专利名称：液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法
技术领域：
本发明属于一种液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法。
背景技术：
三聚氰胺作为化工原料可用于塑料、涂料、粘合剂、食品包装材料的生产，资料表明，三聚氰胺可能从环境、食品包装袋等途径进入到食品中，其含量很低。三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加剂，是禁止人为添加到饲料和食品中的，国家标准[1]中三聚氰胺的限量为1 mg/kg。近年来，人为添加三聚氰胺导致的严重案例时有发生[2_4]，因此对三聚氰胺的快速有效的检测方法是十分必要的。目前国际上通常采用凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白质的含量，即以含氮量的多少乘以6. 25得出蛋白质含量。三聚氰胺并没有实际作用，更没有任何营养价值。牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因为其能冒充蛋白质。每1 kg牛奶中添加0.1 g三聚氰胺，就能提高0.4 %的蛋白质含量。食品都要按规定检测蛋白质含量，要是蛋白质含量不够，说明牛奶兑水兑得太多，或者说明奶粉中有太多别的粉，用全氮测定法测蛋白质含量时根本不会区分这种伪蛋白氮。三聚氰胺进入体内后似乎不能被代谢，而是从尿液中原样排出。但是，科学家研究发现动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，如膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。近年来，宠物饲料中发现三聚氰胺并导致宠物死亡的案例时有发生。2007年3 月，美国发生宠物食品导致宠物死亡的事件，美国食品药品管理局(FDA)在随后的调查中发现，宠物食品所用的小麦鼓蛋白添加物中含有较高浓度的三聚氰胺。同时，该物质也可能通过食物链影响人体的健康，前不久我国发生的“三鹿结石奶粉事件”，从三鹿集团的婴幼儿配方奶粉中发现高含量的有毒物质三聚氰胺，到全国阶段性查出22家婴幼儿配方奶粉生产企业的69批次产品检出了含量不同的三聚氰胺，令人触目惊心！
目前三聚氰胺在食品中的残留检测分析报道较少，主要有气质联用(GC-MS)法、超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱-二极管阵列法、 高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-四极杆质谱联用、固相萃取与高效液相色谱联用、液相色谱串联质谱法(LC-MS/ MS)等。气质[7_9]法选择性好，但是其前处理过于复杂，并且需要较长的分析时间。无法适应需处理大量样品的场合。高效液相色谱法相比气质联用法则相对简便，快速，许多研究表明使用反相柱如C18，C18混合柱等可以有效地分析三聚氰胺，但由于柱分离及检测器的局限，易产生假阳性的结果。另外，由于检测器的灵敏度限制，必须对样品使用萃取柱进行富集处理，提高了处理的难度及成本。液相色谱-质谱联用法[14_18]，目前主要的研究大都放在液相色谱串联质谱法上， 在具备了液相相对简易的提取方法后，通过使用质谱检测提高了选择性和灵敏度。经过了许多研究者的演化，目前最理想的分析条件是样品经萃取柱净化，超高效液相色谱分离，最终采用电喷雾串联四极杆质谱进行检测。结果表明，当样品中三聚氰胺的含量范围为10 5 000 μ g/kg时，线性关系良好(r>0. 99)。在10 100 μ g/kg的添加水平范围内的平均回收率为83% 94%，相对标准偏差为4. 12% 6. 15%。该方法的检出限为10 μ g/kg。并且高效液相色谱-四极杆质谱联用法可以在定量的同时对样品进行定性，因此准确度高， 误判的可能性小。最终，国家标准GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[1] 中包含中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法 (LC-MS/MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)。定量限分别为2 mg/kg、0. 01 mg/kg、0. 05 mg/kg0
发明内容
本发明的目的是提供一种不经过萃取柱、能够快速测定乳与乳制品中三聚氰胺的液相色谱串联质谱的方法。本发明的目的是这样实现的，所述的液相色谱串联质谱(以下简称LC-MS/MS)快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法，具体步骤为
在待测的乳或乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，使用正向色谱柱，用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相反相分离三聚氰胺，再串联质谱MRM定性、定量分析乳或乳制品中三聚氰胺。所述的乙腈提取的提取剂优选体积比是1:9的水乙腈的混合液。所述的色谱柱以HELIC模式使用；流动相4 mmol·!/1乙酸胺水溶液和乙腈，其中乙酸胺水溶液与乙腈的体积比为1:9 ；流速0. 4 mL · HiirT1 ；柱温40°C ；进样量2 μ L ；在此条件下，三聚氰胺及15Ν3内标物的保留时间为1. 200 min ；
质谱条件是电离方式为电喷雾离子化源(ESI)，正离子模式；离子喷雾电压4000 V ；雾化气(GS1，N2)50 psi ；干燥气(GS1，N2)流速11 L.min—1，温度350°C ；碰撞气氮气；扫描模式多反应监测MRM0在标准品的乳粉基质实验中，三聚氰胺选用在34 ev的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在14 ev的碰撞能量下荷质比为m/z 85的子离子为辅助定性离子。在15N3内标物实验中，三聚氰胺选用在四ev的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在17 ev的碰撞能量下荷质比为m/z 85的子离子为辅助定性离子。本发明乳制品中加入内标，由乙腈提取三聚氰胺，不经过萃取柱，以液相色谱串联质谱MRM模式定性、定量分析。一批次约40个样品的前处理时间只需一小时。结果在本实验条件下，加标回收率在95. 0%-103. 3%之间，相对标准偏差5. 5%-7. 6%(n = 5)。定性、 定量检出限分别为0.02 ng-mr1^. 20 ng·!!^1，较国标方法的灵敏度高。该方法已用于乳粉的日常监测。本发明的检测方法的主要技术内容及基本原理
①以乙腈来提取三聚氰胺，不经过固相萃取小柱，前处理时间缩短，每个样品处理时间不超过45分钟；
②不使用固相萃取小柱，可以节省大量的资金；
③高样品通量，每批40个在一小时能处理完成；④使用以液相色谱串联质谱检测，能同时进行定性、定量分析，提高了灵敏度，使检测限达到 0.20 ng.mL-1，能达到国标要求的 0.01 mg.kg—1 (10 ng.mL—1)；
⑤使用正向色谱柱反相分离三聚氰胺，可以不使用离子对试剂，仅用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相，同反相柱相比，具有更好地分离度、分辨率和灵敏度。经过三聚事件到现在，人为添加三聚的行为已经被基本防治，在多数样品中，三聚氰胺的主要来源变为从运输，贮存过程中与包装材料粘附产生的吸附作用，还有因后期加工而产生的富集作用，因而对乳制品中三聚氰胺的分析，已经进入到了痕量分析阶段， 另外，对于质谱来说，因为其灵敏度很高，过高浓度的样品反而有可能引起信号过载，遇到三聚氰胺含量过高的样品还可能造成仪器损伤等严重后果，国标法中使用SPE小柱进行净化，最终定容体积为1 mL，本文所述快速方法最终体积为25 mL，所用曲线线性范围为 0. 25ng*mr1-5. 00 ngmL—1，乘以25倍的稀释差距后为6. 25 mg/kg-125 mg/kg，已经完全达到并且满足了国标要求。在提高灵敏度的同时，降低了样品过载的可能。同国标法对比，该法具有灵敏、准确、简便、快速等特点。本发明优点为本发明的研究了乳与乳制品中三聚氰胺含量的快速检测法，简化了前处理操作，并采用高效液相色谱-串联质谱技术，检验结果准确、灵敏、快速。
图1为本发明的三聚氰胺[M+H]+的二级全扫描质谱图。图2A为本发明的取流动相1. 0 mL，进样2 μ L作空白图谱，得色谱图。图2Β为本发明的取一定浓度(0.50 ngmL-1)的三聚氰胺对照品溶液1.0 mL，进样 10 μ L作对照图谱。图2C为本发明的取空白乳粉溶液(0.00 ng^LlLO mL，进样2 μ L作样品图谱，
得色谱图。图2D为本发明的取空白乳粉+三聚氰胺对照品(0.20 ng*!!!!/1)溶液1. 0 mL，进样 2 μ L作样品图谱。图3为本发明的LC-MS/MS测定三聚氰胺的色谱图，样品浓度0. 0380 ng-πιΓ1测
定性限。图4本发明的LC-MS/MS测定三聚氰胺的色谱图，样品浓度0. 2305 ngmL—1，测定量限。图5-1为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺定量子离子 127. 1 — 68色谱峰。图5-2为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺定性子离子 127. 1 — 85与定量子离子127. 1 — 68的重叠色谱峰。图5-3为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺三个离子的总响应量。图5-4为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺内标定量子离子130. 1 — 87色谱峰。图5-5为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺内标定性子离子130. 1 — 87与定量子离子130. 1 — 69的重叠色谱峰。
图5-6为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺内标三个离子的总响应量。图6为本发明的LC-MS/MS测定三聚氰胺的校正曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明 1仪器
高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(Agilent 1200-6410 Triple Quad LC-MS ；安捷伦公司)；包括G1322A在线脱气机，G1312B 二元梯度泵，G1329B自动进样器，G1316B柱温箱，ESI电喷雾离子源；MassHunteri 0工作站软件。超声波清洗器。2 试剂
三聚氰胺标准品、三聚氰胺内标15N3，上海安谱公司产品。乙腈为默克公司色谱纯；乙酸铵为CNW公司色谱纯。3分析方法 3. 1 LC条件
色谱柱Zorbax RX-SIL, 2. 1 X 50mm, 1.8 μ m，使用时转为 HELIC 模式。流动相4 mmol-Γ1乙酸胺水溶液乙腈(体积比为1:9)；流速0. ^iLmirT1 ；柱温40°C ；进样量2 μ L0在此条件下，三聚氰胺及15Ν3内标物的保留时间约为1. 200 min。3. 2 MS/MS 条件
电离方式电喷雾离子化源(ESI)，正离子模式；离子喷雾电压4000 V;雾化气 (GS1，N2)50 psi ；干燥气(GS1，N2)流速11 L · mirT1，温度350°C ；碰撞气氮气；扫描模式多反应监测MRM，参数见表1。表1是三聚氰胺内标法LC-ESI-MS/MS质量条件参数
权利要求
1.一种液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法，其特征在于在待测的乳或乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，使用正向色谱柱，用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相反相分离三聚氰胺，再串联质谱MRM定性、定量分析乳或乳制品中三聚氰胺。
2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法，其特征在于所述的色谱柱以HELIC模式使用；流动相4 mmol-L-1乙酸胺水溶液和乙腈，其中乙酸胺水溶液与乙腈的体积比为1:9 ；流速0. 4 mL · HiirT1 ；柱温40°C ；进样量2 μ L ；在此条件下，三聚氰胺及15Ν3内标物的保留时间为1. 200 min ；质谱条件是电离方式为电喷雾离子化源(ESI)，正离子模式；离子喷雾电压4000 V ；雾化气(GS1，N2)50 psi ；干燥气(GS1，N2)流速11 L .mirT1,温度350°C ；碰撞气氮气；扫描模式多反应监测MRM0
3.权利要求1或2所述的液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法的制备方法，其特征在于标准品的乳粉基质实验中，三聚氰胺选用在34 ev的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在14 ev的碰撞能量下荷质比为m/z 85的子离子为辅助定性离子。
4.权利要求1或2所述的液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法的制备方法，其特征在于15N3内标物实验中，三聚氰胺选用在四ev的碰撞能量下荷质比为 m/z 68的子离子为定量离子，在17 ev的碰撞能量下荷质比为m/z 85的子离子为辅助定性离子。
5.权利要求1或2所述的液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法的制备方法，其特征在于1)称取1 g的乳粉样品至50 mL的离心管中；2)加入250 ng-mL"1 的三聚氰胺内标液100 yL，加入25 mL的水乙腈体积比为1:9的液体；3)涡流震荡2 min，超声30 min，不时摇动；4)取出，经10000 r/min离心4 min ;5)离心上清液经0.22 μ m滤膜过滤。
全文摘要
本发明公开一种液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法，在待测的乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，使用正相色谱柱，用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相反相分离三聚氰胺，再串联质谱MRM定性、定量分析乳与乳制品中三聚氰胺。国标法中使用SPE小柱进行净化，最终定容体积为1mL，本发明所述快速方法最终体积为25mL，所用曲线线性范围为0.25ng mL-1—5.00ng mL-1，乘以25倍的稀释差距后为6.25mg/kg—125mg/kg，已经完全达到并且满足了国标要求。在提高灵敏度的同时，降低了样品过载的可能。
文档编号G01N30/88GK102435699SQ20111028239
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者林玉宙, 陈光耀 申请人:明一(福建)婴幼儿营养品有限公司