专利名称：硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物学免疫方法的测定技术领域，特别是涉及一种利用胶体金免疫层技术制作的一种硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
硝基呋喃类药物为一种光谱抗生素，主要是指呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林，具有很好的抗菌作用，被广泛应用于饲料添加剂和治疗药物，用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏杆菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。他们对人类健康有恶性影响，有致癌性。欧盟出于食品安全的考虑，在96/23/EC法规中将硝基呋喃类抗生素列为A类禁用药，决定从1997年I月I日起，禁止在动物饲料中添加任何硝基呋喃类抗生素。我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。欧盟委员会于2003年通过了 2003/181/EC委员会决议，建立了用于检测禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物的代谢物的各种方法的最小要求性能限值为Iu g/kg。目前，欧盟、美国及其他国家都对进口动物性食品中硝基呋喃类抗生素残留做了非常严格的限制，要求4种硝基呋喃代谢物残留不得超过 I ii g/kg。为了人和动物的安全很有必要对水源和食品(如肉)进行抗生素残留检测。硝基呋喃类药物本身的检测很难，因为在食入这些药物后会很快地发生代谢。这些代谢产物会在组织中存在很长时间。AOZ是呋喃唑酮代谢物、AMOZ是呋喃它酮的代谢物、SEM是呋喃西林代谢物、AHD是呋喃妥因代谢物。因此，可以通过检测食品中是否含有硝基呋喃类药物代谢物以判定食品对人体的安全性。目前，检测硝基呋喃类药物代谢物的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫分析法(ELISA)。这些方法灵敏度高，结果准确，但是具有需要昂贵的仪器，检测繁琐、费时，检测人员需要一定的专业培训等缺点。本发明采用胶体金免疫层析技术制备了一种硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒。本发明具有操作简单、检测快速、灵敏度高、无需复杂仪器等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快捷、灵敏度高、成本低的硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法。硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒由呋喃唑酮代谢物检测试纸条、呋喃它酮的代谢物检测试纸条、呋喃西林代谢物检测试纸条、呋喃妥因代谢物检测试纸条组装而成，每种试剂条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板组成，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述样品垫为玻璃纤维；所述胶体金垫为胶体金标记的硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测线(T线)和质控线(C线)，其中检测线(T线)上包被了硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白，质控线(c线)上包被了羊抗鼠IgG抗体；所述吸样垫为吸水纸。偶联硝基呋喃类药物代谢物的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)o本发明采用纳米胶体金技术及抗原抗体特异性反应，应用免疫竞争抑制反应的原理制备而成，通过待检样本中可能含有的硝基呋喃类药物代谢物与硝酸纤维素膜上检测线(T线)包被的硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白竞争结合胶体金标记的硝基呋喃类药物代谢物抗体的反应，使T线显现肉眼可见红色条带用于判定待检样本中是否含有硝基呋喃类药物代谢物。本发明提供了一种硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤(I)制备硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白
硝基呋喃类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才能具有免疫原性。因此采用活性酯法将硝基呋喃类药物代谢物半抗原与载体蛋白偶联得到硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白作为免疫原和包被原。其中载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(0VA)。(2)制备硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体采用硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白作为免疫原免疫BALB/C小鼠，制备硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体。(3)制备胶体金取0. 01%的氯金酸水溶液，加热煮沸。根据需要迅速加入I %枸橼酸三钠水溶液，继续煮沸约5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20_40nm。(4)制备胶体金垫取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0. 2mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8. 0-9. 0，室温放置30分钟；在上述溶液中加入硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体，使硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体的浓度为10-40 ii g/ml胶体金，混合均匀后，室温放置30分钟；然后加入10% BSA溶液，使BSA溶液的浓度为10-30 u I/ml胶体金，混合均匀，室温放置10分钟；上述溶液于12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用3070%初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解，得到硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体胶体金标记物；将硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体-胶体金标记物按15-30 iil/cm2的比例均匀的铺在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥2. 5-3小时，制成胶体金垫。上述胶体金复溶液为含0. 30% 1^8，5%蔗糖，0. 50% PVP,0. 30% Casein-Na, pH值8. 0-9.0的溶液。(5)包被硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白、羊抗鼠IgG抗体 将NC膜粘贴在PVC板上，吸水纸贴到PVC板上压住膜1-1. 5mm。打开划膜仪，按清洗键清洗划膜仪，设置划膜仪参数为C线I. 0 i! 1/cm, T线I. 0 i! 1/cm ；将贴好的PVC板放在划膜仪上，用C、T线包被液在NC膜上分别划C、T线。划膜不合格的用红记号笔标出，将包被板置干燥箱设置451，干燥1-1.5小时。其中，T线包被液为0. 8-4. Omg/ml的硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白；C线包被液为0. 6-2. Omg/ml的羊抗鼠IgG抗体。
(6)样品垫的处理将玻璃纤维浸泡于0. OlM pH 7. 0-8. 0的磷酸盐缓冲溶液中20_40min，其中磷酸盐缓冲溶液中含0. 5-1. 5% BSA, 0. 5-1.0% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，备用(7)组装试剂盒取上述制备好的胶体金垫、PVC板及样品垫，将胶体金垫切成宽度为IOmm的条型，然后胶体金垫贴于PVC板上NC膜的靠近T线端，压NC膜1-1. 5_，样品垫贴于胶体金垫的上方，露出金垫2-3mm(如图I所示)。打开切条机，按产品要求设置裁切宽度，将上述组装好的PVC板放于切条机上，按设置宽度进行切条，得到所述用于检测硝基呋喃类药物代谢物的试纸条；试纸条装入塑料卡内，组装成试剂盒。本发明所述试剂盒的检测方法为将被检样品平衡至室温；取出硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，5-10分钟时观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果；或将硝基呋喃类药物代谢物检测试纸条样品垫末端浸入被测样品溶液中约10秒钟后，水平放置；5-10分钟时观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。本发明所述的试剂盒采用胶体金免疫层析技术测定硝基呋喃类药物代谢物，检测样品时，因毛细作用样品溶液的沿试纸条向吸样垫一端层析，若被测样品中含有硝基呋喃类药物代谢物，它们将和检测线(T线)上包被的硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白竞争结合胶体金标记的硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体上有限的抗体结合位点，当样品中的硝基呋喃类药物代谢物达到一定浓度时，与胶体金标记的硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体发生免疫反应并完全饱和，此时胶体金复合物已无空余的位点和检测线上包被的硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白结合，此时T线不显色，此为阳性结果；若被测样品中不含硝基呋喃类药物代谢物，标记了硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体的胶体金颗粒将随同样品层析至T线位置后，与T线上包被的硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线位置堆积使得T线呈现出一条肉眼可见的红色条带，此为阴性结果。无论被测样品中是否含有硝基呋喃类药物代谢物，胶体金标记物均会与C线包被的羊抗鼠IgG反应形成一条肉眼可见的红色条带，C线显色与否，是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
图I硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒示意图；图2硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒内试纸条的结构示意图；附图符号说明I :样品垫；2 :胶体金垫(胶体金标记硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体的聚酯膜)3 :硝酸纤维素膜(T :包被了硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白的检测线；C :包被了羊抗鼠IgG抗体的质控线);4 :吸样垫；5 =PVC 支撑板；图3本发明试剂盒的检测结果示意图。、
自左至右依次为C线一条线阳性检测结果；T、C两条线阴性检测结果；无效。实施例I :硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒的制备I.制备硝基呋喃类药物代谢物偶联BSA采用活性酯法分别将AOZ、AMOZ, SEM及AHD半抗原与牛血清白蛋白偶联得到AOZ-BSA偶联物、AMOZ-BSA偶联物、SEM-BSA偶联物及AHD-BSA偶联物作为免疫原和包被原。2.制备硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体AOZ-BSA偶联物作为免疫原免疫BALB/C小鼠，制备AOZ单克隆抗体；AM0Z_BSA偶联物作为免疫原免疫BALB/C小鼠，制备AMOZ单克隆抗体；SEM_BSA偶联物作为免疫原免疫BALB/C小鼠，制备SEM单克隆抗体;AHD_BSA偶联物作为免疫原免疫BALB/C小鼠，制备AHD-单克隆抗体。。3.制备胶体金取0. 01 %的氯金酸水溶液IOOmL,加热煮沸。根据需要迅速加入I %枸橼酸三钠水溶液0. 75mL,继续煮沸约5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20_40nm。4.制备胶体金垫取4个IOml的离心管，分别编号1、2、3、4，于4个离心管中分别加入5ml颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0. 2mol/L K2C03将胶体金溶液的pH值调至9. 0，室温放置30分钟；于I号离心管中加入浓度为3. 8mg/ml的AOZ单克隆抗体39. 5iil ;于2号离心管中加入浓度为3. 5mg/ml的AMOZ单克隆抗体40 yl ;于3号离心管中加入浓度为4. Omg/ml的SEM单克隆抗体37. 5 yl，于4号离心管中加入浓度为3. 8mg/ml的AHD单克隆抗体39. 5 yl ;分别混合均匀后，室温放置30分钟；然后于1-4号离心管中均加入100 ill的10% BSA溶液，混合均匀，室温放置10分钟；上述溶液于12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀均用2. 5ml的胶体金复溶液溶解，得到AOZ单克隆抗体-胶体金标记物、AMOZ单克隆抗体-胶体金标记物、SEM单克隆抗体-胶体金标记物及AHD单克隆抗体-胶体金标记物。将上述四种胶体金标记物分别按20 yl/cm2的比例均匀的铺在4个聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥3小时，制成胶体金垫。
上述胶体金复溶液为含0. 30% 1'1^8，5%蔗糖，0. 50% PVP,0. 30% Casein-Na, pH值9.0的溶液。5.包被硝基呋喃类药物代谢物偶联BSA、羊抗鼠IgG抗体 将NC膜粘贴在PVC板上，吸水纸贴到PVC板上压住膜1-1. 5mm。打开划膜仪，按清洗键清洗划膜仪，设置划膜仪参数为C线I. 0 i! 1/cm, T线I. 0 i! 1/cm ；将贴好的PVC板放在划膜仪上，分别以T线包被液为AOZ-BSA偶联物、AMOZ-BSA偶联物、SEM-BSA偶联物及AHD-BSA偶联物，C线包被液为羊抗鼠IgG抗体在NC膜上分别划C、T线。划膜不合格的用红记号笔标出，将包被板置干燥箱设置45°C，干燥I. 5小时。其中，T线包被液AOZ-BSA偶联物浓度为2. Omg/ml、AMOZ-BSA偶联物浓度为
I.Omg/ml、SEM-BSA偶联物浓度为I. 6mg/ml、AHD-BSA偶联物浓度为2. 5mg/ml ；C线包被液羊抗鼠IgG抗体浓度为I. Omg/ml o6.样品垫的处理将玻璃纤维浸泡于0. OlM pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中20_40min，其中磷酸盐缓冲溶液中含I. 0% BSA, 0. 5% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，备用
7.组装试剂盒取上述制备好的胶体金垫、PVC板及样品垫，将胶体金垫切成宽度为IOmm的条型，然后将AOZ单克隆抗体-胶体金标记物制备的胶体金垫贴于T线包被液为AOZ-BSA偶联物的PVC板上NC膜的靠近T线端，压NC膜1-1. 5mm，样品垫贴于胶体金垫的上方，露出金垫2-3mm ;打开切条机，设置裁切宽度为3. 8mm，将上述组装好的PVC板放于切条机上，按设置宽度进行切条，得到呋喃唑酮代谢物检测试纸条。将AMOZ单克隆抗体-胶体金标记物制备的胶体金垫贴于T线包被液为AMOZ-BSA偶联物的PVC板上NC膜的靠近T线端压NC膜1-1. 5mm，样品垫贴于胶体金垫的上方，露出金垫2-3mm ;打开切条机，设置裁切宽度为3. 8mm，将上述组装好的PVC板放于切条机上，按设置宽度进行切条，得到呋喃它酮的代谢物检测试纸条。将SEM单克隆抗体-胶体金标记物制备的胶体金垫贴于T线包被液为SEM-BSA偶 联物的PVC板上NC膜的靠近T线端，压NC膜1-1. 5mm，样品垫贴于胶体金垫的上方，露出金垫2-3mm ;打开切条机，设置裁切宽度为3. 8mm，将上述组装好的PVC板放于切条机上，按设置宽度进行切条，得到呋喃西林代谢物检测试纸条。将AHD单克隆抗体-胶体金标记物制备的胶体金垫贴于T线包被液为AHD-BSA偶联物的PVC板上NC膜的靠近T线端，压NC膜1-1. 5mm，样品垫贴于胶体金垫的上方，露出金垫2-3mm ;打开切条机，设置裁切宽度为3. 8mm，将上述组装好的PVC板放于切条机上，按设置宽度进行切条，得到呋喃妥因代谢物检测试纸条。将上述制备好的4种试纸条按顺序组装到塑料卡中，制备成硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒。实施例2 :硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒的检测I.样品的处理取Ig组织样品组织样品捣碎后，加入5ml蒸馏水，IM的HCl 0. 5ml和0. OlM的苯甲醛(乙醇溶液)100 ill，充分振荡，置于38°C过夜。然后加入0. IM的K2HPO4 5ml，IM的NaOH 0. 4ml以及5ml的乙酸乙酯，剧烈振荡30秒。室温下4000rpm离心10分钟，然后取2.5ml乙酸乙酯上清液转移到新容器中。在45°C下用氮气将其吹干，然后用正己烷重新溶解后与 Iml 的 0. OlM PBST (pH 7. 4,0. 05% Tween-20)混匀。室温下 4000rpm 离心 10 分钟，最后取底部水相测定。2.检测方法取出硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒，水平放置；在样品垫上滴入3滴样品，10分钟后观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。3.结果判定阳性T线不显色，仅C线显色，判定为阳性结果；阴性T线、C线均显色，判定为阴性结果；无效C线不显色，说明不正确操作或试剂盒已经变质损坏。
权利要求
1.一种硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于由呋喃唑酮代谢物检测试纸条、呋喃它酮的代谢物检测试纸条、呋喃西林代谢物检测试纸条、呋喃妥因代谢物检测试纸条组装而成。
2.—种权利要求I所述的硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所包含的试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板组成，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述样品垫为玻璃纤维；所述胶体金垫为胶体金标记的硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测线(T线)和质控线(C线)，其中检测线(T线)上包被了硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白，质控线(C线)上包被了羊抗鼠IgG抗体；所述吸样垫为吸水纸。
3.—种权利要求I所述的硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白为硝基呋喃类药物代谢物偶联牛血清白蛋白或卵清白蛋白；所述的硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体由硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白作为免疫原免疫BALB/C小鼠获得。
4.一种权利要求I所述的硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下制成大小为20-40nm的胶体金颗粒。
5.一种权利要求I所述的硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金垫的制备方法为取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0. 2mol/L K2CO3将胶体金溶液的PH值调至8. 0-9. 0，室温放置30分钟；在上述溶液中加入硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体，使硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体的浓度为10-40 ii g/ml胶体金，混合均匀后，室温放置30分钟；然后加入10% BSA溶液，使BSA溶液的浓度为10-30 u I/ml胶体金，混合均匀，室温放置10分钟；上述溶液于12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用30-70%初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解，得到硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体-胶体金标记物；将硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体-胶体金标记物按15-30 u 1/cm2的比例均匀的铺在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥2. 5-3小时，制成胶体金垫。
6.一种权利要求I所述的硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金复溶液为含0. 30% Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP, 0. 30% Casein-Na, pH值8. 0-9. 0的溶液。
7.—种权利要求I所述的硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上T、C线的包被方法为将NC膜粘贴在PVC板上，吸水纸贴到PVC板上压住膜1-1. 5mm。打开划膜仪，按清洗键清洗划膜仪，设置划膜仪参数为C线I. 0 y 1/cm,T线I. 0 ii 1/cm ;将贴好的PVC板放在划膜仪上，用C、T线包被液在NC膜上分别划C、T线。划膜不合格的用红记号笔标出，将包被板置干燥箱设置45°C，干燥1-1. 5小时。其中，T线包被液为0. 8-4. Omg/ml的硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白；C线包被液为0. 6-2. Omg/ml的羊抗鼠IgG抗体。
全文摘要
本发明提供了一种硝基呋喃类药物代谢物检测试剂盒，试剂盒由呋喃唑酮代谢物检测试纸条、呋喃它酮的代谢物检测试纸条、呋喃西林代谢物检测试纸条、呋喃妥因代谢物检测试纸条组装而成，试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板组成，其中胶体金垫为胶体金标记的硝基呋喃类药物代谢物单克隆抗体聚酯膜，硝酸纤维素膜上依次包被了硝基呋喃类药物代谢物偶联载体蛋白作为检测线(T线)，羊抗鼠IgG抗体作为质控线(C线)。本发明采用纳米胶体金技术及抗原抗体特异性反应，应用免疫竞争抑制反应的原理制备而成，用于检测样品中是否含有硝基呋喃类药物代谢物。
文档编号G01N33/577GK102759622SQ20111010847
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者李峰, 杨利, 陈立柱 申请人:宝瑞源生物技术(北京)有限公司