专利名称：一种肠道病毒71型(EV71)IgM抗体检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种肠道病毒71型(EV71) IgM抗体检测试纸条及其应用。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)属于肠病毒属A型，是克萨奇病毒A16 (CA16)的近亲，EV71 W^^nTl^-^iji^A^n^l (hand, foot and mouth disease, HFMD) (encephalitis) 菌性脑膜炎(as印icmeningitis)和脊髓灰质炎样麻痹(poliomyelitis-like paralysis) 等多种与神经系统相关的疾病。目前，人类是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通过人群间的密切接触传播。根据核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等3个基因型， B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及Cl和C2亚型。中国大陆已发现的7株EV71 病毒(SHZH03、SHZH98、SH2F1、SH2F2、SH2H25、SH2H26 和 CHN287)与 EV71 病毒 C 基因型代表株比较，同源性在89. 3% 94. 6%之间，较为接近，而与A、B基因型代表株比较，则同源性在81. 3% 84. 0%之间。说明中国大陆的10株EV71病毒皆属于EV71病毒C基因型。EV71的病毒颗粒为球形结构，无包膜和突起，病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由EV71病毒基因组编码4个外壳蛋白，VP1、VP2、VP3暴露在病毒的表面，通过拼装成原聚体和亚单位，最终形成病毒外壳。蛋白VP4则包埋在病毒外壳内侧起连接作用。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，其抗原表位主要集中于VP1、VP2 和VP3上。VPl不但具有显著的基因多态性，而且集中了中和抗原决定簇，直接影响病毒的抗原性。VPl基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VPl基因是EV71分子流行病学主要的研究内容。外壳蛋白VPl由891个核苷酸组成，存在着EV71主要中和抗原表位。因此通过基因工程获得该抗原的表达蛋白，并用其作为抗原检测EV71的特异性IgM抗体。目前，手足口病的诊断，除了依据临床症状外，实验室诊断是不可缺如的环节。实验室的诊断标准如下1)血液检查的细胞总数一般正常或偏高，分类时淋巴细胞较高，中性粒细胞较低。 2)有中枢神经系统并发症时，脑脊液细胞数可增多，蛋白升高。幻发病后从粪便、咽喉漱口液分离或检测到相关病毒。4)从脑脊液或疱疹液分离或检测到相关病毒。幻从早期血清中检测出相关病毒IgM抗体。6)恢复期血清中和抗体比急性期有>4倍的增长。然而到目前为止，还没有一种能够方便、快捷检测EV71特异性IgM抗体的试纸条的报道。
发明内容
(一 )、要解决的技术问题发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测EV71特异性IgM抗体的试纸条， 检测感染患者标本中EV71特异性IgM抗体，用于人EV71感染的辅助诊断。
(二)、技术方案本发明提供了一种检测试纸条，它包含以下成分(1)包被EV71病毒抗原VPl和二抗IgG两个条带的反应膜；(2)含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的结合物释放垫。上述二抗可以是抗鼠IgG 二抗，所述反应膜可以是硝酸纤维素膜，所述结合物释放垫可以是玻璃纤维膜。本发明还提供制备上述试纸条的方法，其包括如下步骤1)将EV71病毒抗原VPl以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；2)用胶体金标记抗人IgM单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；3)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。本发明还公开了所述试纸条在检测EV71特异性IgM抗体的应用。本发明方案是采用高纯度的纯化的EV71基因工程抗原VPl和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体，应用膜层析捕获法的原理检测人标本中的EV71特异性IgM抗体。(三)、有益效果本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性检测样本中可能存在的EV71特异性IgM抗体，达到快速筛检病人，及时诊断治疗的目的。可节省大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和早期诊断，对EV71的感染诊断起到辅助作用。
图1 :A本发明试纸条的正面示意图；B本发明试纸条的侧面示意图。其中，1 吸水垫；2 硝酸纤维膜(T :EV71基因工程抗原VPl ；C 包被抗鼠IgG的质控条带)；3 含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的玻璃纤维膜；4 金标抗体保护膜；5 反应支持物。图2 检测结果示意图。其中，从左至右依次为T、C两条线阳性；C 一条线阴性； Τ、C两条线阴性或仅有T线阳性，无效。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 :EV71特异性IgM抗体检测试纸条(胶体金法)(参见图1)EV71基因工程抗原VPl购于北京安波特基因技术有限公司。反应支持物为6. 5cmX0. 4cm PCV板；吸水垫为2cmX0. 4cm的滤油纸； 2. OcmXO. 4cm的硝酸纤维膜依次包被抗鼠IgG(2mg/ml)，EV71抗原VPl (1. 5mg/ml)，含有 0. 4cmX0. 4cm胶体金标记的抗人IgM(标记量25 μ g/ml)的单克隆抗体聚酯膜；样品垫2. 7cmX0. km的玻璃纤维；即组成了肠道病毒71型(EV71) IgM抗体检测试纸条(胶体金法)。实施例2检测方法(参见图2)将患者全血、血浆或血清标本100-150 μ 1直接滴加入实施例1试纸条“4”处，样品液沿膜上行，10-15分钟判读结果。结果如检测样本中含有EV71的IgM抗体，则与试纸条上胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的EV71特异性抗原VPl结合，形成红色线条，即在T处形成红色条带。无论标本中是否含有相应的抗体，胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。
权利要求
1.一种检测试纸条，其特征在于，它包含(1)包被EV71病毒抗原VPl和抗鼠IgG两个条带的反应膜；(2)含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的结合物释放垫。
2.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
3.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫为玻璃纤维膜。
4.如权利要求1或2任一项所述试纸条，其特征在于，所述的二抗IgG为抗鼠IgG。
5.一种制备权利要求1 4任一项所述试纸条的方法，其包括如下步骤1)将EV71病毒抗原VPl以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；2)用胶体金标记抗人IgM单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；3)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸
6.EV71病毒抗原VPl在胶体金检测试剂中的应用。
7.权利要求1-4之任一所述试纸条在检测EV71特异性IgM抗体中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测肠道病毒71型(EV71)IgM抗体的快速检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被EV71基因抗原(VAP1)和抗鼠IgG，结合胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体，应用膜层析捕获法，检测感染人标本中EV71特异性IgM抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和早期诊断，对EV71感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/531GK102253210SQ201110151009
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月7日 优先权日2010年6月4日
发明者刘明 申请人:北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司