专利名称：一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法
技术领域：
本发明涉及药物分析领域中的一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法。
背景技术：
左卡尼汀(carnitine)，又名左旋肉碱，于1905年由两位俄国科学家在肌肉提取物中首次被发现，其分子结构式为3-羟基-4-氮-三甲氨基丁酸。左卡尼汀是一种广泛存在于机体组织内的特殊氨基酸，为脂肪酸代谢的必需辅助因子，能促进脂肪酸经B-氧化进入三羧酸循环，产生能量，与机体的器官、组织代谢密切相关。左卡尼汀的缺乏会导致能量供应障碍及脂肪酸代谢的各种中间产物累积酸中毒，出现心肌病变、心律失常、机体疲劳等症状。左卡尼汀有两种光学异构体，即左旋体和右旋体，但仅左旋体具有生物活性，右旋体不具有任何活性。为保证药品的质量及其安全性，需建立检测方法对右旋体的含量进行控制。目前，关于左卡尼汀右旋异构体的检测方法，未见相关报道。因此，研制开发一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法一直是亟待解决的新课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，该方法采用衍生化试剂右旋的芴甲氧羰酰氯，与左卡尼汀中的右旋异构体形成荧光化合物，然后采用 HPLC(荧光检测器、梯度淋洗法)进行检测，通过该方法检测左卡尼汀中右旋异构体，重现性、灵敏度、准确度均能符合要求。本发明的目的是这样实现的一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，该检测方法包括如下步骤(1)色谱条件色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱，粒径5 μ m ；检测波长激发光波长λ ex = 260nm,荧光波长λ em = 315nm ；流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇和乙腈-水；(2)四正丁基氢氧化铵溶剂的制备吸取24. 4ml的55%的四正丁基氢氧化铵试剂，用水稀释至1000ml，摇勻，用磷酸调节pH至7. 0 ；(3)芴甲氧羰酰氯试剂的制备吸取1. Oml的0. 5%芴甲氧羰酰氯试剂，加3ml的丙酮，混勻；(4)系统适用性溶液的制备称取混旋左卡尼汀对照品10mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；(5)供试品溶液的制备称取供试品约10mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；(6)衍生反应
分别吸取供试品溶液、系统适用性溶液各0. Iml于容器中，再分别加0.細1芴甲氧羰酰氯试剂，置于80°C热反应器中，放置20分钟，取出冷却至室温，分别加入8ml的四正丁基氢氧化铵-甲醇流动相；(7)测定方法取系统适用性溶液的衍生反应液5 μ 1注入液相色谱仪，重复6次，记录图谱，左旋左卡尼汀保留时间为17. 8分钟，右旋左卡尼汀保留时间为14. 5分钟，左旋左卡尼汀、右旋左卡尼汀的相对标准偏差均应< 2. 0%，取供试液的衍生反应液5μ 1注入液相色谱仪，记录图谱，分别计算供试液中左旋左卡尼汀的峰面积和右旋左卡尼汀的峰面积；一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，所述四正丁基氢氧化铵-甲醇流动相中的四正丁基氢氧化铵溶液的配制方法为，精密吸取2. 4ml的55 %的四正丁基氢氧化铵试剂，置于IOOOml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇勻；所述流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇配比为60 40，pH值为3.0 ；所述流动相乙腈-水的配比为65 35，pH值为3. 0 ；所述检测方法采用流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇和乙腈-水浓度、流速梯度淋洗法；所述浓度、流速梯度淋洗法为如下步骤，洗脱开始后0-30分钟，四正丁基氢氧化铵-甲醇作为流动相，流速为0. 75ml/分；洗脱开始后31-49分钟，乙腈-水作为流动相，流速为1. 5ml/分；洗脱开始后50-55分钟，四正丁基氢氧化铵-甲醇作为流动相，流速为0. 75ml/分。本发明的要点在于它的检测方法，该方法采用衍生化试剂右旋的芴甲氧羰酰氯， 与左卡尼汀中的右旋异构体形成荧光化合物，然后采用HPLC(荧光检测器、梯度淋洗法)进行检测。一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法与现有技术相比，通过该方法检测左卡尼汀中右旋异构体，重现性、灵敏度、准确度均能符合要求等优点，将广泛的应用于药物分析领域中。
具体实施例方式以下实施例将有助于对本发明的了解，但实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。1.色谱条件色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱，粒径5 μ m ；检测波长激发光波长λ ex = ^Onm,荧光波长Xem = 315nm;流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇和乙腈-水； 柱温30°C，进样量5μ 1。2.相关溶液及流动相的配制2. 1相关溶液的配制2. 1. 1四正丁基氢氧化铵溶剂的制备精密吸取24. 4ml的55%的四正丁基氢氧化铵试剂，用水稀释至1000ml，摇勻，用磷酸调节PH至7.0。2. 1. 2右旋芴甲氧羰酰氯试剂的制备精密吸取1. Oml的右旋0. 5%芴甲氧羰酰氯试剂，加3ml的丙酮，混勻；2. 1. 3系统适用性溶液的制备精密称取混旋左卡尼汀对照品10. 06mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；2. 1. 4供试品溶液的制备供试品溶液1 分别精密称取供试品约10. 08mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；供试品溶液2 分别精密称取供试品约10. 10mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；供试品溶液3 分别精密称取供试品约10. 07mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；2. 2流动相的配制流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇中的四正丁基氢氧化铵溶液的配制方法为精密吸取2. 4ml的55%的四正丁基氢氧化铵试剂，置于IOOOml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇勻。将上述四正丁基氢氧化铵溶液和甲醇按照60 40的比例配制，用磷酸调节pH值为 3. O。将乙腈和水的按照65 35的比例配置，用磷酸调节pH值为3.0。3.衍生反应分别精密吸取三种供试品溶液和系统适用性溶液各0. Iml于容器中，再分别加 0. 4ml右旋芴甲氧羰酰氯试剂，置于80°C热反应器中，放置20分钟，取出冷却至室温，分别加入8ml的四正丁基氢氧化铵-甲醇流动相；4.测定方法采用流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇和乙腈-水的浓度、流速梯度淋洗法；洗脱开始后0-30分钟，四正丁基氢氧化铵-甲醇作为流动相，流速为0. 75ml/分； 洗脱开始后31-49分钟，乙腈-水作为流动相，流速为1.5ml/分；洗脱开始后50-55分钟， 四正丁基氢氧化铵-甲醇作为流动相，流速为0. 75ml/分。4. 1系统性试验取系统适用性溶液的衍生反应液5 μ 1注入液相色谱仪，重复6次，记录图谱，左旋左卡尼汀保留时间为17. 8分钟、右旋左卡尼汀保留时间为14. 5分钟峰面积的相对标准偏差RSD均应彡2.0%，右旋左卡尼汀连续6针的峰面积Al = 7297419 Α2 = 7287184 A3 = 7312474 Α4 = 7343279 Α5 =
7319699Α6 = 7356039 RSD = 0. 36%左旋左卡尼汀连续6针的峰面积Al = 7129370 A2 = 7113060 A3 = 7126835 A4 = 7173254 A5 = 7135040A6 = 7165539 RSD = 0. 33%4. 2供试样品试验分別取3批供试液的衍生反应液5 Pl注入液相色谱仪，各重复一次，记录图谱。5.计算结果
Ad
右旋左卡尼汀=--X 100%
al+ad其中Ad =供试液获得的右旋左卡尼汀的峰面积；Al =供试液获得的左旋左卡尼汀的峰面积；供试样品1
19520
右旋左卡尼汀= - X 100%= 0. 16%
19520+12028839
20285
右旋左卡尼汀= -X 100%= 0. 17%
20285+12015384供试样品2
9000
右旋左卡尼汀= - X 100%= 0. 08%
9000+11217224
10105
右旋左卡尼汀=- X 100%= 0. 09%
10105+11284469供试样品3
18420
右旋左卡尼汀=- X 100%= 0. 09%
18420+20863319
17095
右旋左卡尼汀=- X 100%= 0.08%
17095+2067077权利要求
1.一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，其特征在于该检测方法包括如下步骤(1)色谱条件色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱，粒径5 μ m ；检测波长激发光波长Xex = 260nm，荧光波长λ em = 315nm ；流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇和乙腈-水；(2)四正丁基氢氧化铵溶剂的制备吸取24. 4ml的55%的四正丁基氢氧化铵试剂，用水稀释至1000ml，摇勻，用磷酸调节 pH 至 7. 0 ；(3)芴甲氧羰酰氯试剂的制备吸取1. Oml的0. 5%芴甲氧羰酰氯试剂，加3ml的丙酮，混勻；(4)系统适用性溶液的制备称取混旋左卡尼汀对照品10mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；(5)供试品溶液的制备称取供试品约10mg，用四正丁基氢氧化铵溶剂溶解并稀释至50ml，摇勻；(6)衍生反应分别吸取供试品溶液、系统适用性溶液各0. Iml于容器中，再分别加0.芴甲氧羰酰氯试剂，置于80°C热反应器中，放置20分钟，取出冷却至室温，分别加入8ml的四正丁基氢氧化铵-甲醇流动相；(7)测定方法取系统适用性溶液的衍生反应液5 μ 1注入液相色谱仪，重复6次，记录图谱，左旋左卡尼汀保留时间为17. 8分钟，右旋左卡尼汀保留时间为14. 5分钟，左旋左卡尼汀、右旋左卡尼汀的相对标准偏差均应< 2. 0%，取供试液的衍生反应液5μ 1注入液相色谱仪，记录图谱，分别计算供试液中左旋左卡尼汀的峰面积和右旋左卡尼汀的峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，其特征在于所述四正丁基氢氧化铵-甲醇流动相中的四正丁基氢氧化铵溶液的配制方法为，精密吸取 2. 4ml的55%的四正丁基氢氧化铵试剂，置于IOOOml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇勻。
3.根据权利要求1或2所述的一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，其特征在于 所述流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇配比为60 40，pH值为3. 0。
4.根据权利要求1所述的一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，其特征在于所述流动相乙腈-水的配比为65 35，pH值为3.0。
5.根据权利要求1所述的一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，其特征在于所述检测方法采用流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇和乙腈-水浓度、流速梯度淋洗法。
6.根据权利要求5所述的一种左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，其特征在于所述浓度、流速梯度淋洗法为如下步骤，洗脱开始后0-30分钟，四正丁基氢氧化铵-甲醇作为流动相，流速为0. 75ml/分；洗脱开始后31-49分钟，乙腈-水作为流动相，流速为1. 5ml/分； 洗脱开始后50-55分钟，四正丁基氢氧化铵-甲醇作为流动相，流速为0. 75ml/分。
全文摘要
一种应用于药物分析领域中的左卡尼汀中右旋异构体的检测方法，该检测方法包括如下步骤色谱条件色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱，粒径5μm；检测波长激发光波长λex＝260nm，荧光波长λem＝315nm；流动相四正丁基氢氧化铵-甲醇和乙腈-水；四正丁基氢氧化铵溶剂的制备；芴甲氧羰酰氯试剂的制备；系统适用性溶液的制备；供试品溶液的制备；衍生反应；然后采用HPLC(荧光检测器、梯度淋洗法)进行检测。该发明检测左卡尼汀中右旋异构体，重现性、灵敏度、准确度均能符合要求。
文档编号G01N30/88GK102359995SQ20111022068
公开日2012年2月22日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者冯文宇, 刁恩德, 刘爱泉, 周岩, 唐奎山, 娄玉涛, 孟喆, 孟涛, 尤楠, 尹宏, 苏贵弟, 金玉坤 申请人:东北制药集团股份有限公司