专利名称：一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法
技术领域：
本发明涉及传感器用功能材料，尤其是涉及一种通过化学沉积微纳米银的光反射作用增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法。
背景技术：
近年来，随着光纤技术的发展，光纤生物传感器的研究逐渐兴起，其中光纤葡萄糖传感器由于在食品工业及医学检测技术中的广泛应用而备受关注。基于一些过渡金属配合物的荧光猝灭效应原理与酶促反应结合研制的生物传感器是一个重要的分支。该传感器与传统的电化学型生物传感器相比，具有无需参比电极，灵敏度高，无破坏性，安全无毒，不受电磁场干扰等独特的优点。自1967年Updik和Hicks首次研制出以钼电极为基体的葡萄糖氧化酶(GOD) 电极，用于定量检测血清中的葡萄糖含量，标志着第一代生物传感器的诞生。1972年， Guilbay It在钼电极上覆盖一层掺有葡萄糖氧化酶的选择性膜，保存10个月后相应电极上响应的稳定电流只减少了 0. 1%，从而制得具有较高稳定性和测量准确性的葡萄糖生物传感器。这一技术被美国如110 Springs Instrument (YSI)公司采用，于1975年首次研制出全球第一个商业用途的葡萄糖传感器。20世纪80年代开始出现以光学信号为检测指标的生物传感器，形成了光纤生物传感器.如在鲁米诺(Luminol)发光系统中，葡萄糖氧化酶固定在碳糊电极上，制成光导纤维电化学发光葡萄糖生物传感器(赵晓华，孟庆军，毕春元，张利群，史建国.葡萄糖生物传感器研究进展[J]山东科学，2009年)。S.deMarcos等人(S. deMareos，J. Galindo，J · F. Sierra，J. Galban，J. R. Castillo，An optical glucose biosensor based on derived glueose oxidase immobilized onto asol—gel matrix, Sensors and Actuators，B，1999，57 :227-232)利用分子氧的荧光猝灭原理设计一种将葡萄糖氧化酶固定在溶胶凝胶体系中的光纤葡萄糖传感器。同样，Martin Μ. F.等人(Martin Μ. F. ,Choi. Wilfred, S. H. PangiDan Xiao and Xiaojun Wu, An optical glueose biosensor with eggshell membrane as an enzyme immobilization platform，Analyst. ，2001，126 : 1558-1563)也设计出了基于“氧光极”的光纤葡萄糖传感器。目前仍然存在荧光信号弱，信号分辩率差等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法。本发明的技术方案是将荧光猝灭型葡萄糖传感膜附着于微纳米银的镜面基底上， 利用光的反射增强原理提高传感膜对溶液中葡萄糖浓度检测的性能。本发明的具体步骤如下1)将氨水加入硝酸银溶液中，至溶液由浑浊变澄清，再加入葡萄糖水溶液，混合后放入基片水浴加热，即可在基片表面形成一层镜面效果的微纳米银薄膜，形成基底；
2)取醋酸纤维素溶解于丙酮中，加入联吡啶钌，溶解后在步骤1)得到的基底表面形成一层氧敏感膜；3)在氧敏感膜表面加牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，冲洗后冷藏，即得复合传感膜，完成化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号。在步骤1)中，所述氨水的质量百分比浓度可为 5%;所述硝酸银溶液的质量百分比浓度可为 5%;所述葡萄糖水溶液的质量百分比浓度可为 3%;所述水浴加热的温度可为70 90°C ；所述基片可采用玻璃片。在步骤幻中，所述在步骤1)形成的基底表面形成一层氧敏感膜的方法，可采用旋涂法以2000 4000rpm的转速在步骤1)形成的基底表面形成一层氧敏感膜。在步骤3)中，所述冲洗，可采用去离子水冲洗至少1遍，所述冷藏的温度可为2 8V。本发明采用化学沉积法在载玻片上负载一层紧密的微纳米银，使其成为具有光反射作用的基底。将溶有联吡啶钌的丙酮-醋酸纤维素溶液采用旋涂法于基底上成膜，而后在其表面滴加葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液形成复合膜。与现有的透明玻璃片基底相比，通过荧光的反射叠加，可以放大葡萄糖及其他类型的生物光学传感膜的荧光强度，增强其信号，使其对细微浓度变化的检测更为灵敏，从而有效地提高精确度及线性相关度。本发明简单易行，制作时间短，可操作性强。
图1为复合传感膜附着于微纳米银基底的组合结构示意图。在图1中，标记1为微纳米银薄膜，2为透明玻璃，3为丙酮-醋酸纤维素的联吡啶钌氧敏感膜，4为戊二醛的葡萄糖氧化酶膜。图2为传感膜微纳米银基底的电子扫描表面形貌。在图2中，标尺为1 μ m。图3为复合传感膜在普通玻璃基底和微纳米银基底的激发光谱(虚线)和发射光谱(实线)对比图。在图3中，横坐标为波长wvaelengthfcm)，纵坐标为光谱强度 intensity (a. u.)；曲线1为微纳米银基底的传感膜的激发发射光谱，曲线2为透明玻璃基底的传感膜的激发发射光谱；曲线a和c为激发光谱，曲线b和d为发射光谱。由图3可见微纳米银基底的传感膜其激发峰和发射峰均明显强于透明玻璃基底传感膜。图4为普通玻璃基底的传感膜在不同葡萄糖浓度下所对应的荧光光谱。在图4中， 横坐标为波长wavelength (歷)，纵坐标为荧光光谱强度intensity (a. u.)；曲线1为8mM， 曲线2为6mM，曲线3为4mM，曲线4为2mM，曲线5为OmM。图5为附着于微纳米银基底的传感膜在不同葡萄糖浓度下所对应的荧光光谱谱图。在图5中，横坐标为波长wvaelengthfcm)，纵坐标为荧光光谱强度intensity (a. u.)； 曲线1为16mM，曲线2为8mM，曲线3为4mM，曲线4为2mM，曲线5为OmM ；与图4相比可见其荧光强度随葡萄糖浓度的变化更明显。图6为复合传感膜在普通玻璃基底的荧光强度与葡萄糖浓度关系图的对比图。 在图6中，横坐标为葡萄糖浓度glucose concentration(mmol/1)，纵坐标为荧光光谱强度intensity (a. U.)；图中曲线为实际测试数值，直线为线性拟合结果，拟合公式为Y = 270. 35+7. 59*X，线性相关度 R 为 0. 97。
图7为复合传感膜在微纳米银基底的荧光强度与葡萄糖浓度关系图的对比图。 在图7中，横坐标为葡萄糖浓度glucose concentration (mmol/1)，纵坐标为荧光光谱强度intensity (a. U.)；图中曲线为实际测试数值，直线为线性拟合结果，拟合公式为Y = 6760. 75+213. 78*X，线性相关度 R 为 0. 98。由图6和图7可见，本发明方法可提高其线性相关性。
具体实施例方式以下实施例将对本发明作进一步说明。其使用为将传感膜放入石英比色皿中，加入不同浓度的葡萄糖溶液，采用荧光分光光度计测试荧光强度，做标准曲线；将传感膜放入石英比色皿中，加入样品并测试，根据标准曲线计算出样品葡萄糖的浓度。实施例1 把Iwt %的氨水缓慢滴入3wt %的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴 Iwt%的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片2上后70°C水浴加热，IOmin取出洗净，即得到图1 中的微纳米银薄膜1。取醋酸纤维素溶解于丙酮中，加入0.5mmol/l联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以3000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，得到图1中的丙酮-醋酸纤维素的联吡啶钌氧敏感膜3 ；在其上滴加lu/y 1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，池后用去离子水反复冲洗，即得到图1中戊二醛的葡萄糖氧化酶膜4。此复合传感膜的微观结构如图2所示。将此复合传感膜置于4°C冷藏。分别测试附着于玻璃片2上的传感膜和本发明所示的微纳米银基底的传感膜的激发和发射光谱，结果如图3所示。把附着于玻璃片上的传感膜放入石英比色皿中，加入不同浓度的葡萄糖溶液，采用荧光分光光度计测试荧光强度随葡萄糖浓度的变化并绘制曲线作为对比。结果如图4和 6所示。把附着于本发明所示的微纳米银基底的传感膜放入石英比色皿中，加入不同浓度的葡萄糖溶液，采用荧光分光光度计测试荧光强度随葡萄糖浓度的变化并绘制曲线，结果如图5和和7所示。把传感膜放入石英比色皿中，加入样品并测试，根据标准曲线计算出样品葡萄糖的浓度。实施例2 把5wt %的氨水缓慢滴入Iwt %的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片70°C水浴加热，5min取出洗净。取醋酸纤维素溶解
于丙酮中，加入lmmol/1联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以2000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，在其上滴加lu/μ 1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，2h后用去离子水反复冲洗，置于6°C冷藏。测试方法同实施例1。实施例3 把3wt %的氨水缓慢滴入5wt %的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片80°C水浴加热，15min取出洗净。取醋酸纤维素溶
解于丙酮中，加入0. 5mmol/l联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以4000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，在其上滴加5ιι/μ1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，Ih后用去离子水反复冲洗，置于8°C冷藏。测试方法同实施例1
实施例4 把2wt %的氨水缓慢滴入%的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴 Iwt %的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片70°C水浴加热，i:3min取出洗净。取醋酸纤维素溶解于丙酮中，加入lmmol/1联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以3000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，在其上滴加5ιι/μ 1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，5h后用去离子水反复冲洗，置于7°C冷藏。测试方法同实施例1。实施例5 把%的氨水缓慢滴入2wt %的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片80°C水浴加热，12min取出洗净。取醋酸纤维素溶
解于丙酮中，加入lmmol/1联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以4000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，在其上滴加5ιι/μ 1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，池后用去离子水反复冲洗，置于；TC冷藏。测试方法同实施例1。实施例6 把2wt %的氨水缓慢滴入3wt %的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴 Iwt %的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片70°C水浴加热，IOmin取出洗净。取醋酸纤维素溶解于丙酮中，加入lmmol/1联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以2000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，在其上滴加5ιι/μ 1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，他后用去离子水反复冲洗，置于5°C冷藏。测试方法同实施例1。实施例7 把3wt %的氨水缓慢滴入2wt %的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片90°C水浴加热，Smin取出洗净。取醋酸纤维素溶解
于丙酮中，加入lmmol/1联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以3000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，在其上滴加5ιι/μ 1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，3h后用去离子水反复冲洗，置于3°C冷藏。测试方法同实施例1。实施例8 把5wt %的氨水缓慢滴入2wt %的硝酸银溶液中至溶液澄清，加入几滴 Iwt %的葡萄糖水溶液，放入洁净玻璃片70°C水浴加热，15min取出洗净。取醋酸纤维素溶解于丙酮中，加入lmmol/1联吡啶钌持续搅拌至完全溶解，采用旋涂法以2000rpm的转速在基底表面形成一层氧敏感膜，在其上滴加5ιι/μ 1牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，5h后用去离子水反复冲洗，置于5°C冷藏。测试方法同实施例1。
权利要求
1.一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于其具体步骤如下1)将氨水加入硝酸银溶液中，至溶液由浑浊变澄清，再加入葡萄糖水溶液，混合后放入基片水浴加热，即可在基片表面形成一层镜面效果的微纳米银薄膜，形成基底；2)取醋酸纤维素溶解于丙酮中，加入联吡啶钌，溶解后在步骤1)得到的基底表面形成一层氧敏感膜；3)在氧敏感膜表面加牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，冲洗后冷藏，即得复合传感膜，完成化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号。
2.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤1)中，所述氨水的质量百分比浓度为 5%。
3.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤1)中，所述硝酸银溶液的质量百分比浓度为 5%。
4.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤1)中，所述葡萄糖水溶液的质量百分比浓度为 3%。
5.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤1)中，所述水浴加热的温度为70 90°C。
6.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤1)中，所述基片采用玻璃片。
7.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤幻中，所述在步骤1)得到的基底表面形成一层氧敏感膜的方法，是采用旋涂法以2000 4000rpm的转速在步骤1)得到的基底表面形成一层氧敏感膜。
8.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤3)中，所述冲洗，是采用去离子水冲洗至少1遍。
9.如权利要求1所述的一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，其特征在于在步骤3)中，所述冷藏的温度为2 8°C。
全文摘要
一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法，涉及传感器用功能材料。提供一种化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号的方法。将氨水加入硝酸银溶液中，至溶液由浑浊变澄清，再加入葡萄糖水溶液，混合后放入基片水浴加热，即可在基片表面形成一层镜面效果的微纳米银薄膜，形成基底；取醋酸纤维素溶解于丙酮中，加入联吡啶钌，溶解后在基底表面形成一层氧敏感膜；在氧敏感膜表面加牛血清白蛋白为保护剂的葡萄糖氧化酶的戊二醛溶液，冲洗后冷藏，即得复合传感膜，完成化学沉积微纳米银增强葡萄糖传感膜荧光信号。简单易行，制作时间短，可操作性强。
文档编号G01N21/64GK102374982SQ20111027783
公开日2012年3月14日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者林一森, 熊兆贤, 蔡毅翔, 陈淑娴, 鲁青君 申请人:厦门大学