专利名称：含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于酶生物工程技术领域，特别是涉及含纳米银溶胶的酶功能复合高敏度敏感膜及其制法和用途。
利用酶生物工程制造出的产品，广泛用于人体及工业中，例如利用葡萄糖氧化酶组装的葡萄糖生物传感器，可用于测量人的血糖、工业废水、发酵或饮料中的糖分。生物传感器具有非常明显的优点，如高专一性、短时低费用消耗、对分析物质没有特殊的要求、操作安全、便于现场测定等等，在许多国家已有很多成果。传感器研究工作者都了解，研制酶生物传感器，首先是研制以高效率工作的分子识别反应的生物传感器单元，对此追求的目标是灵敏、价廉、微型化。但是生物传感器发展至今，能进入实际使用的为数不多。以葡萄糖生物传感器为例，葡萄糖生物传感器工作时通常是基于对葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖时产生的过氧化氢的电流进行检测。这种方法有如下局限溶氧的浓度不是足够大时，难以对高含量底物进行测定；而酶用量过多时响应电流传递效率低。近年来，金属、金属氧化物半导体纳米颗粒奇特的物理特性引起人们的注意。纳米颗粒当小到一定尺寸时，具有与其相应块体材料所不具有的新性质和新效应，如表面效应、体积效应、隧道效应、量子效应等。由于其表面效应，金属颗粒表面带有很高的负电荷，易于通过表面修饰调控光学、电学特性等，引起人们极大的兴趣和关注。其中金属颗粒导电性较佳，可在酶与电极间传递电子。提高固定化酶的催化活性。美国A.L.Crumbliss.等人曾引入亲水的金颗粒到生物传感器中，证明了金颗粒的生物相容性，但他们用的是50纳米的亲水金颗粒，对酶电极的电流响应敏感度没有帮助，这在《生物技术和生物工程》杂志，1992年，40卷，483-490页的文章“适用于作为电沉析法组装酶电极的一种生物相容固定介质-胶体金”已有报导(A.L.Crumbliss.S.C.Perine,J.Stonehuerner,K.R.Tubergen,Junguo Zhao,andR.W.Henkens,Biotechnology and Bioengineering,Vol.40 Pp.483-490(1992))。
中国专利申请97116989.6中报导了含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜，将通常含葡萄糖氧化酶的酶膜电极电流响应灵敏度提高了至少10倍。目前生物传感器的研究正向着高性能、微型化、走入家庭方向发展，是一种被普遍认为最有可能形成产业的高技术。
本发明的目的在于将纳米银溶胶特别是憎水纳米银溶胶引入酶功能复合敏感膜中，提供一种能够节约酶用量、提高酶生物传感器电流响应灵敏度的含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜及其制法和用途。这种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，酶用量仅是通常用量的几分之一，而提高酶生物传感器的电流响应敏感度几十倍。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的本发明的含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，其特征在于通过下述方法得到将重量摩尔浓度为1×10-6～10-1mol/kg的纳米银溶胶溶液0.1～10ml同浓度为50～1000个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接着加入重量百分比浓度为0.5～5％的高分子的凝胶溶液10～200ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为1～10％的戊二醛0.1～5ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
其中纳米银溶胶溶液为亲水纳米银溶胶溶液或憎水纳米银溶胶溶液，银溶胶的粒径为1～25纳米，优选为1～12纳米；氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黄嘌呤氧化酶等；高分子为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲或乙烯-乙烯醇共聚物等；固体载体为铂丝。
本发明的含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于按如下步骤进行第一步采用溶胶-凝胶法制备亲水纳米银溶胶溶液，具体制备方法如下①．分别配制硝酸银及还原剂的水溶液，其重量摩尔浓度分别为1×10-6-1×10-1mol/Kg和1×10-6-1mol/Kg；其中还原剂为硼氢化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、乙醇或肼等；②．制备亲水纳米银溶胶溶液室温或在25-90℃下将硝酸银水溶液和还原剂的水溶液分别加入反应容器中，其中硝酸银水溶液及还原剂的水溶液的摩尔比为1∶1～1∶30，混合溶液在搅拌下反应0.5～10小时，即得到粒径在1～25纳米，优选为1～12纳米的亲水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5×10-6-1×10-1mol/kg。
或采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液反胶束是指表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，形成亲水极性基头朝内，疏水链向外的液体颗粒结构。反胶团的内核可增溶大量的水分子和水可溶的电解质及不同的化合物，形成的水核是一个很好的“微型反应器”。
具体制备方法如下①配制表面活性剂的非极性有机溶剂溶液，其重量摩尔浓度为50-300毫摩尔/千克溶剂；其中表面活性剂为非离子表面活性剂如烷基酚聚氧乙烯醚(分子式为 烷基R为C7～C9的烷基)系列、山梨醇脂肪酸酯或失水山梨醇脂肪酸酯系列；阴离子表面活性剂如二辛基琥珀酸酯磺酸钠(俗称AOT)；天然表面活性剂如卵磷脂等；非极性有机溶剂为正己烷、环己烷、异辛烷或氯仿等。
②分别配制硝酸银水溶液和还原剂水溶液，其重量摩尔浓度均为1×10-6～1×10-1摩尔/千克，且都依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的水与表面活性剂的摩尔比(Rw值)及电解质硝酸银或还原剂与表面活性剂的摩尔比(RE值)来确定，RE值包括RAg值和R还值。当Rw值为1-15时，RE值为0.0001-0.015；或当Rw值为22-50时，RE值为0.01-0.6；其中还原剂为柠檬酸、柠檬酸钠、硼氢化钠、乙醇或肼等；反胶束内的水核尺寸，是由增溶水的量决定的，即Rw值的大小代表了由表面活性剂所包围的水核的直径大小，随Rw值的增大，水核直径增大，因此在水核内进行化学反应制备超细颗粒时，水核的尺寸直接限定颗粒尺寸的大小，是控制颗粒大小的最主要因素。RE值的大小，代表了由表面活性剂所包围的水核里增溶的电解质的量，随RE值的增大，所增溶的硝酸银或还原剂的量增大。其用量随所用的表面活性剂和不同的溶剂来决定。本发明中，颗粒粒径随RAg值增大而增大。但做这方面工作的研究者都应知道，这种变化比起导致胶体颗粒增大的水滴体积来说，这种变化是温和的。
③制备硝酸银及还原剂的反胶束溶液取②中配好的硝酸银及还原剂的水溶液分别加入到相同体积0.01～1升的步骤①中配制的表面活性剂的非极性有机溶剂溶液中，硝酸银及还原剂的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值及RE值来确定，其中当Rw值为1-15时，RE值为0.0001-0.015；或当Rw值为22-50时，RE值为0.01-0.6；④．制备憎水纳米银溶胶溶液室温或25-35℃下，按相同体积将步骤③中的硝酸银及还原剂的反胶束溶液在搅拌下混合1～8小时，即得到粒径在1～25纳米，优选为1～12纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5×10-6～1×10-1摩尔/千克。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质溶解在相应的有机溶剂或水中，使得溶液的重量百分比浓度为0.5～5％；其中高分子物质为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲、羟丙基纤维素或乙烯-乙烯醇共聚物等；有机溶剂为丙酮、无水乙醇、环氧六烷或异丙醇等；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为5×10-6～1×10-1mol/kg的纳米银溶胶溶液0.1～10ml同浓度为50～1000个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接着加入重量百分比浓度为0.5～5％的高分子的凝胶溶液10～200ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为1～10％的戊二醛0.1～5ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
其中银溶胶溶液为亲水纳米银溶胶溶液或憎水纳米银溶胶溶液，银溶胶的粒径为1～25纳米，优选为1～12纳米；氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶等；高分子为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲、羟丙基纤维素或乙烯-乙烯醇共聚物等；固体载体为铂丝。
本发明的用途本发明所制备的酶功能复合敏感膜，可用于酶生物传感器、生物分离膜和生物催化工程。尤其是葡萄糖生物传感器特别适用于人体中的血糖、工业废水、培养液、发酵及饮料中糖分的测量等。
本发明的优点及效果本发明所制备出的纳米银溶胶生物膜，具有常规有机生物膜不可比拟的优越性，从用本发明的膜做的生物传感器电极就可看出。
将用上述方法制得的纳米银溶胶的葡萄糖氧化酶生物膜，涂在铂丝上制成的电极作为工作电极，Ag/AgCl电极或甘汞电极做为参比电极，组成葡萄糖氧化酶生物传感器。将葡萄糖氧化酶生物传感器的双电极置于PH值为6-7的磷酸盐缓冲液电池里，测其基质电流，然后依次加入不同浓度的葡萄糖水溶液，测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度(2-35mmol葡萄糖每升)做出电极电流响应曲线。
由于此种生物传感器电极酶膜对葡萄糖具有特征的响应，因此它特别适用于人体中的血糖，工业废水，发酵，饮料中糖分的测量等。
由于此种生物传感器电极所用酶膜含有粒径1-25纳米，特别是1-12纳米银溶胶(又特别是憎水银溶胶)，所以它的电极电流响应比未引入银溶胶的电极电流高几十倍。且酶用量是通常用量的5～50分之一。如图1所示曲线A是含憎水纳米银溶胶的葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖浓度做的电极电流响应曲线，而曲线B是不含憎水纳米银溶胶的葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖浓度做的电极电流响应曲线。曲线A的电流响应值较曲线B的电流响应值提高了50倍。
由于纳米级的憎水银溶胶的引入，憎水银溶胶表面疏水链与葡萄糖氧化酶的疏水链作用，使葡萄糖氧化酶构象变得更加稳定，这种疏水作用的结果，也增加了葡萄糖氧化酶的灵敏度。同时，在与水混溶的高极性有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮里，它同高分子凝胶共价固定在电极的表面上，仍保持很高的酶活性。而通常，亲水的氧化酶在这些高极性有机溶剂里会很快失活，而失去催化活性。含有粒径1-10nm憎水纳米银溶胶的葡萄糖传感器同时更加减少了葡萄糖氧化酶的用量，由于憎水银溶胶的电子传递催化作用，每1ml高分子凝胶中仅用通常酶用量的几-几十分之一，即几十个甚至几个单位的葡萄糖氧化酶，就可以获得几千甚至几万纳安/厘米2(nA/cm2)的响应电流。另外，含憎水银溶胶的葡萄糖传感器的稳定性也大大提高，实验连续测定50次，电极电流响应结果很重复。而未引入纳米憎水银溶胶的传感器仅能重复测定7、8次左右。
从上述结果就可看出，本发明的生物膜，特别适用于制造生物工程所用的产品，其效果具有突出的质变。
总之，本发明有如下优点1．制备简单易行，不需化学后处理，易于推广应用。
2．由于纳米级的银溶胶，特别是憎水银溶胶的引入，能使产品稳定性及寿命较未引入纳米憎水银溶胶的产品大大提高，所用酶量也比通常用量大大减少，这就大大降低了含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的成本。
3．在有机溶剂，即使在有与水可混溶的有机溶剂里，仍可保证酶蛋白无损伤固定化。
图1-电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线横坐标---葡萄糖浓度(单位mmol/L)纵坐标---响应电流(单位nA/cm2)曲线A---含憎水纳米银溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线曲线B---不含憎水银溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线图2--含亲水纳米银溶胶和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极的制法实施例1中电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线横坐标---葡萄糖浓度(单位mmol/L)纵坐标---响应电流(单位nA/cm2)曲线C---含亲水纳米银溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线图3--含憎水纳米银溶胶和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极的制法实施例2中电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线横坐标---葡萄糖浓度(单位mmol/L)纵坐标---响应电流(单位nA/cm2)曲线D---含憎水纳米银溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线图4--含憎水纳米银溶胶和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极的制法实施例3中电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线横坐标---葡萄糖浓度(单位mmol/L)纵坐标---响应电流(单位nA/cm2)曲线E---含憎水纳米银溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响 应曲线下面结合附图及实施例对本发明作进一步的描述实施例1第一步采用溶胶-凝胶法制备亲水纳米银溶胶溶液分别配制硝酸银及还原剂硼氢化钠的水溶液，其重量摩尔浓度分别为3.9×10-4mol/Kg和3.9×10-3mol/Kg；制备亲水纳米银溶胶溶液80℃将硝酸银水溶液和还原剂硼氢化钠的水溶液分别加入反应容器中，其中硝酸银水溶液及还原剂硼氢化钠的水溶液的摩尔比为1∶10，混合溶液在搅拌下反应0.5小时，即得到粒径在6纳米的亲水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为3.9×10-4mol/Kg。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为3.9×10-4mol/Kg的纳米银溶胶溶液2ml同浓度为500个活力单位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液0.3ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子聚乙烯醇缩丁醛的凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛1ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
用Ag/AgCl电极做为参比电极，将双电极置于5ml PH值为6.86的磷酸盐缓冲液电池里，测其基质电流，然后依次加入体积摩尔浓度为2.8、5.6、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3mmol/L的β-D葡萄糖水溶液，测其响应电流(Y轴)，对应于相应的葡萄糖浓度(X轴)做出响应曲线C，如图2所示，葡萄糖浓度为33mmol/L，电极响应电流可达7875nA/cm2。而不含纳米亲水银溶胶，但含相同酶用量的葡萄糖氧化酶电极的电极电流响应仅500nA/cm2。实施例2第一步采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液1)．配制阴离子表面活性剂二辛基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)的环己烷溶液，其重量摩尔浓度为200毫摩尔/千克溶剂；2)．分别配制硝酸银水溶液和还原剂硼氢化钠水溶液，其重量摩尔浓度分别为3.9×10-4摩尔/千克，7.8×10-4摩尔/千克，所要求的Rw值为8，RAg值为0.005和R还为0.01值。
3)．制备硝酸银及还原剂硼氢化钠的反胶束溶液取硝酸银及还原剂硼氢化钠的水溶液分别加入到相同体积0.1升的步骤1)中配制的表面活性剂的非极性有机溶剂坏己烷溶液中，硝酸银及还原剂硼氢化钠的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值8，RAg值为0.005和R还为0.01。
4)．制备憎水纳米银溶胶溶液25℃下，按相同体积将步骤3)中的硝酸银及还原剂硼氢化钠的反胶束溶液在搅拌下混合8小时，即得到粒径在8纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为3.9×10-4摩尔/千克。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为3.9×10-4摩尔/千克的纳米银溶胶溶液5ml同浓度为500个活力单位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液0.3ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子聚乙烯醇缩丁醛的凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为1％的戊二醛1.2ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
按实施例1的方式测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度做出响应曲线D。如图3所示，葡萄糖浓度为33mmol/l，电极响应电流可达32365nA/cm2。实施例3第一步采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液1)．配制非离子表面活性剂辛基酚聚氧乙烯醚(TritonX-45)的环己烷溶液，其重量摩尔浓度为300毫摩尔/千克溶剂；2)．分别配制硝酸银水溶液和还原剂柠檬酸钠水溶液，其重量摩尔浓度分别为2.3×10-5摩尔/千克，6.9×10-4摩尔/千克，所要求的Rw值为6，RAg值为0.0003和R还为0.009。
3)．制备硝酸银及还原剂柠檬酸钠的反胶束溶液取硝酸银及还原剂柠檬酸钠的水溶液分别加入到相同体积0.1升的步骤1)中配制的表面活性剂TritonX-45的环己烷溶液中，硝酸银及还原剂柠檬酸钠的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值6，RAg值为0.0003和R还为0.009。
4)．制备憎水纳米银溶胶溶液30℃下，按相同体积将步骤3)中的硝酸银及还原剂柠檬酸钠的反胶束溶液在搅拌下混合8小时，即得到粒径在8纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为2.3×10-5摩尔/千克。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质醋酸纤维素溶解在丙酮中，使得溶液的重量百分比浓度为1％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为2.3×10-5摩尔/千克的纳米银溶胶溶液30ml同浓度为500个活力单位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液5ml混合；接着加入重量百分比浓度为1％的高分子醋酸纤维素的凝胶溶液100ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为10％的戊二醛2ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
按实施例1的方式测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度做出响应曲线E。如图4所示，葡萄糖浓度为33mmol/l，电极响应电流可达14526nA/cm2。实施例4第一步采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液1)．配制天然表面活性剂卵磷脂的非极性有机溶剂氯仿溶液，其重量摩尔浓度为100毫摩尔/千克溶剂；2)．分别配制硝酸银水溶液和还原剂柠檬酸钠水溶液，其重量摩尔浓度分别为1.6×10-3摩尔/千克，1.6×10-2摩尔/千克，所要求的Rw值为10，RAg值为0.002和R还为0.015值。
3)．制备硝酸银及还原剂柠檬酸钠的反胶束溶液取硝酸银及还原剂柠檬酸钠的水溶液分别加入到相同体积0.1升的步骤1)中配制的表面活性剂的非极性有机溶剂氯仿溶液中，硝酸银及还原剂柠檬酸钠的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值10，RAg值为0.002和R还为0.015。
4)．制备憎水纳米银溶胶溶液25℃下，按相同体积将步骤3)中的硝酸银及还原剂柠檬酸钠的反胶束溶液在搅拌下混合8小时，即得到粒径在9纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为1.6×10-3摩尔/千克。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质聚氨酯溶解在环氧六烷中，使得溶液的重量百分比浓度为1％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为1.6×10-3摩尔/千克的纳米银溶胶溶液1ml同浓度为50个活力单位/毫升的乳酸氧化酶水溶液0.1ml混合；接着加入重量百分比浓度为1％的高分子聚氨酯的凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛0.2ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
按实施例1的方式测其响应电流，葡萄糖浓度为10mmol/L时电极响应电流可达2436nA/cm2。实施例5第一步采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液1)．配制壬基酚聚氧乙烯醚(6)的正己烷溶液，其重量摩尔浓度为200毫摩尔/千克溶剂；2)．分别配制硝酸银水溶液和还原剂肼的水溶液，其重量摩尔浓度分别为4.7×10-2摩尔/千克，7.1×10-1摩尔/千克，所要求的Rw值为45，RAg值为0.3和R还为0.6值。
3)．制备硝酸银及还原剂的反胶束溶液取硝酸银及还原剂肼的水溶液分别加入到相同体积0.1升的步骤1)中配制的壬基酚聚氧乙烯醚(6)的正己烷溶液中，硝酸银及还剂的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值为45，RAg值为0.3和R还为0.6。
4)．制备憎水纳米银溶胶溶液25℃下，按相同体积将步骤3)中的硝酸银及还原剂肼的反胶束溶液在搅拌下混合8小时，即得到粒径在23纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为4.7×10-2摩尔/千克。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在异丙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为5％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为4.7×10-2摩尔/千克的纳米银溶胶溶液5ml同浓度为100个活力单位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶0.6ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子聚乙烯醇缩丁醛的凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为1％的戊二醛1.2ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
按实施例1的方式测其响应电流，葡萄糖浓度为33mmol/L时电极响应电流可达11565nA/cm2。实施例6第一步采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液1)．配制阴离子表面活性剂二辛基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)的异辛烷溶液，其重量摩尔浓度为50毫摩尔/千克溶剂；2)．分别配制硝酸银水溶液和还原剂柠檬酸水溶液，其重量摩尔浓度分别为7.8×10-6摩尔/千克，7.8×10-6摩尔/千克，所要求的Rw值为1 5，RAg值为0.0001和R还为0.0001值。
3)．制备硝酸银及还原剂柠檬酸的反胶束溶液取硝酸银及还原剂柠檬酸的水溶液分别加入到相同体积0.02升的步骤1)中配制的表面活性剂二辛基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)的异辛烷溶液中，硝酸银及还原剂柠檬酸的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值15，RAg值为0.0001和R还为0.0001。
4)．制备憎水纳米银溶胶溶液室温下，按相同体积将步骤3)中的硝酸银及还原剂柠檬酸的反胶束溶液在搅拌下混合6小时，即得到粒径在3纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为7.8×10-6摩尔/千克。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为7.8×10-6摩尔/千克的纳米银溶胶溶5ml同浓度为100个活力单位/毫升的醇氧化酶水溶0.3ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子聚乙烯醇缩丁醛的凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为1％的戊二醛1.2ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
按实施例1的方式测其响应电流，葡萄糖浓度为10mmol/l，电极响应电流可达3054nA/cm2。实施例7第一步采用溶胶-凝胶法制备亲水纳米银溶胶溶液分别配制硝酸银及还原剂柠檬酸的水溶液，其重量摩尔浓度分别为5.6×10-4，mol/Kg和2.8×10-3mol/Kg；制备亲水纳米银溶胶溶液60℃将硝酸银水溶液和还原剂柠檬酸的水溶液分别加入反应容器中，其中硝酸银水溶液及还原剂柠檬酸的水溶液的摩尔比为1∶5混合溶液在搅拌下反应0.5小时，即得到粒径在12纳米的亲水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5.6×10-4mol/Kg。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为5.6×10-4mol/Kg的纳米银溶胶溶2ml同浓度为1000个活力单位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液0.3ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子的凝胶溶液20ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛3ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
按实施例1的方式测其响应电流，葡萄糖浓度为10mmol/l，电极响应电流可达8112nA/cm2。实施例8第一步采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液1)．配制非离子表面活性剂TritonX-100的环己烷溶液，其重量摩尔浓度为200毫摩尔/千克溶剂；2)．分别配制硝酸银水溶液和还原剂柠檬酸钠水溶液，其重量摩尔浓度分别为5.4×10-5摩尔/千克，2.7×10-4摩尔/干克，所要求的Rw值为2，RAg值为0.0007和R还为0.0035值。
3)．制备硝酸银及还原剂柠檬酸钠的反胶束溶液取硝酸银及还原剂柠檬酸钠的水溶液分别加入到相同体积0.1升的步骤1)中配制的非离子表面活性剂TritonX-100的环己烷溶液中，硝酸银及还原剂柠檬酸钠的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值2，RAg值为0.0007和R还为0.0035。
4)．制备憎水纳米银溶胶溶液25℃下，按相同体积将步骤3)中的硝酸银及还原剂柠檬酸钠的反胶束溶液在搅拌下混合5小时，即得到粒径在2纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5.4×10-4摩尔/千克。
第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为5.4×10-4摩尔/千克的纳米银溶胶溶5ml同浓度为500个活力单位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶0.4ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子的凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛1.1ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体铂丝表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
按实施例1的方式测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度做出响应曲线葡萄糖浓度为20mmol/l，电极响应电流可达8353nA/cm2。
权利要求
1．一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，其特征在于通过下述方法得到将重量摩尔浓度为1×10-6～10-1mol/kg的纳米银溶胶溶液0.1～10ml同浓度为50～1000个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接着加入重量百分比浓度为0.5～5％的高分子的凝胶溶液10～200ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为1～10％的戊二醛0.1～5ml进行交联；将上述混合溶液涂在固体载体上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
2．如权利要求1所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的纳米银溶胶溶液为憎水纳米银溶胶溶液。
3．如权利要求1所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的纳米银溶胶溶液为亲水纳米银溶胶溶液。
4．如权利要求1或2或3所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的银溶胶的粒径为1～25纳米。
5．如权利要求4所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的银溶胶的粒径为1～12纳米。
6．如权利要求1所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黄嘌呤氧化酶；高分子为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲或乙烯-乙烯醇共聚物；固体载体为铂丝。
7．一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于按如下步骤进行第一步采用溶胶-凝胶法制备亲水纳米银溶胶溶液，具体制备方法如下①．分别配制硝酸银及还原剂的水溶液，其重量摩尔浓度分别为1×10-6-1×10-1mol/Kg和1×10-6-1mol/Kg；②．制备亲水纳米银溶胶溶液室温或在25-90℃下将硝酸银水溶液和还原剂的水溶液分别加入反应容器中，其中硝酸银水溶液及还原剂的水溶液的摩尔比为1∶1～1∶30，混合溶液在搅拌下反应0.5～10小时，即得到粒径在1～25纳米的亲水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5×10-6-1×10-1mol/kg；或采用反胶束法制备憎水纳米银溶胶溶液1)配制表面活性剂的非极性有机溶剂溶液，其重量摩尔浓度为50-300毫摩尔/千克溶剂，2)分别配制硝酸银水溶液和还原剂水溶液，其重量摩尔浓度均为1×10-6～1×10-1摩尔/千克，且都依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的水与表面活性剂的摩尔比即Rw值及电解质硝酸银或还原剂与表面活性剂的摩尔比即RE值来确定，RE值包括RAg值和R还值；当Rw值为1-15时，RE值为0.0001-0.015；或当Rw值为22-50时，RE值为0.01-0.6；3)制备硝酸银及还原剂的反胶束溶液取2)中配好的硝酸银及还原剂的水溶液分别加入到相同体积0.01～1升的步骤1)中配制的表面活性剂的非极性有机溶剂溶液中，硝酸银及还原剂的水溶液的用量依据憎水纳米银溶胶的大小所要求的Rw值及RE值来确定，其中当Rw值为1-15时，RE值为0.0001-0.015；或当Rw值为22-50时，RE值为0.01-0.6；4)制备憎水纳米银溶胶溶液室温或25-35℃下，按相同体积将步骤3)中的硝酸银及还原剂的反胶束溶液在搅拌下混合1～8小时，即得到粒径在1～25纳米的憎水纳米银溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5×10-6～1×10-1摩尔/千克；第二步制备高分子的凝胶溶液将高分子物质溶解在相应的有机溶剂或水中，使得溶液的重量百分比浓度为0.5～5％；第三步制备含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜按如下步骤进行将重量摩尔浓度为5×10-6～1×10-1mol/kg的纳米银溶胶溶液0.1～10ml同浓度为50～1000个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接着加入重量百分比浓度为0.5～5％的高分子的凝胶溶液10～200ml，搅拌均匀，再加入重量百分比浓度为1～10％的戊二醛0.1～5ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米银溶胶的氧化酶功能复合敏感膜。
8．如权利要求7所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于所述的纳米银溶胶的粒径为1～12纳米。
9．如权利要求7所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于所述的还原剂为硼氢化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、乙醇或肼；所述的表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或天然表面活性剂；所述的非极性有机溶剂为正己烷、环己烷、异辛烷或氯；所述的高分子物质为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲、羟丙基纤维素或乙烯-乙烯醇共聚物；所述的有机溶剂为丙酮、无水乙醇、环氧六烷或异丙醇。
10．如权利要求7或9所述的一种含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于所述的非离子表面活性剂为烷基酚聚氧乙烯醚系列或山梨醇脂肪酸酯或失水山梨醇脂肪酸酯系列；阴离子表面活性剂为二辛基琥珀酸酯磺酸钠；天然表面活性剂为卵磷脂。
11．一种权利要求1所述的含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的用途，其特征在于用于酶生物传感器、生物分离膜和生物催化工程。
12．如权利要求11所述的含纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜的用途，其特征在于所述的酶生物传感器为葡萄糖生物传感器，用于人体中的血糖、工业废水、培养液、发酵及饮料中糖分的测量。
全文摘要
本发明涉及含纳米银溶胶尤其是憎水纳米银溶胶的酶功能复合敏感膜及其制法和用途,将1×10
文档编号C12N11/00GK1297992SQ9912507
公开日2001年6月6日 申请日期1999年11月25日 优先权日1999年11月25日
发明者唐芳琼 申请人:中国科学院感光化学研究所