝向该流动中的测量对象物照射激光，由 此接收附着在测量对象物上的荧光色素所发出的荧光，并将该荧光作为标签进行识别，由此特定测量对象物。在该流式细胞仪中，例如能够测量出细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白质等在细胞内的相对量，且在短时间内能够对这些物质的作用进行分析。特别是在医疗领域，盛行对蛋白质之间的相互作用的研究，由此突光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer,FRET)得到有效利用。FRET是指，通过激光照射而被激发的第一分子能量激发第二分子，由此第一分子的能量朝向第二分子的能量转移的现象。在下述专利文献I中记载有一种除了荧光检测信息的不确定因素外，可以定量测量出FRET效率的检测方法和检测装置。在该检测方法和检测装置中，朝向测量对象样品照射以规定频率对激光强度进行时间调制的激光，并用多个检测传感器来接收此时测量对象样品所发出的荧光，由此收集到含有测量对象样品所发出的荧光的荧光强度信息和相位信息的检测值。专利文献I :特开2007-240424号公报
发明内容
然而，在上述公报所记载的检测方法和检测装置中，由于测量对象样品所发出的荧光的荧光强度动态范围较广，因此有时发生用来接收荧光的受光元件的输出处于饱和状态、且无法得到荧光的相位信息的情况。另一方面，在采用光电倍增管(PMT)的情况下，通过控制加速电压的方式进行增益调节，由此通常可以防止受光元件的输出饱和。但是，在该增益调节中，由于在PMT内部对用来加速电子的加速电压进行控制，而使电子渡越时间发生变化，因此存在无法正确地得到荧光相位信息的问题。因此需要繁琐地准备用来校正的表格。这种受光元件的输出饱和问题，并不限定于采用FRET的荧光检测。另外，将减光镜设置在PMT或雪崩光电二极管等元件的受光面前面，并根据所求出的荧光强度，利用减光镜有规律地调整光强度，由此可以防止受光元件的输出饱和。然而，在该方法中，难以在测量对象样品通过被激光照射的测量位置的数十秒等的短时间内进行调整。因此，本发明的目的在于，接收位于测量位置的测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对获得自该荧光的荧光信号进行信号处理的荧光检测装置和荧光检测方法中，通过与以往不同的方法改善受光部的输出饱和。通过下述的荧光检测装置可以达到接收位于测量位置的测量对象物受到激光照射后所发出的荧光、且对获得自该荧光的荧光信号进行信号处理的上述目的。S卩，荧光检测装置包括(A)激光光源部，发射用以照射测量对象物的激光；(B)受光部,输出测量对象物被激光照射后所发出的突光的突光信号；(C)光源控制部，生成具有规定频率的调制信号，以便对发射自所述激光光源部的激光强度进行时间调制；·(D)处理部，根据由所述受光部输出的、测量对象物受到时间调制的激光照射后所发出的荧光信号，利用所述调制信号计算出测量对象物所发出的荧光的荧光弛豫时间；(E)所述受光部包括使荧光在所述测量对象物的测量位置和荧光的受光面之间发生聚集的透镜，还包括使通过所述透镜的所述荧光形成具有均匀光强度分布的光束的装置、以及将通过该装置而形成的荧光的所述光束分割给多个区域而使多个区域分别接收这些被分割的光束的受光元件。此时，优选的是，所述受光部包括将所述多个区域的每个区域上得到的部分荧光信号进行加法处理后作为一个荧光信号的信号加法器。优选的是，在所述受光部中，所述多个区域的每个区域上均设置有是否将所述多个区域的每个区域上得到的部分荧光信号提供给所述信号加法器的开关电路。优选的是，所述处理部除了计算所述荧光弛豫时间以外，根据所述荧光信号计算出荧光强度，当荧光强度超过规定阈值时，通过所述开关电路限制供给到所述信号加法器的所述部分荧光信号的供给数量。优选的是，在所述受光部设置有增益调节器，以便在所述部分荧光信号被供给到所述开关电路之前，对所述多个区域的每一个所述部分荧光信号进行增益调节，以使所述部分荧光信号的增益达到一致。优选的是，所述受光部的结构为，在所述透镜和所述受光面之间包括漫射板，以使所述荧光通过所述透镜在所述漫射板上成像。同样优选的是，所述受光部的结构为，在所述透镜和所述受光面之间包括平行于所述透镜的光轴设置的筒状光波导管，以使入射的荧光在壁面上反射。或者，也同样优选的是，所述受光部的所述透镜使聚集的荧光呈大致平行的光，由此形成具有均匀光强度分布的荧光。进而，通过以下的荧光检测方法，可以达到接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光、且对获得自该荧光的荧光信号进行信号处理的上述目的。即，上述荧光检测方法包括下述步骤(F)以具有规定频率的调制信号对用来照射测量对象物的激光强度进行时间调制后将其照射在测量对象物上的步骤；(G)将测量对象物受到激光照射后所发出的荧光作为光强度呈均匀分布的光束，并将所述荧光的光束分割给多个区域而使多个区域接收这些被分割的光束，由此生成多个部分荧光信号的步骤；(H)至少对所述多个部分荧光信号中的一部分进行加法处理，以生成一个荧光信号的步骤；(I)根据生成的所述荧光信号，利用所述调制信号计算出测量对象物所发出的荧光的荧光弛豫时间的步骤。此时优选的是，当根据荧光信号所计算出的测量对象物所发出的荧光的荧光强度超过规定阈值时，限制进行加法处理的所述部分荧光信号数量。在上述的荧光检测装置和荧光检测方法中，使通过所述透镜的所述荧光形成具有均匀光强度分布的光束后，将该荧光的光束分割给多个区域而使多个区域分别接收这些被分割的光束。在上述的荧光检测装置和荧光检测方法中，由于使具有均匀光强度分布的荧光分散在多个受光面并被多个受光面所接收，因此能够改善受光部中受光元件的输出饱 和。另外，在使用开关电路的情况下，最初当开启所有开关电路时所输出的荧光强度超过规定阈值时，可以切换到关闭部分开关电路的操作。由此能够自由地控制处理部内的信号水平，因此与以往相比，可以得到更大的、能够在处理部内进行处理的荧光强度的动态范围，且可以在较宽的动态范围中计算出荧光弛豫时间。
图I为使用本发明一实施方式的荧光检测装置的流式细胞仪的概略构成图；图2为表示图I所示的流式细胞仪中激光光源部的一例的概略构成图；图3为表示图I所示的流式细胞仪中受光部的一例的概略构成图；图4为表示图I所示的流式细胞仪中控制和处理部的一例的概略构成图；图5为表示图I所示的流式细胞仪中分析装置的一例的概略构成图；图6表示图3所示的受光部的另一例的概略构成图；图7表示图3所示的受光部的其他另一例的概略构成图。附图标记说明10流式细胞仪12 样品22激光光源部22a激光光源22b 透镜22c激光驱动器24、26、126、136 受光部26a、126a、136a 透镜26b漫射板26c、126c、136c 带通滤波器26屯 dn光电倍增管26e1 en> 126e! en> ISBe1 en 增益调节器
26f\ fnU26f! 4,136^ fn 开关电路26g、126g、136g信号加法器电路26hj 1^1361^ hn 透镜阵列126 光波导管28控制和信号处理部30 管道32回收容器
40信号生成部42信号处理部44控制器46振荡器48功率分配器50、52、54、62 放大器58 IQ 混频器60低通滤波器80分析装置80a突光强度信号生成部80b荧光强度计算部80c相位滞后计算部80d信号控制部SOe荧光弛豫时间计算部
具体实施例方式以下，根据附图所示的实施方式，对本发明的荧光检测装置和荧光检测方法进行说明。(实施方式)图I为使用荧光检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。流式细胞仪10包括信号处理装置20和分析装置(计算机)80。信号处理装置20，当作为测量对象的被荧光染色的荧光蛋白质等的样品12通过用来检测荧光的测量位置时受到激光照射，由此检测出样品12中荧光色素所发出的荧光的荧光信号并对该荧光信号进行信号处理。分析装置80，根据通过信号处理装置20所得到的处理结果计算出样品12中测量对象物的荧光弛豫时间并分析测量对象物。信号处理装置20包括激光光源部22、受光部24、26、控制和处理部28和管道30。控制和处理部28包括控制部，以规定频率对来自激光光源部22的激光进行强度调制；信号处理部，对来自样品12的荧光信号进行处理。在管道30中，使样品12包括在形成高速流的鞘液中流动，由此形成分层鞘流。管道30的出口处设置有回收容器32。流式细胞仪10还可以具有如下结构在流式细胞仪10中配置有细胞分类器，用来通过激光照射在短时间内判断出样品12是否为特定样品，并从其它样品中将其分离，由此将其分离于各自的回收容器。
激光光源部22发发射规定波长的激光。透镜按照使激光聚焦在管道30中的规定位置的方式进行设置，该聚焦位置为检测样品12所发出的荧光的测量位置。图2为表示激光光源部22构成的一例的图。激光光源部22包括激光光源22a、透镜22b和激光驱动器22c。激光光源22a发射具有350nm 800nm可视光带内的规定波长、且进行强度调制的激光。激光光源22a，例如将红色激光作为强度固定的CW(连续波)激光发射，且发射时以规定频率对该CW(连续波)激光进行强度调制。或者，将绿色激光作为强度固定的CW激光发射，且发射时以规定频率对该CW激光进行强度调制。或者，例如将青色激光作为强度固定的CW(连续波)激光发射，且发射时以规定频率对该CW(连续波)激光进行强度调制。透镜22b使激光聚焦在管道30中的测量位置上。激光以具有数十μ m程度直径 的射束照射在样品12上。激光驱动器22c利用供给自控制和处理部28的信号生成用于驱动激光光源22a的信号。作为激光光源22a，例如可以使用半导体激光器。激光是例如以5 IOOmW程度的输出功率输出的激光。另一方面，对于用来调制激光强度的频率(调制频率)，其周期与样品12的荧光色素的荧光弛豫时间相比稍长，例如为10 50MHz。激光光源22a在预先规定好的波段进行振荡，以使荧光色素激光被激发后发射特定波段的荧光。被激光所激发的荧光色素被附着在需测量的样品12上，当样品12作为测量对象物通过管道30的测量位置时，在测量位置受到激光照射后，上述荧光色素发出具有特定波长的荧光。受光部24包括光电转换器，该光电转换器按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置，且激光因通过测量位置的样品12而发生前向散射，由此输出样品12通过测量位置时的检测信号。输出自该受光部24的信号被供给到控制和处理部28，并在控制和处理部28中作为通知样品12正通过管道30中的测量位置的时间的触发信号来使用。另一方面，受光部26配置在通过测量位置并垂直于发射自激光光源部22的激光发射方向的平面与通过测量位置并垂直于管道30中的样品12的流动方向的平面相交的位置上，该受光部26包括用来接收样品12在测量位置所发出的荧光的光电倍增管。图3为表示受光部26的一例的概略构成的构成图。图3所示的受光部26包括，透镜26a、漫射板26b、带通滤波器26c、PMT (光电倍增管)26屯 dn(n为I以上的整数)、增益调节器26ei en(n为I以上的整数)、开关电路26f\ fn(n为I以上的整数)、信号加法器电路(功率合成器)26g和透镜阵列26^ !η(η为I以上的整数)。透镜26a是用来聚焦样品12所发出的荧光的透镜。漫射板26b是使通过透镜26a而成像于漫射板26b上的突光发生漫射的板部件。所使用的漫射板26b有表面呈凹凸状的片状漫射板或使引起漫反射的微粒子等分散在透明基板中的片状漫射板，以使入射到透明基板的光发生漫反射。入射到漫射板26b上的荧光形成具有均匀光强度分布的漫射光之后从漫射板26b发射。带通滤波器26c被设置在PMT (光电倍增管)26^ dn的受光面的前面，其为仅使具有规定波段的荧光透射的滤波器。透射的荧光波段按照与荧光波段相对应的方式进行设定。透镜阵列264 hn通过聚焦使通过带通滤波器26c的荧光光束中位于后述多个ΡΜΤ26(^ dn的受光面的间隙或分隔部的部分也能够有效地接收荧光。另外，由于入射到PMT26C1! dn分隔部的突光使电子在分隔部内发生移动且电子的渡越时间较长，因此生成不需要的荧光信号。由此，透镜阵列26匕 hn按照与ΡΜΤ26(^ dn的受光面相对应、且使荧光不入射到分隔部的方式设置间隔或大小。ΡΜΤ26(^ dn是输出荧光的荧光信号的部分，其将荧光光束分割给多个区域并在多个区域分别接收这些光。ΡΜΤ26(^ dn虽然是将多个PMT捆包在一起而形成的，但也可以使用多通道的PMT。在受光部26中也可以使用代替PMT的雪崩光电二极管。增益调节器26ei en包括电流-电压转换部和电压调节部。在电流_电压转换部，由于ΡΜΤ26(^ <输出的是电流，因此将该电流转换为电压，以使其能够进行信号的加法处理。电压调节部通过调整电压放大器的增益或可变电阻器的电阻值来调节电压。由此，即时在具有固定光强度分布的光被入射的情况下，通过调节增益使荧光信号在相同电压的情况下输出。即，各个区域的荧光信号被供给到开关电路26f\ fn之前，使每个区域的增益通过调整达到一致。之所以调整各区域的荧光信号(以下，称为部分荧光信号)的增益使区域之间的增益达到一致，是因为如后述、通过开关电路26f\ fn控制部分荧光信号的·合计数的缘故。在开关电路26f\ fn中进行朝向各区域供给部分荧光信号的开启/关闭操作，以便对是否将成为电压信号的部分荧光信号提供给后述的信号加法器电路26g进行控制。该开启/关闭操作通过后述的、来自分析装置80的信号控制部80的控制信号来进行控制。由此，可以对供给到信号加法器电路26g的部分荧光信号的数量进行限制。信号加法器电路26g对通过开关电路26f\ fn而供给的部分荧光信号进行加法处理并将其用作一个荧光信号。即，多个区域中通过开关电路26fi fn而供给的部分荧光信号被加在一起，并作为一个突光信号来输出。用来控制开关电路26f\ fn的开启/关闭操作的控制信号生成于分析装置80。具体来说，当分析装置80所计算出的荧光强度超过规定阈值时生成控制信号，以限制相对于开关电路26f\ fn的、朝向信号加法器电路26g供给部分荧光信号的供给数。在开关电路26f\ fn中，对哪个位置的开关电路进行开启操作没有特别的限制。荧光信号是通过漫射板26b形成具有均匀光强度分布的漫射光后，通过ΡΜΤ26(^ dn接收而得到的信号，而且该荧光信号是各区域的部分荧光信号的增益被调整至相一致的信号。生成于信号加法器电路26g的一个荧光信号被供给到控制和处理部28的信号处理部42内的放大器54。另外，在本实施方式中，虽然设置有增益调节器26ei en和开关电路26f\ fn，但当接收具有均匀光强度的光束的光的ΡΜΤ26(^ dn所输出的各电流相一致时，也可以使用省略增益调节器26ei en、通过开关电路对各个电流进行选择性加法处理后转变成电压的构成。由于在电流的加法计算中仅使用开关电路，因此可以形成简单的构成。另外，在本实施方式中，对于开关电路26& 4的开启/关闭操作，其由来自分析装置80的信号控制部80d的控制信号来控制。然而，流式细胞仪10的操作者也可以一边参考所输出的荧光强度计算结果，一边通过人工输入来设定开启或关闭开关电路26f\ fn的开关电路。如图4所示，控制和处理部28包括信号生成部40、信号处理部42和控制器44。信号生成部40和控制器44形成用于生成具有规定频率的调制信号的光源控制部。信号生成部40是生成以规定频率对激光强度进行调制(振幅调制)的调制信号的部分。具体来说，信号生成部40包括振荡器46、功率分配器48和放大器50、52，且通过放大器50将所生成的调制信号供给到激光光源部22的激光驱动器22c的同时，通过放大器52将上述的调制信号供给到信号处理部42。将调制信号供给到信号处理部42的原因在于，如后所述，将输出自信号加法器电路26g的荧光信号作为用来检波的参照信号来使用。其中，调制信号为具有规定频率的正弦波信号，被设定在10 50MHz范围的频率。信号处理部42是利用输出自信号加法器电路26g的荧光信号，提取样品12通过激光照射所发出的突光的相位滞后相关的信息的部分。信号处理部42包括,放大器54、IQ混频器58、低通滤波器60和放大器62。放大器54对输出自信号加法器电路26g的突光信号进行放大。IQ混频器58接收将放大的荧光信号作为供给自信号生成部40的正弦波信号的调制信号，并以该调制信号为参照信号与被放大的荧光信号进行混合。低通滤波器60对由IQ混频器58所处理的结果进行过滤并提取含有直流成分的低频成分。放大器62对低 频成分的信号进行放大。IQ混频器58是使供给自信号加法器电路26g的荧光信号与将供给自信号生成部40的调制信号作为参照信号的荧光信号进行混合的装置。具体来说，在IQ混频器58中，对参照信号与荧光信号(RF信号)进行乘法计算，以便生成荧光信号中包括cos成分和高频成分的处理信号，同时对将参照信号的相位发生90度位移的信号和荧光信号进行相乘，以便生成荧光信号中包括sin成分和高频成分的信号。含有该cos成分的处理信号和含有sin成分的处理信号被供给到低通滤波器50。在低通滤波器50，从上述处理信号中提取荧光信号的cos成分和sin成分，被提取的cos成分(以下称Re成分数据)和sin成分(以下称Im成分数据)在放大器62放大后被供给到分析装置80。控制器44按照使信号生成部40生成具有规定频率的正弦波信号的方式进行控制，同时利用供给自受光部24的检测信号生成开始处理样品12的触发信号并将其输出到IQ混频器58。由此，IQ混频器58得到样品12经过测量位置的时间，并开始对荧光信号的处理。分析装置80利用所供给的Re成分数据(荧光信号的cos成分)和Im成分数据(荧光信号的sin成分)求出荧光的相位滞后Θ和荧光强度值。进而在分析装置80中，当该荧光强度值偏离预先设定的范围时，通过开关电路26fi fn生成用来限制供给到信号加法器电路26g的部分荧光信号数量的控制信号，并朝向开关电路26f\ fn供给该控制信号。图5是表示分析装置80的概略构成的图。分析装置80包括荧光强度信号生成部80a、荧光强度计算部80b、相位滞后计算部80c、信号控制部80d和荧光弛豫时间80e。这些各部分是通过执行计算机可执行程序而形成的模块。即，分析装置80是在计算机上通过启动软件来产生各功能。除此之外，分析装置80包括AD转换器80f。荧光强度信号生成部80a是通过对供给自放大器62且通过AD转换器80f转换成数字信号的Re成分数据和Im成分数据进行平方和而求出平方根，由此计算出荧光强度信号的部分。所计算出的荧光强度信号被输送到荧光强度计算部80b。其中，荧光强度信号是利用在样品12通过激光测量点期间连续被供给的Re成分数据和Im成分数据而计算出的时序数据。在荧光强度计算部80b，根据输出自荧光强度信号生成部80a的时序数据的荧光强度信号，求出样品12通过激光测量位置期间的荧光强度值。当上述开关电路26f\ fn的开启动作数量受到限制时，荧光强度计算部80b利用该开启动作的数量信息求出荧光强度值。当开启动作的数量受到限制时，其与整个开关电路26& 4均处于开启状态时的情况相比，求出荧光强度值时采用较大的校正系数。求出的值可以是各个时间的每一个荧光强度值，或也可以是通过测量位置期间中的一个积分值。样品12通过测量位置的情况可通过供给自受光部24的检测信号来得知。由此求出的荧光强度值被供给到信号控制部80d。相位滞后计算部80c利用供给自放大器62且通过AD转换器80f转换成数字信号的Re成分数据和Im成分数据计算出tarT1 (Im/Re) (Im是Im成分数据值，Re是Re成分数据值)，由此计算出相位滞后Θ。所计算出的相位滞后Θ被供给到信号控制部80d。另外，所计算出的相位滞后Θ被供给到荧光弛豫时间计算部80e。在荧光弛豫时间计算部80e中，利用供给自相位滞后计算部80c的相位滞后Θ、且 根据式τ = {1/(2 Jif)} ^tanQ求出荧光弛豫时间τ。之所以能够通过上述式计算出荧光弛豫时间τ，这是因为荧光是大致随着一次滞后做出弛豫响应的缘故。其中，调制信号的频率f被预先固定。信号控制部80d对供给自荧光强度计算部80b的荧光强度值是否已进入预先设定的范围进行判定，并根据判定结果生成开关电路26f\ fn的控制信号。当上述值进入到预先设定的范围时，朝向荧光强度计算部80b和荧光弛豫时间计算部80e发出将荧光强度的计算结果和荧光弛豫时间的计算结果输出的指示。S卩，在信号控制部80d，当供给自荧光强度计算部80b的荧光强度值没有进入到预先设定的范围时，求出关闭开关电路26f\ fn的操作数量，并根据该操作数量生成控制信号。具体来说，当荧光强度超过规定阈值时，限制通过开关电路26f\ 仁朝向信号加法器26g供给部分荧光信号的数量。根据信号控制部80d对荧光强度的判断结果，实施开关电路26f\ fn的开启/关闭动作。所计算出的荧光强度、荧光弛豫时间τ、时序数据的荧光信号和相位滞后数据被输出到未图示的输出装置。在这样的流式细胞仪10中，首先，朝向处于测量位置的样品12照射以规定频率的调制信号对激光强度进行时间调制的激光。然后，受光部26通过漫射板26b使样品12被激光照射后所发出的荧光形成具有均匀光强度分布的光束，PMT^ed1 dn的多个区域对该荧光光束进行分割、且接收该荧光光束。由此，在每一个区域生成部分荧光信号。在信号加法器电路26g中，至少对生成在多个区域的每个部分荧光信号的一部分进行加法计算，进而生成一个荧光信号。在控制和处理部28与分析装置80中，利用调制信号从所生成的荧光信号中提取样品12所发出的荧光的Re成分数据和Im成分数据，且利用该Re成分数据和Im成分数据求出荧光弛豫时间。此时，当根据荧光信号所计算出的样品12所发出的荧光的荧光强度超过规定阈值时，限制生成于PMTZed1 dn的每个区域的部分荧光信号的合计数。如上所述，流式细胞仪10的受光部26包括透镜26a和漫射板26g，且在受光部26，利用漫射板26g使通过透镜26a的荧光形成具有均匀光强度分布的光束，然后使该荧光光束通过ΡΜΤ26(^ dn被分割到多个区域，多个区域分别接收这些被分割的荧光。由此，使荧光作为具有均匀光强度分布的光而分散在多个受光面上并被该受光面所接收，因此可以改善ΡΜΤ26(^ dn的输出饱和。另外，最初，实施开启所有开关电路26f\ fn的操作的情况下，当由分析装置80所计算出的荧光强度超过阈值时，可以切换到关闭部分开关电路26f\ fn的操作。因此，能够自由地控制信号处理部42和分析装置80内的信号水平，因此与以往相比，可以得到更大的、能够在信号处理部42和分析装置80内进行处理的荧光强度的动态范围，且可以在较宽的动态范围中计算出荧光弛豫时间。由于接收的荧光强度分布在光束内处于均匀状态，因此只要得到通过开关电路26f\ fn处于关闭状态的部分荧光信号的数量信息即可，无需知道关闭哪个开关电路26f\ fn的信息。(实施方式的变形例I)图6表示作为图3所示的受光部26的变形例的受光部126的构成图。受光部126与受光部26 —样，被配置在通过测量位置并垂直于发射自激光光源部22的激光发射方向 的平面与通过测量位置并垂直于管道30中的样品12的移动方向的平面相交的位置上，该受光部126包括用来接收样品12在测量位置所发出的荧光的光电倍增管。受光部126包括对来自样品12的荧光进行聚集的透镜126a、带通滤波器126c、光波导管126i、PMT (光电倍增管)126屯 dn(n为I以上的整数)、增益调节器126ei en(n为I以上的整数)、开关电路126& 4(11为I以上的整数)、信号加法器电路126g和透镜阵列1264 hn(n为I以上的整数)。透镜126a、带通滤波器126c、PMT(光电倍增管)126屯 dn(n为I以上的整数)、增益调节器126ei en(n为I以上的整数)、开关电路126f\ fn(n为I以上的整数)、信号加法器电路126g和透镜阵列1264 hn与透镜26a、带通滤波器26c、PMT (光电倍增管)26屯 dn(n为I以上的整数)、增益调节器26ei en、开关电路26f\ fn、信号加法器电路26g和透镜阵列264 hn具有相同的构成和功能，因此省略该说明。光波导管126i按照比起透镜126a的成像位置更近于受光面侧的方式进行设置，荧光光束以漫射的状态通过带通滤波器126c后被入射到光波导管126i。光波导管126i形成多棱柱(例如为六棱柱)的筒状，且多棱柱的壁面形成完全反射面。通过透镜126a且透过成像位置的荧光，其使该光束按照发生漫射的同时在光波导管126i的壁面进行反射的方式到达透镜阵列264 hn，当上述光束到达透镜阵列261^ 1\时,突光形成朝向各方向前进的、具有均勻光强度分布的漫射光。将该具有均勻光强度分布的突光聚集于透镜阵列1261^ hn,进而被PMTI^Gd1 4所接收。作为光波导管126i,例如可举出由爱特蒙特光学(Edmund Optics)株式会社制造的TECSPEC(注册商标)光管。如上所述，受光部126与图3所示的受光部26—样包括透镜126a和光波导管126i，在受光部126中，其利用光波导管126i使通过透镜126a的荧光形成具有均匀光强度分布的光束，然后使该荧光光束通过PMT^ed1 dn被分割到多个区域，多个区域分别接收这些被分割的荧光。由此，使荧光作为具有均匀光强度分布的光而分散在多个受光面上并被该受光面所接收，因此可以改善PMT^ed1 dn的输出饱和。另外，最初，实施开启所有开关电路126f\ fn的操作的情况下，当由分析装置80所计算出的荧光强度超过阈值时，可以切换到关闭部分开关电路126f\ fn的操作。由此能够自由地控制信号处理部42和分析装置80内的信号水平，其结果与以往相比，可以得到更大的、能够在信号处理部42和分析装置80内进行处理的荧光强度的动态范围，且可以在较宽的动态范围中计算出荧光弛豫时间。其中，当分析装置80计算出荧光强度时，根据开关电路126f\ 4处于开启状态的数量信息来计算荧光强度。(实施方式的变形例2)图7表示作为图3所示的受光部26的另一变形例的受光部136的构成图。受光部136与受光部26 —样，被配置在通过测量位置并垂直于发射自激光光源部22的激光发射方向的平面与通过测量位置并垂直于管道30中的样品12的移动方向的平面相交的位置上，该受光部136包括用来接收样品12在测量位置所发出的荧光的光电倍增管。受光部136包括对来自样品12的荧光进行聚集的透镜136a、带通滤波器136c、 PMT (光电倍增管)136(^-4(η为I以上的整数)、增益调节器136θι en(n为I以上的整数)、开关电路136f\ fn(n为I以上的整数)、信号加法器电路136g和透镜阵列136匕 hn(n为I以上的整数)。透镜136a、带通滤波器136c、PMT(光电倍增管)136屯 dn(n为I以上的整数)、增益调节器136ei en、开关电路136f\ fn、信号加法器电路136g和透镜阵列136匕 hn与透镜26a、带通滤波器26c、PMT (光电倍增管(η为I以上的整数)、增益调节器26θ! en、开关电路26:1^ fn、信号加法器电路26g和透镜阵列261^ 1\具有相同的构成和功能，因此省略该说明。另外，透镜136a(透镜)的位置按照连接透镜136a的主点位置和样品12的测量位置的线段位于透镜136a的光轴上、且该线段的距离与透镜的焦点距离大致相一致的方式进行确定。由此，样品12所发出的荧光通过透镜136a后形成具有均匀光强度分布且大致呈平行的光束。具有该大致呈平行光束的荧光被分割到多个区域，并通过PMTlSed1Ndn被分割到多个区域，多个区域分别接收这些被分割的荧光。其中，在该变形例中，虽然荧光形成大致呈平行的光束，但并不限定于呈完全平行的光束。只要荧光的光束至少在PMTised1 dn的受光面大致均匀地展开即可。如上所述，受光部136与图3所示的受光部26 —样使通过透镜136a的荧光形成具有均匀光强度分布的大致呈平行的光束，然后使该荧光光束通过PMTised1 4被分割到多个区域，多个区域分别接收这些被分割的荧光。由此，使具有均匀光强度分布的荧光分散在多个受光面上并被该受光面所接收，因此可以改善各个PMTised1 dn的输出饱和。另外，最初，实施开启所有开关电路136f\ fn的操作的情况下，当由分析装置80所计算出的荧光强度超过阈值时，可以切换到关闭部分开关电路136f\ fn的操作。因此能够自由地控制信号处理部42和分析装置80内的信号水平。其结果与以往相比，可以得到更大的、能够在信号处理部42和分析装置80内进行处理的荧光强度的动态范围，且可以在较宽的动态范围中计算出荧光弛豫时间。其中，当分析装置80计算出荧光强度时，根据开关电路136f\ 4处于开启状态的数量信息来计算荧光强度。综上，对本发明的光检测装置和荧光检测方法进行了详细的说明，但本发明并不限定于上述实施方式，在不脱离本发明主题的范围内所进行的各种改良或改变均包括在本发明中。
权利要求
1.一种荧光检测装置，接收位于测量位置的测量对象物受到激光照射后所发出的荧光、且对获得自该荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括 激光光源部，发射用以照射测量对象物的激光； 受光部，输出测量对象物被激光照射后所发出的荧光的荧光信号； 光源控制部，生成具有规定频率的调制信号，以便对发射自所述激光光源部的激光强度进行时间调制； 处理部，根据通过将时间调制的激光照射到测量对象物而由所述受光部输出的荧光信号，利用所述调制信号计算出测量对象物所发出的荧光的荧光弛豫时间； 所述受光部包括使荧光在所述测量对象物的测量位置和荧光的受光面之间发生聚集的透镜，还包括使通过所述透镜的所述荧光形成具有均匀光强度分布的光束的装置、以及将通过该装置而形成的荧光的所述光束分割给多个区域而使多个区域分别接收这些被分割的光束的受光兀件。
2.如权利要求I所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部包括信号加法器，以便对分割到所述多个区域而得到的每个部分荧光信号进行加法处理后作为一个荧光信号来输出。
3.如权利要求2所述的荧光检测装置，其特征在于，在所述受光部，所述多个区域的每个区域均设置有实施将所述部分荧光信号是否提供给所述信号加法器的开关电路。
4.如权利要求3所述的荧光检测装置，其特征在于，所述处理部除了计算所述荧光弛豫时间以外，根据所述荧光信号计算荧光强度，当该荧光强度超过规定阈值时，通过所述开关电路限制供给到所述信号加法器的所述部分荧光信号的供给数量。
5.如权利要求3或4所述的荧光检测装置，其特征在于，在所述受光部设置有增益调节器，以便在所述部分荧光信号被供给到所述开关电路之前，对所述多个区域的每一个区域的所述部分荧光信号进行增益调节，以使所述部分荧光信号的增益达到一致。
6.如权利要求I 5中任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部包括位于所述透镜和所述受光面之间的漫射板，使得所述荧光通过所述透镜在所述漫射板上成像。
7.如权利要求I 5中任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部包括位于所述透镜和所述受光面之间、使入射的荧光在壁面上发生反射且平行于所述透镜的光轴而设置的筒状光波导管。
8.如权利要求I 5中任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部的所述透镜使聚集的荧光呈大致平行的光，由此形成具有均匀光强度分布的荧光。
9.一种荧光检测方法，接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光、且对获得自该荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括下述步骤 以具有规定频率的调制信号对用来照射测量对象物的激光强度进行时间调制后将其照射在测量对象物上的步骤； 将测量对象物受到激光照射后所发出的荧光形成为光强度呈均匀分布的光束，并将所述荧光的光束分割给多个区域而使多个区域接收这些被分割的光束，由此生成多个部分荧光信号的步骤； 至少对所述多个部分荧光信号中的一部分进行加法处理，以生成一个荧光信号的步骤；根据生成的所述荧光信号，利用所述调制信号计算出测量对象物所发出的荧光的荧光弛豫时间的步骤。
10.如权利要求9所述的荧光检测方法，其特征在于，当根据荧光信号所计算出的测量对象物所发出的荧光的荧光强度超过规定阈值时，限制所述部分荧光信号的加法计算数量。
全文摘要
本发明提供一种荧光检测装置和荧光检测方法，采用该荧光检测方法检测荧光时，以具有规定频率的调制信号对用来照射测量对象物的激光强度进行时间调制后将其照射在测量对象物。然后，使测量对象物受到激光照射后所发出的荧光形成光强度呈均匀分布的光束，并将所述荧光的光束分割给多个区域而使多个区域接收这些被分割的光束，由此生成多个部分荧光信号。其次，至少对所述多个部分荧光信号中的一部分进行加法处理，以生成一个荧光信号。根据生成的所述荧光信号，利用所述调制信号计算出测量对象物发出荧光的荧光弛豫时间。当根据荧光信号所计算出的、测量对象物所发出的荧光的荧光强度超过规定阈值时，限制进行加法处理的所述部分荧光信号数量。由此改善受光部的输出饱和。
文档编号G01N21/64GK102822665SQ20108002562
公开日2012年12月12日 申请日期2010年5月27日 优先权日2009年6月12日
发明者土井恭二, 林弘能, 星岛一辉, 浅野有美 申请人:三井造船株式会社