专利名称：一种测定促甲状腺激素的长光程酶联免疫分析法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外免疫分析技术领域，尤其是涉及一种测定促甲状腺激素 (ThyroidStimulating Hormone, TSH)的长光程酶联免疫分析法和试剂盒。
背景技术：
TSH是垂体前叶分泌的、促进甲状腺生长和机能的碱性糖蛋白激素。含211个氨基酸。糖类约占整个分子的15%，整个分子由两条肽链-α链和β链组成，分子量为25000 ^OOOD。TSH分子α亚基的氨基酸序列与其它的糖蛋白激素如促黄体素(LH)、促卵泡素 (FSH)和人绒毛膜促性腺素(HCG)的α亚基基本相同。β亚基为TSH所特有的，决定TSH 的特异性。血清中除有生物活性的整分子TSH外，还有无生物活性的α及β亚基。TSH全面促进甲状腺的机能，同时受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素(TRH)的促进性影响， Τ3、Τ4反馈性的抑制性影响，它们相互作用，组成下丘脑-垂体-甲状腺轴，血清中TSH的准确测定，是判断甲状腺和下丘脑-垂体-甲状腺轴的功能是否正常的首选指标之一，我国食品药品监督局已批准多种TSH检测药盒或试剂盒用于临床诊断。TSH检测的难度主要是临床诊断要求很高的灵敏度。人血清中TSH含量低，正常值约在0. 4 4. 0mIU/L(57 712ng/L)范围，甲亢患者一般低于正常范围，相当部分的患者TSH小于0. (MmIU/L，毒性弥漫性甲状腺肿甚至小于0. 01mIU/L。高灵敏的TSH检测方法能显著地扩大其在临床诊断中的作用(Carole A. S pencer，Michael Takeuchi,Margarita Kazarosyan Currentstatus and performance goals for serum thyrotropin (TSH) assays. Clinical chemistry 42:1(1996) 140—145)。临床诊断中检测TSH的方法主要是非竞争性的双位点夹心免疫分析法(IMA)，此方法测量信号的大小与待检物含量呈正比关系。根据标记物的不同，可分为免疫放射分析、 酶联免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和全自动化学发光免疫分析等。目前全自动化学发光分析法被认为具有灵敏度优势(0. 01 0. 02mIU/L)，成为市场中的主流，但其仪器和试剂价格昂贵。酶联免疫分析具有试剂盒制造技术较成熟、制造成本较低、无放射性污染等优点，但测量仪器酶标仪采用传统的分光光度法，测量灵敏度低，直接影响了 TSH测定的灵敏度。分光光度法测量吸光度遵从朗伯-比尔定律:Α = ε be (Α为吸光度，ε为摩尔消光系数，b为测量光程，c为检测物的浓度)。由上式可知，当检测物浓度一定时，吸光度与测量光程成正比，所以可以通过增大有效光程的途径提高测量灵敏度。近年出现了用石英材料制作的长光程流动样品池，长可达2米，被测液流过样品池，光信号通过光纤传导到光纤光谱仪测定。长光程技术应用于食品质量检测、化学浓度分析、水质检测等领域，灵敏度较常规方法提高了数十倍(马剑，张敏，袁东星.反液相流动注射-长光程多波长分光光度法测定饮水中超痕量亚硝酸盐.分析化学37 :2(2009年)p3i;3)。将长光程光纤光谱技术引入到酶联免疫分析中，作为测量信号的手段，能显著提高试剂盒的灵敏度。如采用1米的长光程样品池和吸收光程0. 01米的微孔板相比，根据朗伯-比尔定律测量灵敏度将提高100倍以上。长光程技术、酶联免疫分析技术相结合的测定TSH的长光程酶联免疫分析法和试剂盒，具有灵敏度高、测定范围适当、试剂盒制造成本低的优点。
发明内容
(一)要解决的技术问题为了克服现有酶联免疫分析法灵敏度不足的缺点，本发明提供一种长光程光纤光谱酶联免疫分析法，基于此方法提供一种测定TSH的长光程光纤光谱酶联免疫分析法，并提供一种实施上述方法的TSH长光程光纤光谱酶联免疫分析试剂盒，用于满足检测人血清样品的要求。( 二 )技术方案本发明为一种长光程光纤光谱酶联免疫分析法，是将现有的酶联免疫分析测量信号的方法一分光光度法改变成采用长光程流动样品池和光纤光谱仪测量的方法。所述长光程流动样品池为熔石英管，长度不小于0. 5米，通过SMA接头和传输光信号的光纤耦合； 光纤光谱仪光源为氘-卤灯或氘-卤钨灯或卤钨灯，测量波长范围是400 900nm。测量时，将反应终产物稀释液注入长光程样品池，入射光也通过光纤传导同时打入样品池，经过样品吸收后，信号光再通过光纤传导给光纤光谱仪，测量吸收光谱和吸光度。本发明将长光程技术、光纤光谱技术和酶免疫分析技术相结合，建立长光程光纤光谱酶联免疫分析法，提高免疫分析的灵敏度。本发明技术原理为根据朗伯-比尔定律:Α = ε be (Α为吸光度，ε为摩尔消光系数，b为测量光程， c为检测物的浓度)，当检测物浓度一定时，吸光度与测量光程成正比。现有的酶联免疫分析采用的微孔板，最大吸收光程不足0. 01米，改用长度0. 5米以上的长光程流动样品池，测量光程增加了 50倍以上，测量灵敏度将提高50倍以上。测量灵敏度提高将使免疫分析的灵敏度提高，特别是对于测量信号的大小与待检物含量呈正比关系的非竞争性免疫分析模式(皿)。本发明分析法包括以下步骤(1)样品和酶标记物及固相捕捉剂温育；(2)固液相分离使酶标记物结合部分和游离部分分离；(3)向酶标记物结合部分加入低本底底物液，发生酶催化显色反应；(4)把反应终产物稀释，并注入长光程流动样品池，用光纤光谱仪测量吸光度；(5)数据处理，根据测定的吸光度值检测待检物的浓度。基于上述方法本发明提供一种测定促甲状腺激素(TSH)的长光程光纤光谱酶联免疫分析法。采用长光程样品池提高灵敏度的同时也成倍数地放大了被测物的本底，为解决这一问题，本发明优选低本底底物液的组分、浓度配比和缓冲体系，获得了具有足够显色能力、吸收本底低、性能稳定的低本底底物液。采用终产物稀释后测量，也可降低本底，虽然稀释使灵敏度有所损失，但稀释倍数远小于测量光程增加倍数，因而仍然能提高灵敏度。本发明采用终产物稀释5 17倍后测量。本发明采用特制塑料试管制备抗体包被管，取代了酶免疫分析中常用的微孔板。 特制的试管增大了比表面积，可增加包被抗体量，进而提高免疫分析性能。并且试管可容纳反应物多，当样品中TSH含量较高，吸光度超出仪器测量范围时，可将剩余的反应终产物稀释，再进行测量，可扩大TSH测定范围。总之，将长光程技术、酶免疫分析技术和包被管技术相结合，建立测定促甲状腺激素(TSH)的长光程光纤光谱酶联免疫分析法，通过优选的低本底底物液、特制的包被管替代微孔板、测量前稀释以及分析条件的优化，最终使本发明较常规的酶免疫分析法灵敏度提高，且测定范围适当。测定原理为TSH抗体吸附在塑料试管内壁上成为抗体包被管，辣根过氧化物酶连接TSH单克隆抗体成为酶标记物，待测样品和酶标记抗体同时加入抗体包被管中温育，管内壁上的抗体和TSH及酶标记抗体反应结合，在管内壁上生成抗体-TSH-酶标记抗体复合物，弃去管中溶液并洗涤，使酶标记物结合部分和游离部分分离，管内壁上结合的酶与TSH量呈正比关系。加入底物，酶催化底物显色，将终产物稀释后注入长光程样品池，入射光也通过光纤传导同时打入样品池，经过样品吸收后，信号光再通过光纤传导给光纤光谱仪，测量450nm吸光度值。吸光度值与TSH含量呈正比关系。采用系列浓度的标准品可以获得标准曲线，从曲线上查得待测物的TSH浓度。测定包括以下步骤(1)将人血清样品或标准品和辣根过氧化物酶标记的TSH抗体加入TSH包被管中
温育；(2)洗涤抗体包被管；(3)加入低本底底物液温育；(4)加入终止液；(5)稀释反应终产物；(6)把反应终产物稀释液注入长光程流动样品池，用光纤光谱仪测量吸光度；(7)数据处理；优选地，其中TSH抗体包被管是识别TSH整分子的单克隆抗体或多克隆抗体包被在试管内壁上，辣根过氧化物酶标记的是识别TSHii亚基的单克隆抗体；或者抗体包被管上是识别TSHii亚基的单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的是识别TSH整分子的单克隆抗体或多克隆抗体。TSH单克隆抗体为鼠抗人TSH抗体，TSH多克隆抗体为以人源性TSH为免疫原对绵羊或兔进行免疫得到的。其中试管为聚苯乙烯或聚丙烯材料，特制为管内底部为凸起的六角星形。优选地，其中低本底底物液本底低，适合长光程流动样品池测定。低本底底物液由 A、B液组成；A液过氧化氢或过氧化脲的浓度是0. 015 0. 12g/L ；B液的四甲基联苯胺的浓度是0. 02 0. 2g/L、盐酸浓度为0. 和甲醇浓度为5%。优选地，其中终产物稀释液为0. 05 1. OM的硫酸溶液。其中所述长光程流动样品池为不小于0. 5米的熔石英管，通过SMA接头和传输光信号的光纤耦合；光纤光谱仪测量波长范围是400 900nm，光源为氘-卤灯或氘_卤钨灯或卤钨灯；数据经过软件处理后直接在计算机上显示出450nm时的吸光度。其中所述数据处理是用TSH浓度的对数值做横坐标，吸光度值的对数值为纵坐标，制作标准曲线，根据样品的吸光度值，从标准曲线上读出TSH含量。也可以用计算机专业软件完成数据处理。为方便起见，可以以试剂盒的形式提供本发明的测定方法，此类试剂盒是一种包装组合物，其包括的基本组分有(1)抗体包被管；(2)酶标记物；(3) TSH系列标准品；(4)浓缩洗涤液；(5)低本底底物液；(6)终止液；(7)终产物稀释液。其中所述抗体包被管是识别TSH整分子或β亚基的多克隆或单克隆抗体，包被在特制的六角星形的聚苯乙烯管内壁上，抗体包被浓度是02 2. Omg/L。其中所述酶标记物采用的是识别TSH的β亚基或整分子的单克隆抗体或多克隆抗体，使用的酶是辣根过氧化物酶，标记方法是过碘酸钠法。其中所述TSH系列标准品为小牛血清或含牛血清白蛋白缓冲液中加入TSH纯品及 0. 0. 3%的柳硫汞配而制成，浓度为0,0. 05,0. 3,4. O、10. O和20. OmIU/L。其中所述浓缩洗涤液为含有0. 3% 0. 8%Tween20和0. 0.3%柳硫汞的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。其中所述低本底底物液由A、B液组成，A液由0. 15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入过氧化氢或过氧化脲配制而成，B液由0. 15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入四甲基联苯胺及稳定剂配制而成。A液的过氧化物的浓度是0. 015 0. 12g/L ；B液的四甲基联苯胺浓度是 0. 02 0. 2g/L、盐酸的浓度是0. 1%、甲醇的浓度是5%。其中所述终止液和终产物稀释液为硫酸溶液，浓度分别为1 2M和0. 05 1. OM0其中所述试剂盒的制备方法为(1)抗体包被管的制备用0. 01 0. 05M, pH 7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液稀释TSH抗体至0. 2 ang/L， 以200μ L/管加入六角星形聚苯乙烯管中，4°C下过夜；弃去上清，用含 3%牛血清白蛋白的0. 01 0. 05M，pH 7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液37°C下封闭2小时，反应结束后弃去封闭液，冻干机干燥，4°C保存，以备使用；(2) TSH系列标准品的制备采用含有0. 0. 3%的柳硫汞，经56°C下灭活0. 5 2. O小时的小牛血清或含 5%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液将TSH纯品配制成浓度为O 20mIU/L的一系列标准品，分装，4°C或-20°C保存，以备使用；(3)酶标记物的制备将辣根过氧化物酶的羟基用过碘酸钠氧化为醛基，在碱性条件下与TSH抗体的氨基结合为酰胺化合物，透析后即得到TSH酶标抗体酶标记物，在标记好的溶液中，等体积加入丙三醇，-20°C保存，以备使用；(4)浓缩洗涤液的配制0. IM 0. 3M，pH7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液或iTris-HCl缓冲液加入0. 3% 0. 8% 的Tween20和0. 0. 3%柳硫汞的配制而成；(5)低本底底物液的配制低本底底物液由A液、B液组成，A液由0. 15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.015 0. 12g/L的过氧化氢或过氧化脲配制而成；B液由0. 15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0. 02 0.2g/L四甲基联苯胺、0.1%的盐酸、5%甲醇配制而成，使用时体积比1 1混合；(6)终止液的配制终止液由800ml蒸馏水加入50 IOOml 96% 98%的浓硫酸配制而成；(7)终产物稀释液的配制终产物稀释液由750ml蒸馏水加入19 750ml 2M硫酸配制而成；(8)将上述所制备的各组分组装成试剂盒。(三)有益效果本发明提供了一种测定促甲状腺激素(TSH)的长光程光纤光谱酶联免疫分析法， 并提供配套试剂盒，其中测量采用长光程流动样品池、匹配光纤光谱仪进行，通过加大测量光程并配合与其相适应的低本底底物液、采用特制的包被管以及方法学优化，使TSH检测的灵敏度达到最小检测限0. 015mIU/L，和使用同样抗体的、优化了的常规酶联免疫分析法比较灵敏度提高了 4倍(参见下表1)，TSH标准品的最低浓度为0. 05mIU/L。免疫反应在特制的抗体包被管中进行，包被管底部为凸起的六角星形，比表面积大，吸附抗体多，有利于免疫反应。同时反应体积灵活，配合适当的稀释步骤，使标准曲线线性范围达到0. 05 20mIU/L。本发明实现较高的分析灵敏度，较宽的标准曲线线性范围，使TSH检测性能有较大改善，明显优于常规的酶免疫分析，可以满足临床检测的需要。同时保持了低的制造成本，有利于普及应用。表1本发明与部分现有TSH酶联免疫分析(ELISA)灵敏度比较*
权利要求
1.一种测定促甲状腺激素(TSH)的长光程酶联免疫分析法，其特征在于，采用长光程流动样品池(LPC)和光纤光谱仪测量酶联免疫分析反应终产物的吸光度，它包括以下步骤(1)样品和酶标记物及固相捕捉剂温育；(2)固液相分离使酶标记物结合部分和游离部分分离；(3)向酶标记物结合部分加入低本底底物液，发生酶催化显色反应；(4)把反应终产物稀释，并注入长光程流动样品池，用光纤光谱仪测量吸光度；(5)数据处理，根据测定的吸光度值检测待检物的浓度。
2.根据权利要求1所述的免疫分析法，其特征在于，长光程流动样品池为熔石英管，长度不小于0. 5米，通过SMA接头和传输光信号的光纤耦合，用来检测低浓度样品的含量。
3.根据权利要求1或2所述的免疫分析法，其特征在于，光纤光谱仪的光源为氘-卤灯或氘-卤钨灯或卤钨灯，测量波长范围是400 900nm。
4.根据权利要求3所述的免疫分析法，其特征在于，固相捕捉剂为固定在试管内壁上的抗体，试管为聚苯乙烯或聚丙烯管，管内底部为凸起的六角星形；抗体为下列之一(1)酶标记的是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体，固相捕捉剂是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体；或(2)酶标记的是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体，固相捕捉剂是可与 TSH的β亚基结合的单克隆抗体；其中TSH单克隆抗体是小鼠单克隆抗体，多克隆抗体是以人TSH免疫绵羊或兔得到的。
5.根据权利要求4所述的免疫分析法，其特征在于，低本底底物液由含过氧化氢或过氧化脲的A液和含四甲基联苯胺、盐酸及甲醇的B液组成，其中过氧化氢或过氧化脲的浓度是0. 015 0. 12g/L，四甲基联苯胺的浓度是0. 02 0. 2g/L，盐酸浓度为0. 1 %，甲醇浓度为5%。
6.根据权利要求5所述免疫分析法，其特征在于，测量前反应终产物用0.05 1. OM 的硫酸溶液稀释5-17倍。
7.根据权利要求6所述免疫分析法，其特征在于，其中样品是人血清、血浆或全血；酶标记物为辣根过氧化物酶与抗体的化学连接物；数据处理是根据450nm的吸光度值用标准曲线定量样品中TSH浓度。
8.一种实施权利要求1 7所述免疫分析法之一的测定TSH的长光程光纤光谱酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，它包括以下基本组分(1)抗体包被管；(2)酶标记物；(3)TSH系列标准品；(4)浓缩洗涤液；(5)低本底底物液；(6)终止液；(7)终产物稀释液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，抗体包被管为内壁上吸附有TSH抗体的聚苯乙烯或聚丙烯试管，管内底部为凸起的六角星形；抗体为下列之一(1)酶标记的是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体，包被抗体是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体；或(2)酶标记的是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体，包被抗体是可与TSH 的β亚基结合的单克隆抗体；其中TSH单克隆抗体是小鼠单克隆抗体，多克隆抗体是以人TSH免疫绵羊或兔得到的。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，酶标记物为辣根过氧化物酶和TSH抗体的化学连接物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，低本底底物液由A、B液组成，A液由柠檬酸-磷酸盐缓冲液加过氧化氢或过氧化脲配制而成，过氧化物的浓度是0. 015 0. 12g/L;B液由柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入四甲基联苯胺、盐酸及甲醇配制而成，其中四甲基联苯胺的浓度是0. 02 0. 2g/L，盐酸的浓度是0. 1 %，甲醇的浓度是5%。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，终产物稀释液是0.05 1. OM的硫酸溶液。
13.一种适用权利要求8 12之一所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括下述步骤(1)包被管的制备用0. 01 0. 05M pH 7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液稀释TSH抗体至0. 2 lyg/mL，200 500 μ 1每管加至底部六角星形聚苯乙烯管，4°C温育过夜，洗涤包被管，用含0. 2% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，冻干机干燥，4°C贮存；O) TSH系列标准品的制备采用含有0. 1 % 0. 3 %柳硫汞的小牛血清或含有1 % 5 %牛血清白蛋白的磷酸缓冲液将促甲状腺激素纯品配制成系列浓度，分装，-20°C贮存；(3)酶标记物的制备将辣根过氧化物酶的羟基用过碘酸钠氧化为醛基，在碱性条件下与促甲状腺激素抗体的氨基结合为酰胺化合物，透析后即得到酶标记物，等体积加入丙三醇，-20°C保存；(4)浓缩洗涤液的制备浓缩洗涤液由0. 1 0. 3M pH7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液加入 Tween20及稳定剂配制而成；(5)低本底底物液的制备低本底底物液由A、B液组成，A液由0. 15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.015 0. 12g/ L过氧化氢或过氧化脲配制而成；B液由0. 15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0. 02 0. 2g/L 四甲基联苯胺、盐酸及醇类配制而成；(6)终止液的制备终止液由800ml蒸馏水加入50 IOOml 96 98%的浓硫酸配制而成；(7)终产物稀释液的制备终产物稀释液由750ml蒸馏水加入19 750ml 2M硫酸配制而成；(8)将各组分组装成试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种测定促甲状腺激素的长光程酶联免疫分析法，还提供了该方法的试剂盒。测定步骤包括免疫反应、分离、显色、测量和数据处理。采用长光程流动样品池和光纤光谱仪进行测量，通过增加测量光程、采用低本底底物液、以及各组分制备和方法学优化使检测灵敏度达到0.015mIU/L，和使用同样抗体的、优化的常规酶联免疫分析法比较，灵敏度提高了4倍。测定线性范围为0.05～20mIU/L。免疫反应在包被管中进行，反应模式为双抗体夹心一步法。试剂盒包括抗体包被管、系列校准品、酶标记物、浓缩洗涤液、低本底底物液、终止液及终产物稀释液。本方法灵敏度高，测定范围适当，可以满足临床检测的需要。同时试剂盒制造成本低，有利于普及应用。
文档编号G01N21/31GK102192888SQ201110106810
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者官国英, 潘玉婷, 燕强奋 申请人:原子高科股份有限公司