专利名称：基于核酸地址编码的高通量检测方法及生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高通量的检测方法及相应的生物检测芯片，特别涉及基于核酸地址编码的高通量检测方法及生物芯片。
背景技术：
生物芯片技术是在20世纪90年代中期，伴随人类基因组计划发展起来的一类生物分析检测技术，现已广泛应用于基因测序、基因表达分析、基因突变和多态性检测、食品中微生物的检测、临床医学等方面，并已成为科学界研究的热点之一(卢卫红，付力，郑琦， 等.生物芯片技术的应用与展望[J].传感器与微系统，2006，25(6) :1-4)。生物芯片根据所检测分析的生物组分不同分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片(梅林，宋世远，查忠勇，等.生物芯片发展现状和未来[J].激光杂志，2008， 29(2) :16-18)。根据其工作原理不同分为微阵列芯片、毛细管电泳芯片、免疫芯片、质谱分析芯片、液态芯片等(范金坪.生物芯片技术及其应用研究[J].中国医学物理学杂志， 2009,26(2) :1115-1117)。人类最早开发的生物芯片是微阵列式基因芯片，由美国的Afymetrix公司最早研制成功。基因芯片技术是将大量特定的寡核苷酸(cDNA)片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上(无机或有机支持物)，然后与待测的标记样品分子按碱基配对原理进行杂交，通过检测探针分子的杂交信号强度获取样品分子的表达数量和序列信息。基因芯片高通量、集约化和低成本的特点，目前已广泛应用于科研、生物制药、医学诊断等方面。但是基因芯片不能完全真实地反映细胞中蛋白质代谢及其相互作用的情况。蛋白芯片就是伴随着这种需要产生的，成为研究蛋白与蛋白、蛋白与配体、抗体与抗原等反应的重要工具。蛋白质芯片是通过微加工和微电子技术对固体载体表面进行处理，使抗体或抗原、酶、受体等固定在载体表面，成为捕获抗原或抗体、底物、配体等特异生物分子的微阵列。由于蛋白直接固定在固相载体上，使蛋白质天然构象、特定的生物活性难以维持，且由于载体表面空间位阻作用(Lee，Y. S.，Mrksich, M.，Trends Biotechnol. 2002，20， 14-18.)，使芯片上蛋白与样品中待检物反应效率低下，严重影响着蛋白芯片的灵敏度、稳定性和重复性等问题。目前多肿瘤标志物蛋白芯片C12，也由于蛋白芯片的上述不足出现了一些问题。针对上述蛋白芯片的问题，有学者对核酸地址编码，核酸与抗体偶联，检测样品 Φ Wifi J^ii^f WtJ/ν ￠^ (Jin Kiat Ng, Parayil Kumaran Ajikumar, Yew Chung Tang, et. Electrophoresis. 2007, 28， 4638-4644)。为解决上述蛋白芯片的不足，Luminex公司利用编码荧光微球标记蛋白，使整个反应在液相中进行，并先后推出了 Luminex 100、Luminex 200和Flexmap 3D液相芯片检测平台。液相芯片集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术。它的最大特点是通量大、灵活性好。但是由于编码微球荧光的限制，Iuminex技术使用2种荧光物质编码了 100种微球(Sun K，Wang Q，Huang XH, et2/5页
.Acta Pharm Sin, 2007, 28 (12) :2 011-2 018. )，Flexmap 3D 技术使用 3 种荧光物质也只能编码500种微球。同时由于编码微球荧光易漂白的影响，是编码微球不稳定，影响检测结果。近年来，有学者采用量子点编码微球(Gao，X. H. and S. Μ. Nie (2004). Analytical Chemistry. 76(8): 24064410)，但由于量子点发射荧光范围有限，编码技术不成熟等问
题，也一直没有得到广泛应用。现阶段，缺乏一种高效地、高通量的蛋白检测方法和相应的生物芯片，这大大限制了蛋白质组学的研究进展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量的检测方法。本发明的另一个目的在于提供一种高通量的生物检测芯片。本发明所采取的技术方案是
基于核酸地址编码的高通量检测方法，包括如下步骤
1)将第一单链核酸排列固定在固相载体上；
2)将可与待测物特异性反应的检测物偶联到第二单链核酸上，得到检测体，其中，第二单链核酸与第一核酸单链互补；
3)将检测体与待测物混合反应，之后加入标记的二抗，继续反应，得到检测体-待测物-二抗复合物；将上述复合物与固相载体上固定的第一单链核酸的杂交，洗涤去除未反杂交的反应物；或将检测体与待检测物混合反应后，与固相载体上固定的第一单链核酸杂交，洗涤；然后再加入标记的二抗，洗涤去除未反应的反应物；
4)检测计算固相载体上各处的信号强度，确定待测物的量和种类。优选的，可与待测物特异性反应的检测物通过载体或直接偶联到第二单链核酸上。可与待测物特异性反应的检测物为抗体或多肽。标记的二抗为荧光标记的二抗。基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，包括固定有第一单链核酸的固相载体，偶联有第二单链核酸的可与待测物特异性反应的检测物以及标记的二抗，其中，第一单链核酸和第二单链核酸互补。可与待测物特异性反应的检测物通过偶联载体或直接与第二单链核酸。可与待测物特异性反应的检测物为抗体或多肽。标记的二抗为荧光标记的二抗。单链核酸的长度为5 100个碱基，优选为10 30个碱基。优选的，第一单链核酸和第二单链核酸中的核酸是经过氨基和/或巯基修饰的核酸。本发明的有益效果是
本发明的检测方法操作简单，各组分与待测物的反应充分，不受或极少受空间位阻的影响，检测结果可靠、快速。通过简单计算固相载体上不同位点的发光强度，可方便地确定各种待测物的浓度，具有高通量、高精度、稳定性好等优点。通过配合使用不同标记的二抗， 可进一步提高其检测种类，特别适用于蛋白组学的研究。
4
本发明中使用的二抗，特异性可以稍差，甚至可以与多种待测物结合，大大降低了二抗的设计工作量，有利于进一步降低检测成本。同时，二抗中使用的标记也可以是相同的，这样可以在同一条件下激发得到信号，避免了切换信号激发源对样品的损伤，可更为准确地确定其检测结果。
图1是本发明方法的原理图。
具体实施例方式基于核酸地址编码的高通量检测方法，包括如下步骤
1)将第一单链核酸排列固定在固相载体上；
2)将可与待测物特异性反应的检测物偶联到第二单链核酸上，得到检测体，其中，第二单链核酸与第一核酸单链互补；
3)将检测体与待测物混合反应，之后加入标记的二抗，继续反应，得到检测体-待测物-二抗复合物；将上述复合物与固相载体上固定的第一单链核酸的杂交，洗涤去除未反杂交的反应物；或将检测体与待检测物混合反应后，与固相载体上固定的第一单链核酸杂交，洗涤；然后再加入标记的二抗，洗涤去除未反应的反应物；
4)检测计算固相载体上各处的信号强度，确定待测物的量和种类。本发明方法的检测原理如图1所示。如果待测液中含有可与检测物特异性反应的待测物，两者发生特异性反应，之后加入标记的二抗，二抗与待测物的反应偶联，利用检测物上偶联的特异性核酸序列，将检测体-待测物-二抗复合物定位在固相载体的特定区域。通过检测不同位置的信号强度，即可计算出待测物的种类和含量。未反应的检测体，无法与标记的二抗反应，检测时也就没有信号产生，通过检测信号的有无，可以方便的判断待测物是否存在。同时，在检测范围内，信号强度与待测物的浓度成正相关，通过检测信号的强度，也可以方便地确定待测物量的多少。本发明方法特别适用于疾病的检测和蛋白分析。优选的，可与待测物特异性反应的检测物通过载体或直接偶联到第二单链核酸上。偶联载体可以是磁珠、高分子微球等。可与待测物特异性反应的检测物为抗体或多肽。抗体和多肽可以进行一定的常规修饰以提高其稳定性和特异性。当然，检测物还可以是其他蛋白。标记的二抗为荧光标记的二抗。这主要是出于检测方便的需要。当然，也可以使用其他标记物标记二抗，配以相应的检测方法，同样可以获得理想的检测结果。通过使用不同的标记物，可以特异性的检测出不同的信号，进一步提高检测芯片的通量。基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，包括固定有第一单链核酸的固相载体，偶联有第二单链核酸的可与待测物特异性反应的检测物以及标记的二抗，其中，第一单链核酸和第二单链核酸互补。固相载体可以是玻片、硅片金属片、尼龙膜等。可与待测物特异性反应的检测物通过偶联载体或直接与第二单链核酸。可与待测物特异性反应的检测物为抗体或多肽。抗体和多肽可以进行一定的常规修饰以提高其稳定性和特异性。当然，检测物还可以是其他蛋白。
标记的二抗为荧光标记的二抗。这主要是出于检测方便的需要。当然，也可以使用其他标记物标记二抗，配以相应的检测方法，同样可以获得理想的检测结果。单链核酸的长度为5 100个碱基，优选为10 30个碱基。这一长度范围内的碱基合成较为容易，理论上10个碱基就可以编码41°个不同的序列，完全可以满足大通量蛋白检测分析的需要。当然，为保证检测的准确性，核酸序列之间要存在足够的差异，避免核酸错误配对影响结果，亦可避免不同检测物上连接核酸互相配对，导致结果失真。第一单链核酸和第二单链核酸中的核酸是经过氨基和/或巯基修饰的核酸，特别是其末端使用氨基和/或巯基修饰，这样核酸可以更好地与抗体、玻片偶联。下面结合实施例，进一步说明本发明。以癌胚抗原(CEA)检测为例，构建基于核酸地址编码的生物芯片检测系统，并用于 CEA的检测。探针的设计及合成
针对CEA的检测设计了十条点样探针，如下
Bl5-NH2-ATTGATGAGTATATTGTGTAGTAA(SEQID NO 1)B25-NE-GTTAGTTATTGAGAAGTGTATATA(SEQID NO2)B35-NE-ATTGGATTATGAGATTATGATTGA(SEQID NO3)B45-NE-GTAGATAGTATAGTTGTAATGTTA(SEQID NO4)B55-NE-TGATATAGATAGTTAGATAGATAG(SEQID NO5)P:5，-NH2-ATGATGATGTATTGTAGTTATGAA(SEQID NO 6)N:5，-NH2-GTTAGTTAGATTATTGTTAGTTAG(SEQID NO 7)Sl5-NE-ATGAGTATGTTATTAGTGTATGTA(SEQID NO8)S25-NE-ATATGTTGTTGAGTTGATAGTATA(SEQID NO9)S35-NE-ATAGTGTATGTAGATTATGAGATT(SEQID NO10)
其中B1-B5作为标准曲线，P为阳性对照，N为阴性对照，S1-S3为不同血清样品。芯片的设计及点样
玻片醛基化玻片(购自博奥生物科技有限公司) 步骤
1)将上述十个氨基修饰的核酸(地址核酸)，用4XSSC溶解，浓度为200nM ；
2)取等量体积的核酸和DMSO混勻后，采用点样仪，按照预先设计的排列顺序，在上述醛基玻片上开始点样；
3)点好样后，于37°C杂交过夜，然后用4XSSC清洗，去除没有结合上的核酸。探针与抗体的偶联
与抗体偶联的探针与上述十个探针的互补序列，5’端修饰SH，由上海生物工程有限公司合成。1) 取 1 mg/ml CEA 单克隆抗体(3C6，HyiTest Ltd. ) 50 μ 1，加入 10 mg/ml SMCC-Sulfo 10 μ 1，反应 30 min ；
2)100 KDa超滤器过滤；
3)取出纯化活化好的抗体，与1 OD巯基修饰的DNA充分混合反应30 min ；
4)加入少量巯基乙醇淬灭反应30 min ；5) IOOKDa超滤器过滤纯化，收集备用。量子点与抗体的偶联
1)将2 nmol量子点加入50 μ 1浓度为50 mM的EDC水溶液中；
2)加入适量抗体分子(3C1，HyTest Ltd.)，抗体与量子点摩尔比为5 :1 10 :1，室温下温和震荡2小时，结束反应；
3)100 KDa超滤器过滤纯化，收集备用。CEA的检测及结果判断
1)DNA与蛋白偶联的复合物，与分别与不同浓度的CEA抗原标准品(标准曲线)，病人血清样品(样品)，PBS (阴性对照)反应和，加入量子点标记的二抗(3C1，HyTest Ltd.)，形成核酸-蛋白-荧光复合物，再与芯片上的地址核酸特异性杂交，洗涤；
2)其中，阳性对照采用DNA与蛋白质偶联的复合物，与量子点标记的羊抗鼠反应后， 与芯片上的地址核酸杂交，洗涤。检测结果判断
利用荧光扫描仪，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度，制作标准曲线，分析计算各种待检测物质的含量等信息，由此达到测定各种待检测物质的目的。阳性对照有荧光，阴性对照无荧光，则芯片有效；若不是，则芯片无效，需重新实验。如果样品中有待检测物质，相对应的点有荧光，如果样品中没有待检测物质，则相对应的点没有荧光。通过标准CEA抗原浓度绘制标准曲线，来分析计算样品中的待检测物
质含量。
权利要求
1.基于核酸地址编码的高通量检测方法，包括如下步骤1)将第一单链核酸排列固定在固相载体上；2)将可与待测物特异性反应的检测物偶联到第二单链核酸上，得到检测体，其中，第二单链核酸与第一核酸单链互补；3)将检测体与待测物混合反应，之后加入标记的二抗，继续反应，得到检测体-待测物-二抗复合物；将上述复合物与固相载体上固定的第一单链核酸的杂交，洗涤去除未反杂交的反应物；或将检测体与待检测物混合反应后，与固相载体上固定的第一单链核酸杂交，洗涤；然后再加入标记的二抗，洗涤去除未反应的反应物；4)检测计算固相载体上各处的信号强度，确定待测物的量和种类。
2.根据权利要求1所述的基于核酸地址编码的高通量检测方法，其特征在于可与待测物特异性反应的检测物通过载体或直接偶联到第二单链核酸上。
3.根据权利要求1或2所述的基于核酸地址编码的高通量检测方法，其特征在于可与待测物特异性反应的检测物为抗体、多肽、配体、受体。
4.根据权利要求1所述的基于核酸地址编码的高通量检测方法，其特征在于标记的二抗为荧光标记的二抗。
5.基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，包括固定有第一单链核酸的固相载体，偶联有第二单链核酸的可与待测物特异性反应的检测物以及标记的二抗，其中，第一单链核酸和第二单链核酸互补。
6.根据权利要求5所述的基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，其特征在于可与待测物特异性反应的检测物通过偶联载体或直接与第二单链核酸。
7.根据权利要求5所述的基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，其特征在于可与待测物特异性反应的检测物为抗体或多肽。
8.根据权利要求5所述的基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，其特征在于标记的二抗为荧光标记的二抗。
9.根据权利要求5所述的基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，其特征在于单链核酸的长度为5 100个碱基。
10.根据权利要求5所述的基于核酸地址编码的高通量生物检测芯片，其特征在于第一单链核酸和第二单链核酸中的核酸是经过氨基和/或巯基修饰的核酸。
全文摘要
本发明公开了基于核酸地址编码的高通量检测方法和检测芯片。本发明巧妙利用了核酸特异性互补杂交的原理，将不同序列的核酸定位在芯片的不同区域；互补核酸与蛋白的偶联物，由于核酸间的相互作用也定位在芯片相应的位置上。从而克服了传统蛋白芯片的缺点与不足，使整个反应在液相环境下进行；同时由于基因编码的无限性，克服了液相芯片中微球编码的局限性。因此，本发明综合了固相芯片和液相芯片的优点，使整个检测反应更加准确、高通量。
文档编号G01N33/543GK102435730SQ20111028189
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者龚桂香 申请人:江阴天瑞生物科技有限公司