专利名称：观察厚组织三维结构的方法
技术领域：
本发明提供一种用于观察厚组织三维结构的方法，特别是有关利用可增加组织透视程度的技术搭配显微镜影像撷取与组织移除技术，以观察厚组织的三维结构。
背景技术：
生物组织的三维结构观察对各种生物的研究有重大义意；在传统技术上观察厚组织三维结构的方法是使用组织切片技术，之后进行染色与影像撷取。通过由浅到深的一系列切片、分别染色与影像撷取后可由影像堆栈方式得到组织的三维影像。然而在任两切片间的机械切除面会产生严重变形与破坏，无法经由堆栈而得到完整且正确的厚组织三维影像。目前已知较进步的方法是利用光学澄清技术使组织透明化，如使用已揭露的 FocusClear技术(参考美国第6472216B1号专利与中国台湾第206390号专利)，可将观察清楚的深度推进到200至300微米(μπι)。所谓光学澄清技术是将本来不透明的组织浸泡在可减少光散射的溶液中，因为此类溶液会置换组织中的水份，而且溶液的折射率比水份更接近组织的折射率，因此可减少光的散射，搭配使用共轭焦激光显微镜已可将观察清楚的深度推进到200至300微米(μ m)。但是大部分的动物组织与植物组织的厚度却仍远超过此值；举例来说，若脑神经的研究要从果蝇推展到小鼠甚至人体，它的厚度就已超过目前所能清楚观察的范围。如何能找到方法观察厚组织的三维结构便成了急需克服的问题。
发明内容
本发明提出一个方法来克服观察的深度限制利用可增加组织透视程度的技术， 搭配先扫描后移除且移除平面深度小于该阶段最后扫描平面深度的概念，可在扫描过程中使用移除工具移除扫描过的组织，同时也可保留待扫描组织的完整性，如此重复进行扫描与移除的动作可将清楚观察的组织厚度大幅推进，突破显微观察只能限于样品表层薄片的限制。故对于生物科技的发展将带来非常大的帮助。本发明提供一种观察厚组织三维结构的方法，包括提供一厚组织，该厚组织经过光学澄清技术处理，如使用R)cusClear (参考美国第6472216B1号专利与中国台湾第 206390号专利)技术处理或选用适当波长的光线以穿透该组织，以容许反映其结构的光信号穿透该厚组织而可被显微镜撷取；一光学扫描显微镜与一组织移除装置。该厚组织包含动物组织、植物组织、人造组织或生物材料，该组织经包埋固定后，置于一基座之上。所使用的光学扫描显微镜包含共轭焦激光显微镜、多光子激光扫描显微镜等可撷取特定光学切片的光学显微镜。所使用移除装置的移除方法包含机械式切除、激光切除或化学腐蚀、烧灼等方法。以该光学扫描显微镜自该厚组织表面开始撷取组织的影像，之后渐次增加该影像撷取装置的影像撷取深度，以撷取组织表面以下各深度平面的影像。此处的撷取深度乃相对于光学扫描显微镜的物镜而言，愈远离物镜处为深度愈深。由于形成组织深层影像的光信号受到其上层组织散射的影响，组织渐深处影像分辨率渐差。当扫描至影像清楚的极限时，将移除平面定于其扫描平面上方某特定距离，然后去除移除平面以上的组织。此处影像清楚的极限乃根据使用者需求的影像分辨率而定，扫描平面上方的特定距离亦根据使用者需求作调整，唯组织去除深度必须小于组织已扫描深度，使去除面产生的变形及破坏不影响待扫描组织的完整性，可维持后续扫描所撷取的组织影像与已扫描组织影像的连续性。 若重复扫描移除平面与已扫描平面间的区域，可作为后续影像重组的对齐依据。执行多次上述扫描、撷取影像与使用该移除装置移除厚组织移除平面上方组织的动作，即可撷取该厚组织全部深度的三维结构影像，以供后续重组该各层影像以建构成该厚组织的三维结构影像。本发明还提供一种观察厚组织三维结构的方法，包括；提供一待扫描的厚组织，其中该厚组织容许反映其结构的信号穿透；提供一光学扫描显微镜，用以撷取该厚组织的影像；提供一移除装置，用以移除部分该厚组织；执行以下步骤多次，以撷取完整的该厚组织的三维影像以该光学扫描显微镜自该厚组织的表面撷取该厚组织的影像，之后渐次增加该光学扫描显微镜的取像深度，以撷取该厚组织表面以下各深度平面的影像；以该光学扫描显微镜所撷取的各深度平面的影像清晰度决定出距离该厚组织表面的一扫描深度；在该扫描深度上方的一特定距离决定出一移除平面；以该移除装置移除该移除平面以上的该厚组织后，继续撷取该厚组织更深层的影像。上述观察厚组织三维结构的方法，先执行撷取影像后再移除该厚组织，且该移除平面的深度小于该扫描深度。本发明还提供一种观察厚组织三维结构的方法，包括提供一待扫描的厚组织，其中该厚组织容许反映其结构的信号穿透；提供一影像撷取装置，用以撷取该厚组织的影像；提供一移除装置，用以移除部分该厚组织；
以该影像撷取装置自该厚组织的表面撷取该厚组织的影像，之后渐次增加该影像撷取装置的取像深度，以撷取该厚组织表面以下各深度平面的影像；以该影像撷取装置所撷取的各深度平面的影像清晰度决定出距离该厚组织表面的一扫描深度；在该扫描深度上方的一特定距离决定出一移除平面；以该移除装置移除该移除平面以上的该厚组织后，继续撷取该厚组织更深层的影像。本发明的方法保留了待扫描组织的完整性并克服了厚组织深层影像分辨率不佳的限制，而可以得到完整厚组织的三维影像。
图1说明一厚组织置于基座之上，厚组织分为浅层与深层部分。
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图2A说明浅层被激光扫描，撷取影像，并定义出切割面，准备去除移除平面上方的组织。图2B说明厚组织已执行第一次移除动作，激光扫描更往下定义出新的浅层。图3说明准备一新的厚组织置于基座上，并以激光扫描最浅层的组织。图4说明焦点平面已调到可清晰撷取影像的极限，以定义出厚组织的浅层部分、 深层部分、移除平面。附图标记说明；10厚组织100厚组织的浅层101厚组织的深层1001厚组织的表面1001’三维光学扫描显微镜的焦点平面1002厚组织浅层与深层的界面1003厚组织的移除平面20 基座30三维光学扫描显微镜的激光扫描D厚组织的厚度d焦点平面调整的间距d’移除平面与深浅层界面的距离T厚组织的浅层深度T’厚组织移除平面的深度
具体实施例方式本发明将以较佳实施例及观点加以叙述，此类叙述解释本发明的结构及程序，仅用以说明而非用以限制本发明的保护范围。因此，除说明书中的较佳实施例以外，本发明亦可广泛实行于其它实施例中。本发明揭露一种观察厚组织三维结构的方法；其实施方式如图1所示，先准备一厚组织10经过荧光染色后，将其用凝胶包埋固定(未绘示于图上)，利用一种光学澄清溶液(如上述R)CuSClear技术)透明化该包埋后的厚组织后，置于基座20之上。上述 R)CUSClear光学澄清技术为已知技术，为避免模糊焦点，在此不加以赘述。使用光学扫描显微镜，例如共轭焦激光显微镜(未绘示于图上)扫描该厚组织10以撷取组织影像，上述共轭焦激光显微技术亦为已知技术，在此不加以赘述。共轭焦激光显微镜的激光30先扫描厚组织10的表面1001后，逐步往厚组织10的深层扫描，深层为距离该显微镜物镜较远处，以撷取不同深度平面的组织影像，以供后续建构为三维影像之用。当激光30扫描深度逐渐增加，所撷取的影像分辨率愈差，其原因主要是激发光被上层组织散射所致。当激光30扫描至厚组织10表面1001的下方深度T (举例为200 μ m)时，为可清楚解析影像的极限，在此定义此极限地方为界面1002。此时厚组织10的浅层部分100，范围为自表面1001到界面1002的地方，为可撷取清楚影像的部分；而厚组织10的深层部分 101，范围为自界面1002以下至基座20以上，为无法撷取清楚影像的部份。
使用一移除装置，如机械式切片机、激光切除或化学腐蚀、烧灼等方法，自距离厚组织10表面1001下方深度T，(举例为150 μ m)的地方(如图2A所示)，沿移除平面1003 移除厚组织10的浅层组织。移除平面1003的深度T’必须小于浅层部分100的深度T，如例示移除平面1003的深度为150 μ m,而厚组织10浅层部分100深度为200 μ m,故当浅层部分100的影像被撷取完后，沿移除平面1003以上被移除掉的组织，其影像已在执行移除动作前被清楚撷取；因此，移除动作于切除平面所造成的破坏对后续待收集的组织影像不造成影响。如图2B所示，为执行第一次移除后的厚组织10，其有一个新的表面1001，自此表面1001往下方同为深度T (举例为200 μ m)的地方(范围自表面1001到界面1002)，是此移除后的厚组织10的新的浅层部分100 ；如前文所述，此浅层部分100是厚组织10可被撷取清楚影像的部分，又同前文所述的步骤，以激光30扫描撷取浅层部分100的影像后，在表面1001下方深度T’(举例为150 μ m)的地方，定义一新的移除平面1003，用以去除移除平面1003以上的组织。施行如上述步骤数次之后，即可完全撷取厚组织10各层面的影像，用以建构成厚组织10的立体影像。此厚组织10虽经数次的移除动作，然因移除面的深度T’ (如150 μ m) 浅于浅层部分100的深度T (如200 μ m)，执行移除前，厚组织10的浅层影像已被撷取，故移除动作对组织所造成的破坏，不影响所撷取影像的完整性。因而所建构还原的立体影像为完整厚组织10的三维结构影像。以下实施例说明如何决定出厚组织浅层100与深层101的界面1002以及移除平面1003 ；如图3所示，准备一经过一种光学澄清技术(如R)cus Clear)处理过的厚组织10， 组织厚度为D (举例为600 μ m)，置于一基座20之上。以共轭焦激光显微镜先以厚组织10 的表面1001为焦点平面(focal plane) 1001’，撷取其影像并开始往下撷取各深度平面的影像直到焦点平面1001，为距离表面1001下方d的位置(举例为200 μ m，如图4所示)。 发现此深度平面为可解析清楚影像的极限时，即可定义此处焦点平面1001’为厚组织10的浅层100与深层101的界面1002，而在界面1002以上各层的组织影像已被清晰地撷取。在界面1002上方约d’处(举例为50 μ m)定义出移除平面1003，在移除平面1003以上的组织将被移除。移除平面1003的决定原则是要在界面1002以上，目的是确保所去除组织的影像已被清晰地撷取，故移除面1003相对于界面1002并非一固定的距离，在极端情况移除面1003可与界面1002同一平面，上述实施例所举的d’仅用于说明本发明的概念，非用于限定本发明。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
权利要求
1.一种观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，包括提供一待扫描的厚组织，其中所述厚组织经过光学澄清技术处理进而容许反映其结构的光信号穿透；提供一光学扫描显微镜，用以撷取所述厚组织的影像； 提供一移除装置，用以移除部分所述厚组织；以所述光学扫描显微镜自所述厚组织的表面撷取所述厚组织的影像，之后渐次增加该光学扫描显微镜的取像深度，以撷取所述厚组织表面以下各深度平面的影像；以所述光学扫描显微镜所撷取的各深度平面的影像清晰度决定出距离所述厚组织表面的一扫描深度；在所述扫描深度上方的一特定距离决定出一移除平面；以所述移除装置移除所述移除平面以上的所述厚组织后，继续撷取所述厚组织更深层的影像。
2.如权利要求1所述的观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，先执行撷取影像后再移除部分所述厚组织。
3.如权利要求1所述的观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，所述厚组织经过光学澄清溶液的处理。
4.如权利要求1所述的观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，所述厚组织包含动物组织、植物组织、人造组织或生物材料。
5.如权利要求1所述的观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，所述光学扫描显微镜包含共轭焦激光显微镜、多光子激光显微镜、或其它可撷取特定光学切片的光学扫描显微镜。
6.如权利要求1所述的观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，所述移除装置的移除方法包含机械式切除、激光切除、化学腐蚀、烧灼。
7.如权利要求1所述的观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，所述扫描深度为观察者定义所观察清楚影像的极限。
8.一种观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，包括；提供一待扫描的厚组织，其中所述厚组织容许反映其结构的信号穿透； 提供一光学扫描显微镜，用以撷取所述厚组织的影像； 提供一移除装置，用以移除部分所述厚组织； 执行以下步骤多次，以撷取完整的所述厚组织的三维影像以所述光学扫描显微镜自所述厚组织的表面撷取所述厚组织的影像，之后渐次增加该光学扫描显微镜的取像深度，以撷取所述厚组织表面以下各深度平面的影像；以所述光学扫描显微镜所撷取的各深度平面的影像清晰度决定出距离所述厚组织表面的一扫描深度；在所述扫描深度上方的一特定距离决定出一移除平面；以所述移除装置移除所述移除平面以上的所述厚组织后，继续撷取所述厚组织更深层的影像。
9.如权利要求8所述的观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，先执行撷取影像后再移除所述厚组织，且所述移除平面的深度小于所述扫描深度。
10. 一种观察厚组织三维结构的方法，其特征在于，包括 提供一待扫描的厚组织，其中所述厚组织容许反映其结构的信号穿透； 提供一影像撷取装置，用以撷取所述厚组织的影像； 提供一移除装置，用以移除部分所述厚组织；以所述影像撷取装置自所述厚组织的表面撷取所述厚组织的影像，之后渐次增加所述影像撷取装置的取像深度，以撷取所述厚组织表面以下各深度平面的影像；以所述影像撷取装置所撷取的各深度平面的影像清晰度决定出距离所述厚组织表面的一扫描深度；在所述扫描深度上方的一特定距离决定出一移除平面；以所述移除装置移除所述移除平面以上的所述厚组织后，继续撷取所述厚组织更深层的影像。
全文摘要
本发明揭露一种观察厚组织三维结构的方法，包含提供一个经由光学澄清溶液FocusClear(参考美国第6472216B1号专利与中国台湾第206390号专利)处理的厚组织、一个光学扫描显微镜与一组织移除装置。光学扫描显微镜在扫描过程中同时使用组织移除装置去除扫描过的组织，其方式为先扫描后移除，且移除平面的深度小于扫描平面的深度。此方法保留了待扫描组织的完整性并克服了厚组织深层影像分辨率不佳的限制，而可以得到完整厚组织的三维影像。
文档编号G01B11/24GK102445161SQ20111020856
公开日2012年5月9日 申请日期2011年7月25日 优先权日2010年10月1日
发明者刘原安, 江安世, 汤学成 申请人:汤学成