专利名称：制备l－精氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备L-精氨酸的棒状细菌及制备L-精氨酸的方法。作为肝功能促进剂、氨基酸输液、复合氨基酸制剂等的成分，L-精氨酸是一种有工业价值的氨基酸。
传统发酵法制备L-精氨酸是用下述细菌进行的棒状细菌的野生型菌株；对某些药物包括磺胺类药物、2-噻唑丙氨酸、α-氨基-β-羟基戊酸等有抗性的棒状细菌；除了对2-噻唑丙氨酸有抗性之外还对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表现出营养缺陷的棒状细菌(日本特许公开54-44096)；对酮丙二酸、氟丙二酸或一氟乙酸有抗性的棒状细菌(日本特许公开57-18989)；对精氨醇(argininol)有抗性的棒状细菌(日本特许公开62-24075)；对X胍有抗性的棒状细菌(X代表脂肪酸或脂族链的衍生物，日本特许公开2-186995)等。
另一方面，用重组DNA技术制备L-精氨酸的方法也有过披露。就是说。已经披露过用属于棒杆菌属或短杆菌属的微生物制备L-精氨酸的方法，所述微生物是经处理而具有包括载体DNA和含有得自属于埃希氏杆菌属微生物的乙酰基鸟氨酸去乙酰酶、N-乙酰基谷氨酸-γ-半醛脱氢酶、N-乙酰基谷氨二酰基激酶(glutamokinase)和精氨琥珀酸酶的基因的DNA片段的重组DNA的微生物(日本特许公告5-23750)；具有包括载体DNA和携带有关得自埃希氏细菌的N-乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶和精氨琥珀酸酶的合成的遗传信息，但不携带有关乙酰鸟氨酸去乙酰酶的合成的遗传信息的DNA片段，或者携带有关N-乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶、精氨琥珀酸酶和精氨琥珀酸合成酶的合成的遗传信息，但不携带有关乙酰鸟氨酸去乙酰酶的合成的遗传信息的DNA片段的重组DNA的棒状细菌(日本特许公告7-55155)；以及具有包括载体DNA和携带有下述酶的合成遗传信息的DNA片段的重组DNA的棒状细菌N-乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶、N-乙酰鸟氨酸-γ-氨基转移酶、鸟氨酸氨基甲酰转移酶、在大肠杆菌的精氨酸营养缺陷型N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏突变株中具有恢复对精氨酸的非营养缺陷的活性的酶和在大肠杆菌的精氨酸营养缺陷型乙酰鸟氨酸去乙酰酶缺乏突变株中具有恢复对精氨酸的非营养缺陷的活性的酶(日本特许公告7-28749)。
在诸如大肠杆菌的微生物中，L-精氨酸是由L-谷氨酸经N-乙酰谷氨酸、N-乙酰谷氨酰基磷酸、N-乙酰谷氨酸半醛、N-乙酰鸟氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸生物合成而得的(Sakanyan，V.等人，微生物学，142，99-108(1996))。产生这些中间体的反应是分别由N-乙酰谷氨酸合成酶、N-乙酰基谷氨酸激酶、N-乙酰基谷氨酰基磷酸还原酶、乙酰基鸟氨酸氨基转移酶、N-乙酰基鸟氨酸酶、鸟氨酸氨基甲酰转移酶和精氨琥珀酸合成酶催化的。最终由精氨琥珀酸酶催化的反应形成L-精氨酸。这些酶分别由argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG和argH基因编码。
在上述反应中，由N-乙酰鸟氨酸产生鸟氨酸的反应中，乙酰基是从N-乙酰基鸟氨酸中以乙酸的形式释放出来的。在棒状细菌中，这一反应与用谷氨酸作为受体产生N-乙酰基谷氨酸的反应连接，使乙酰基部分得以循环(乙酰基循环)。此反应由鸟氨酸乙酰基转移酶(argJ基因产物，见上)催化。
另外，当终产物L-精氨酸的反馈抑制对催化大肠杆菌中的第一反应的N-乙酰基谷氨酸合成酶起作用时，据说该抑制对催化象棒状细菌那样有乙酰基循环(见上)的细菌中的下一反应的N-乙酰基谷氨酸激酶也起作用。
如上所述，尽管大肠杆菌和棒状细菌的L-精氨酸的生物合成途径彼此相似，但它们的反应和调控不一定相同。
至于编码棒状细菌的精氨琥珀酸合成酶的argG的ORF，已经报道了谷氨酸棒杆菌的基因的ORF的核苷酸序列(基因库登记号AF 030520)，以及包括OFR两侧的旁侧区域的基因的核苷酸序列(基因库登记号AF 049897)。尽管报道了棒状细菌的argG受到抑制(见农业生物化学43，1899-1903(1979)，
图1)，但该报道不是基于酶活性测定的结果，而且精氨琥珀酸合成酶在棒状细菌中的酶活性本身的测量根本没有报道。此外，精氨琥珀酸合成酶基因的结构已经在大肠杆菌和酵母中阐明，特别是，参与argG表达抑制的阻抑物结合区也在大肠杆菌中详细地阐明了(基因，95，99-104，(1990))；分子生物学杂志，226，367-386(1992))。但棒状细菌中argG的表达控制的详细情况尚不清楚。此外，精氨琥珀酸合成酶在棒状细菌中L-精氨酸生物合成的控制中的作用也不清楚。
本发明的目的是增进棒状细菌的L-精氨酸生产能力，从而提供一种生产L-精氨酸的有效方法.
为了实现上述目的，本发明人进行了不懈的认真研究。结果发现棒状细菌生产L-精氨酸的能力可以通过给细菌导入一个编码精氨琥珀酸合成酶的基因来提高，尝试中注意到这样的事实在普通棒状细菌中的生产L-精氨酸菌培养物中瓜氨酸发生积累，由此完成本发明。
就是说，本发明提供一种具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌，其中细胞内精氨琥珀酸合成酶的活性被增强。
本发明还提供上述细菌，其精氨琥珀酸合成酶源自棒状细菌。
本发明进一步提供上述细菌，其细胞内精氨琥珀酸合成酶的活性被增强是通过提高编码细菌细胞中源自棒状细菌的精氨琥珀酸合成酶的基因的拷贝数，或修饰细菌细胞中的基因的表达调节序列使基因的表达被增强而实现的。
本发明还进一步提供一种制备L-精氨酸的方法，包括如下步骤在培养基中培养上述细菌以便产生和积累L-精氨酸，从培养基中收集L-精氨酸。
这里使用的术语“L-精氨酸生产能力”指的是本发明微生物在培养基中培养时积累L-精氨酸的能力。
本发明的棒状细菌可以用作L-精氨酸的生产菌，或L-精氨酸生产菌育种的起始原料。根据本发明可以用棒状细菌有效地制备L-精氨酸。
图1是argG基因和对每一个引物来说其旁侧序列的简图。
下面详细解释本发明。
(1)本发明的棒状细菌本发明的棒状细菌是有L-精氨酸生产能力、细胞内精氨琥珀酸合成酶能力增强的棒状细菌。在本发明中提到的“棒状细菌”包括迄今为止被归在短杆菌属但目前统一到棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，还包括属于与棒杆菌属紧密相关的短杆菌属的细菌。这样的棒状细菌的例子包括嗜乙酰乙酸棒杆菌醋谷棒杆菌Corynebacterium alkanolyticum美棒杆菌谷氨酸棒杆菌百合花棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melassecolaCorynebacterium thermoaminogenes力士棒杆菌Brevibactierium divaricatum(Corynebacterium glutamicum)黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)Brevibacterium immariophilum乳发酵短杆菌(Corynebacterium glutamicum)玫瑰色短杆菌解糖短杆菌生硫短杆菌白色短杆菌(Brevibacterium album)蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)嗜氨微杆菌对具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌没有特别的限制，只要它们有L-精氨酸生产能力，它们包括，例如，棒状细菌的野生型菌株；对某些药物包括磺胺类药物、2-噻唑丙氨酸、α-氨基-β-羟基戊酸等有抗性的棒状细菌；除了对2-噻唑丙氨酸有抗性之外还对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表现出营养缺陷的棒状细菌(日本特许公开54-44096)；对酮丙二酸、氟丙二酸或一氟乙酸有抗性的棒状细菌(日本特许公开57-18989)；对精氨醇(argininol)有抗性的棒状细菌(日本特许公开62-24075)；对X胍有抗性的棒状细菌(X代表脂肪酸或脂族链的衍生物，日本特许公开2-186995)等。
特别是例如下面的菌株黄色短杆菌AJ11169(BP-6892)谷氨酸棒杆菌AJ12092(FERM BP-6906)黄色短杆菌AJ11336(FERM BP-6893)黄色短杆菌AJ11345(FERM BP-6894)谷氨酸棒杆菌AJ12430(FERM BP-2228)AJ11169菌株和AJ12092菌株是日本特许公开54-44096中提到的对2-噻唑丙氨酸有抗性的菌株，AJ11336菌株是日本特许公告62-24075中提到的对精氨醇有抗性并对磺胺嘧啶有抗性的菌株，AJ11345菌株是日本特许公告62-24075中提到对精氨醇、2-噻唑丙氨酸，磺胺胍有抗性并对组氨酸有营养缺陷的菌株；AJ12430菌株是日本特许公开2-186995中提到的对辛基胍和2-噻唑丙氨酸有抗性的菌株。
AJ11169于1977年8月3日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-8566，1-3higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏号为FERM P-4161，并根据布达佩斯条约于1999年9月27日由原始保藏转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6892。
AJ12092于1983年9月29日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM P-7273，并根据布达佩斯条约于1999年10月1日由原始保藏转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6906。
AJ11336于1979年4月25日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM P-4939，并根据布达佩斯条约于1999年9月27日由原始保藏转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6893。
AJ11345于1979年4月25日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM P-4948，并根据布达佩斯条约于1999年9月27日由原始保藏转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6894。
AJ12430根据布达佩斯条约于1988年12月26日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-2228。
本发明的棒状细菌可以通过增强精氨琥珀酸合成酶在上述这种具有L-精氨酸生产能力棒状细菌细胞内的活性得到。上述精氨琥珀酸合成酶最好是源自棒状细菌的精氨琥珀酸合成酶。具体地说，细胞内精氨琥珀酸合成酶活性的增强可以通过提高编码精氨琥珀酸合成酶的基因(argG)的拷贝数来实现，例如源自棒状细菌的编码精氨琥珀酸合成酶的基因(下文中，源自棒状细菌的argG有时被简单地称为“argG”)，或者通过修饰表达调节序列使染色体上的基因表达增强来实现。细胞中argG的拷贝数可以通过下述方式提高在宿主细胞中导入重组DNA使棒状细菌的宿主转化，所述重组DNA是由含有argG的DNA片段与在棒状细菌中可自主复制的载体，优选多拷贝型载体连接而产生的。转化菌株细胞中的argG拷贝数提高的结果是精氨琥珀酸合成酶的活性被提高。
提高细胞中的argG拷贝数还可以通过在上述宿主菌株的染色体DNA中导入argG的多个拷贝来实现。为了在属于棒杆菌属的细菌的染色体DNA中导入argG基因的多个拷贝，用多个拷贝存在于染色体DNA上的序列作为靶进行同源重组。至于多个拷贝存在于染色体DNA上的序列，可以使用转座因子末端存在的重复DNA倒转重复。还有，如日本特许公开2-109985中所公开的，可以将argG基因结合到转座子中，使其转移从而将argG基因的多个拷贝导入到染色体DNA中。采用任一种方法均可提高转化菌株细胞中的argG基因的拷贝数，结果是精氨琥珀酸合成酶的活性被增强。
除了上述的基因增强，精氨琥珀酸合成酶活性的增强还可以这样实现修饰表达调节序列使染色体上的基因表达被加强。具体地说，表达调节序列，如染色体DNA上的argG启动子或质粒可以用较强的代替(参见日本特许公开1-215280)。在棒状细菌细胞中起作用的强启动子包括源自大肠杆菌的lac启动子、tac启动子、trp启动子等，(Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa和K.Sano，生物技术杂志，5，305-312(1987))。此外，源自属于棒杆菌属细菌的trp启动子也是优选的启动子(日本特许公开62-195294)。也可以使用通过将增强表达的突变导入到argG基因所特有的启动子中而得到的突变型启动子。这些启动子的替代增强了argG的表达，从而增强了精氨琥珀酸合成酶的活性。可以结合采用修饰表达调节序列和提高argG拷贝数。
由于棒状细菌的argG的核苷酸序列是已知的(ORF核苷酸序列基因库登记号AF030520，包括ORF的区及其旁侧区的核苷酸序列基因库登记号AF049897)，所以可以用在上述核苷酸序列基础上产生的引物进行PCR从棒状细菌染色体DNA分离棒状细菌的argG(聚合酶链式反应；参见White，T.J.等人，遗传学趋势，5，185(1989))。这样的引物的具体例子包括有SEQ ID NO5和SEQ IDNO6所示核苷酸序列的寡核苷酸。用作宿主的棒状细菌和作为argG来源的棒状细菌可以是相同的，或者可以属于不同的属、种或菌株。
用以克隆argG的载体可以是大肠杆菌细胞中的可自主复制的质粒，具体的例子包括，例如，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pSTV29等。也可以使用嗜菌体载体。棒状细菌和大肠杆菌中的可自主复制的穿梭载体是优选用于克隆argG或向棒状细菌中导入argG的载体。作为棒状细菌中可自主复制的质粒，可提到下面的质粒作为例子。
pAM330(参见日本特许公开58-67699)pHM1519(参见日本特许公开58-77895)
pAJ655(参见日本特许公开58-192900)pAJ611(参见相同文献)pAJ1844(参见相同文献)pCG1(参见日本特许公开57-134500)pCG2(参见日本特许公开58-35197)pCG4(参见日本特许公开57-183799)pCg11(参见相同文献)pHK4(参见日本特许公开5-7491)穿梭载体可以这样获得将得自棒状细菌细胞的可自主复制载体的复制型区插入到大肠杆菌细胞中的可自主复制载体中。
为了连接基因片段和载体来制备重组DNA，用对应于gltBD基因末端的限制性酶消化该载体。连接通常用T4DNA连接酶等连接酶来进行。
进行诸如制备基因组DNA、PCR、制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、设计用作引物的寡核苷酸的方法，在Sambrook，J.，Fritsche，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中有所描述。
可以用下面的方法进行转化，例如用氯化钙处理受体细胞从而提高DNA的通透性，如大肠杆菌K-12所报道的(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志.，53，159(1970))，或在增殖阶段由细胞制备感受态细胞来导入DNA，如枯草杆菌所报道的(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和young，F.E.，基因，1，153(1977))。或者，也可以用这样的方法，使DNA受体细胞处于易于结合重组DNA的原生质体或球质体状态，从而将重组DNA导入到DNA受体细胞中，对枯草杆菌、放线菌和酵母来说这是已知的(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.sci.USA，75，1929(1978))。也可以使用电脉冲法(参见日本特许公开2-207791)。
通过如上所述的提高微生物细胞中的精氨琥珀酸合成酶的活性，可以增强L-精氨酸的生物合成，从而可以提高L-精氨酸的产量。
此外，精氨琥珀酸合成酶的活性还可以这样提高，令棒状细菌经受诱变处理，选择精氨琥珀酸合成酶活性高的突变株，或者令包括argG基因的DNA经受诱变处理，选择编码高活性的精氨琥珀酸合成酶的突变基因，并将突变基因导入到棒状细菌中。作为DNA诱变处理的试剂，可以提到的是羟胺等。羟胺是诱导突变的诱变试剂，方式是将胞嘧啶转变为N4-羟基胞嘧啶来实现胸腺嘧啶代替胞嘧啶。当棒状细菌本身经受诱变处理时，可以用UV照射或人工诱变中常用的试剂进行诱变，如N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸。
除了精氨琥珀酸合成酶的活性，本发明棒状细菌中L-精氨酸生物合成途径中包括的其他酶的活性也可被增强。
(2)L-精氨酸的制备方法L-精氨酸可以通过在培养基中培养如上所述获得的棒状细菌，使L-精氨酸在培养基中产生并积累，再从培养基中收集L-精氨酸有效地制备。
培养基可以是利用棒状细菌发酵制备氨基酸所通常使用的已知培养基。就是说，它是根据需要而含有碳源、氮源、无机离子和其他有机成分的普通培养基。
作为碳源，可以使用糖，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解产物；醇，如甘油或山梨醇；或有机酸如富马酸、柠檬酸或琥珀酸。
作为氮源，可以使用无机铵盐，如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵；有机氮，如大豆水解物；氨气；或氨水。
最好含有适当量诸如维生素B1和L-高丝氨酸或酵母浸膏作为有机痕量物质。除了上述物质，如果需要也可少量加入磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
优选在需氧条件下培养1-7天。培养过程中，培养温度优选控制在24-37℃，PH值优选控制在5-9。无机或有机、酸性或碱性物质以及氨气等可以用于调节PH中。从发酵液中收集L-精氨酸通常是结合采用离子交换树脂法和其他已知方法。
下面参照实施例更具体地解释本发明。
实施例1(1)argG基因的克隆为了用PCR扩增黄色短杆菌的argG基因，测定基因中ORF上游和下游区的核苷酸序列。用基于已知的谷氨酸棒杆菌argG基因ORF的核苷酸序列(基因库AF 030520)制得的引物，和体外LA PCR克隆盒(TAKARA SHUZO CO.，LTD制造)，按照PCR克隆盒上所附的说明进行核苷酸测序。具体地说，分别将具有SEQ ID NO1和2所示的核苷酸序列(引物1和2)的寡核苷酸用于ORF的上游端，和有SEQ ID NO3和4所示的核苷酸序列(引物3和4)的寡核苷酸用于ORF下游端。用限制性酶EcoRI充分消化2247菌株(ATCC 14067)的染色体DNA，该菌株是一种黄色短杆菌的野生菌株，用引物2或3进行第一PCR，用引物1或4进行第二PCR，以便测定argG上游和下游区的核苷酸序列。
在如上所述测定的核苷酸序列的基础上，合成具有SEQ ID NO5和6(引物5和6)所示核苷酸序列的寡核苷酸，用黄色短杆菌2247菌株的染色体DNA作为模板进行PCR。PCR反应进行25个循环，每次由94℃30秒，55℃1秒和72℃2分钟和30秒组成。将所得的DNA片段克隆到克隆载体pSTV29(TAKARASHUZO CO.，LTD.制造)的多克隆点中的SmaI位点，制备pSTVargG。
将棒状细菌的可自主复制pHM1519质粒的复制区(日本特许公开5-7491)，该质粒是已经得到的(Miwa，K.等人，农业生物化学，48，2901-2903(1984))，导入到pSTVargG中。具体地说，用限制性酶BamHI和KpnI消化pHM1519得到含有复制区的基因片段，用TAKARA SHUZO CO.，LTD.生产的平端化试剂盒将所得片段平端化，并用SalI接头(TAKARA SHUZO CO.，LTD.制造)插入到pSTVargG的SalI位点制备pargG。
(2)将pargG导入棒状细菌将质粒pargG导入到黄色短杆菌AJ11169菌株、AJ11336菌株、AJ11345菌株、谷氨酸棒杆菌AJ12092菌株和AJ12430菌株中。
质粒的导入采用电脉冲法进行(日本特许公开2-207791)。在含有4μg/ml氯霉素的CM2G平板培养基上(在1L纯水中含有10g聚胨，10g酵母浸膏，5g葡萄糖，5gNaCl和15g琼脂，PH为7.2)，每个导入了pargG的菌株的转化株被选为对氯霉素有抗性的菌株。
(3)用导入pargG的菌株制备L-精氨酸上述转化株和AJ11169菌株、AJ12092菌株、AJ11336菌株、AJ11345菌株和AJ12430菌株分别平板接种在含有0.5g/dl葡萄糖、1g/dl聚胨、1g/dl酵母浸膏、0.5g/dlNaCl和5μg/l氯霉素的琼脂培养基上，在31.5℃下培养20小时。将一接种环所得的细菌细胞接种在含有4g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸铵、0.1g/dlKH2PO4、0.04g/dl MgSO4、0.001g/dl FeSO4、0.01g/dl MnSO4、5μg/dl维生素B1、5μg/dl生物素和大豆水解产物(以N的量计45mg/dl)的培养基中，在烧瓶中于31.5℃边振动边培养50小时。对11169菌株的培养不到120小时，或对其他菌株的培养不到48小时。用0.2N HCl将每个培养基稀释51倍，测量稀释后的培养基在620nm(OD620)的吸光度和所产生的L-精氨酸的量。结果列于表1。
测量结果证实AJ11169菌株、AJ12092菌株、AJ11336菌株、AJ11345菌株和AJ12430菌株的培养基中同时产生了瓜氨酸和鸟氨酸。另一方面，用pargG转化的那些菌株的培养基中的瓜氨酸和鸟氨酸被还原，提高了L-精氨酸的产率。所有菌株的培养基中的葡萄糖几乎完全被消耗掉了。
表1菌株 OD620精氨酸 瓜氨酸鸟氨酸(g/dl) (mg/dl) (mg/dl)111690.7020.38 8.1 3.311169/pargG 0.7100.39 0.8 2.5120920.5021.25 171.7 37.012092/pargG 0.5201.47 6.4 2.1113360.5310.71 122.6 22.611336/pargG 0.5400.86 8.7 2.3113450.6671.33 97.6 15.111345/pargG 0.6701.45 3.3 3.3124300.9690.52 5.4 0.112430/pargG 0.9450.53 0.7 0.0实施例2argG基因上游区的核苷酸序列的测定在argG基因ORF区核苷酸序列(基因库AF030520)的基础上克隆ORF的上游和下游区。使用引物1，2，3和4及体外LAPCR克隆盒(TAKARA SHUZO CO.，LTD.制造)克隆上游和下游区。
用限制性酶EcoRI充分消化黄色短杆菌2247菌株的染色体DNA，使用上述克隆盒用引物2或3进行第一PCR，用引物1或4进行第二PCR来测定argG的上游和下游区的核苷酸序列。
(2)启动子位点的确定用可商购的软件(GENETYX)从上述序列中搜索agrG基因的ORF上游类启动子样的序列。将突变导入到同源分数最高的位点(在第一个ATG的上游约120bp)，测定启动子的活性。
(3)向启动子序列中导入突变和突变型启动子活性的测定用用来导入突变的、具有SEQ ID NO9-13(引物9、引物10、引物11、引物12或引物13)和SEQ ID NO7(引物7)所示的核苷酸序列的引物向argG基因的ORF上游分数最高的位点导入不同的突变。用谷氨酸棒杆菌AJ12092菌株的染色体DNA作为模板进行第一PCR。用此PCR产物作3’端引物，用具有SEQID NO8(引物8)所示的核苷酸序列的引物作为5’引物，以相同的染色体DNA作为模板再进行PCR，获得导入了靶启动子区的不同突变的DNA片段。
然后，为了测定上述突变型启动子的活性，将这些DNA片段的每一个插入到启动子探针载体pNEOL的SmaI位点，使其与报道基因lacZ处于一个正确的顺序，以获得质粒pNEOL-1、pNEOL-2、pNEOL-3、pNEOL-4和pNEOL-7。另外，作为启动子活性的对照，类似地将用引物7和8进行PCR得到的DNA片段和作为模板的AJ12092菌株的染色体DNA插入到pNEOL的lacZ基因的上游区，构建一个质粒pNEOL-0。
将pNEOL-0、pNEOL-1、pNEOL-2、pNEOL-3、pNEOL-4和pNEOL-7分别导入到谷氨酸棒杆菌AJ12092菌株中。质粒的导入用电脉冲法(日本特许公开2-207791)进行。在含有4μg/ml氯霉素的CM2G平板培养基(在1L纯水中含有10g聚胨、10g酵母浸膏、5g葡萄糖、5gNaCl和15g琼脂，PH值为7.2)上选择对氯霉素有抗性的转化菌株。
将这些菌株平板接种在含有0.5g/dl葡萄糖、1g/dl聚胨、1g/dl酵母浸膏、0.5g/dl NaCl和5μg/l氯霉素的琼脂培养基上，在31.5℃下培养20小时。将一接种环所得的细菌细胞接种在含有3g/dl葡萄糖、1.5g/dl硫酸铵、0.1g/dl KH2PO4、0.04g/dl MgSO4、0.001g/dl FeSO4、0.01g/dl MnSO4、5μg/dl维生素B1、5μg/dl生物素和大豆水解产物(以N的量计45mg/dl)的培养基中，在31.5℃下培养18小时。测定所得细胞的β-半乳糖苷酶活性。
由表2所示的AJ12092/pNEOL-0的β-半乳糖苷酶活性测定值，发现插入到lacZ结构基因上游的DNA片段起到了启动子的作用。另外，与AJ12092/pNEOL-0相比，其他导入质粒的菌株表现出较高的β-半乳糖苷酶活性，这表明在这种启动子样的序列中导入突变促进了转录活性，如表2所示。在这些中，决定采用同源重组将pNEOL-3和pNEOL-7突变导入到L-精氨酸生产菌AJ12092菌株的染色体上的argG基因上游区的启动子样序列中。
表2相对活性(AJ12092/pNEOL-0＝1)AJ12092 ndAJ12092/pNEOL-0 1.0AJ12092/pNEOL-1 2.8AJ12092/pNEOL-2 2.7AJ12092/pNEOL-3 1.8AJ12092/pNEOL-4 0.8AJ12092/pNEOL-7 3.0(4)导入突变的质粒的构建将一个DNA片段插入到克隆载体pHSG398(TAKARA SHUZO CO.，LTD制造)的多克隆位点，构建一个质粒p0。该DNA片段具有含有argG基因编码区的5’序列的上游区、argG基因的启动子和argG基因的3’区，是用具有SEQ IDNO14和15(引物14和15)所示的核苷酸序列的引物和作为模板的AJ12092菌株的染色体DNA进行PCR获得的。然后将用限制性酶EcoRV和BspHI消化p0得到的DNA片段和用限制性酶EcoRV和BspHI消化pNEOL-3和pNEOL-7得到的DNA片段连接得到导入突变的质粒，突变为p3(得自用于导入突变的引物11的突变)和p7(得自用于导入突变的引物13的突变)。
argG基因及其相对于每个引物的旁侧序列的几何图示于图1。
(5)导入用来向L-精氨酸生产菌导入突变的质粒将上述的每种质粒导入到L-精氨酸生产菌—谷氨酸棒杆菌AJ12092菌株中。质粒导入采用电脉冲法(日本特许公开2-207791)进行。由于这些质粒在黄色短杆菌中不能自主复制，故只有这样的菌株可被选为对氯霉素有抗性的菌株，即其中每个质粒是通过同源重组整合到染色体中的菌株。在含有5μg/ml氯霉素的CM2G平板培养基(在1L纯水中含有10g聚胨、10g酵母浸膏、5g葡萄糖、5g NaCl和15g琼脂，PH值为7.2)上，导入了用来导入突变的质粒的菌株被选为对氯霉素有抗性的菌株。在经过另一同源重组而对氯霉素敏感的菌株中，选择其中argG基因的启动子区被所需突变序列代替的菌株。
结果得到了一个染色体上的argG基因启动子被p3序列代替的菌株(AJ12092-P3)，和一个染色体上的argG基因启动子被p7序列代替的菌株(AJ12092-P7)。
(6)启动子突变菌株的精氨琥珀酸合成酶(argG)活性对下述菌株测定argG活性上述的两种argG启动子突变株(AJ12092-P3和AJ12092-P7)及实施例1中得到的argG基因通过质粒扩增的谷氨酸棒杆菌(AJ12092/pargG)。将这些菌株平板接种在含有0.5g/dl葡萄糖、1g/dl聚胨、1g/dl酵母浸膏、0.5g/dl NaCl和5μg/l氯霉素的琼脂培养基上，在31.5℃下培养20小时。将一接种环所得的细菌细胞接种在含有3g/dl葡萄糖、1.5g/dl硫酸铵、0.1g/dlKH2PO4、0.04g/dl MgSO4、0.001g/dl FeSO4、0.01g/dl MnSO4、5μg/dl维生素B1、5μg/dl生物素和大豆水解产物(以N的量计45mg/dl)的培养基中，在31.5℃下培养18小时。按照以前报道过的方法(普通微生物学杂志(1990)，136，1177-1183)测定所得细菌细胞的argG活性。
上述两种argG启动子突变株和argG扩增株(AJ12092/pargG)的argG活性列于表3。如表3所示，通过向启动子中导入突变，与亲本菌株相比，AJ12092-P3中的argG活性提高了约两倍，AJ12092-P7中的活性提高约3倍。另外，AJ12092/pargG中的argG活性比亲本菌株的高约4.5倍。
表3相对活性(AJ12092＝1)AJ12092 1.0AJ12092-P32.1AJ12092-P72.9AJ12092/pargG 4.4(7)用启动子突变株制备L-精氨酸在烧瓶中培养argG启动子突变菌株。作为对照，按同样的方式培养亲本菌株AJ12092和argG扩增株AJ12092/pargG。将每个菌株接种到含有0.1g/dlKH2PO4、0.04g/dl MgSO4、0.001g/dl FeSO4、0.01g/dl MnSO4、5μg/dl维生素B1、5μg/dl生物素和大豆水解产物(以N的量计45mg/dl)的培养基中，平板接种在含有0.5g/dl葡萄糖、1g/dl聚胨、1g/dl酵母浸膏、0.5g/dl NaCl和5μg/l氯霉素的琼脂培养基上，在31.5℃下培养20小时。将一接种环所得的细菌细胞接种到20ml含有4g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸铵、0.1g/dl KH2PO4、0.04g/dl MgSO4、0.001g/dlFeSO4、0.01g/dl MnSO4、5μg/dl维生素B1、5μg/dl生物素和大豆水解产物(以N的量计45mg/dl)的培养基中，在31.5℃下在烧瓶中培养直至葡萄糖被完全消耗掉。用0.2N HCl将每种培养基稀释51倍，测量稀释后的培养基在620nm(OD620)的吸光度和所产生的L-精氨酸的量(浓度，g/dl)。结果列于表4。
表4OD620精氨酸(g/dl)AJ12092 0.502 1.25AJ12092-P3 0.510 1.47AJ12092-P7 0.514 1.43
序列表<110>Ajinomoto CO.，Ltd<120>制备L-精氨酸的方法<130>OP913<141>1999-<150>JP10-312301<151>1998-11-02<150>JP11-271204<151>1999-09-24<160>15<i70>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1agaccgccgg agtatgcaag aacgatgcgg30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2gactcacca tcaatcatct tcttcaggta30<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3accttcgacc agaccctggc taagggcttt 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>4gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac 30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5gcgatgacac cgtttttgtt ctcgc 25<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6ggcgacatcc ttgcccagat gatca 25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>7gacttcacca tcaatcatct tcttc 25<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>8gccaggtaca actgtctgaa ttg 23<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>9gttaatcgct tgccaatgca ggcaggtaag gtataacccg 40<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>10gttaatcgct tgctaatgca ggcaggtaag gtataacccg 40<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>11gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataacccg 40<210>12<211>40<212>DHA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>12gttaatcgct tgttaatgca ggcaggtaag gtataatccg 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>13gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataatccg 40<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>14gggttccagc ctcgtgcgga attcgtggag 30<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>15gcgttaccca gagctggatc ctcgg 2权利要求
1.一种具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌，其中，细胞内的精氨琥珀酸合成酶的活性被增强。
2.权利要求1的细菌，其中，精氨琥珀酸合成酶源自棒状细菌。
3.权利要求1或2的细菌，其中，细胞内精氨琥珀酸合成酶的活性的增强是通过提高编码细菌细胞中源自棒状细菌的精氨琥珀酸合成酶的基因的拷贝数，或修饰细菌细胞中的基因的表达调节序列使基因的表达被增强而实现的。
4.一种制备L-精氨酸的方法，包括如下步骤在培养基中培养权利要求1-3任一项的细菌以便产生和积累L-精氨酸，从培养基中收集L-精氨酸。
全文摘要
本发明公开的是一种具有L－精氨酸生产能力的棒状细菌,其细胞内精氨琥珀酸合成酶的活性被增强,其中,细胞内精氨琥珀酸合成酶的活性被增强是通过,例如,提高编码细菌细胞中源自棒状细菌的精氨琥珀酸合成酶的基因的拷贝数,或修饰细菌细胞中的基因的表达调节序列使基因的表达被增强来实现。L－精氨酸的制备是通过在培养基中培养具有L－精氨酸生产能力的细菌使L－精氨酸产生和积累,再从培养基中收集L－精氨酸。本发明提供了一种L－精氨酸生产能力提高了的棒状细菌和一种制备L－精氨酸的有效方法。
文档编号C12N9/00GK1258736SQ9912515
公开日2000年7月5日 申请日期1999年11月2日 优先权日1998年11月2日
发明者菅美贵子, 桑原阳子, 桥口贤一, 伊藤久生, 中松亘, 仓桥修 申请人:味之素株式会社