专利名称：一种用于对硫磷快速检测的直接包被elisa方法
技术领域：
本发明涉及一种用于对硫磷快速检测的ELISA方法，特别涉及直接包被ELISA检测方法，属于检验技术领域，建立的直接包被ELISA检测方法可以用于研制对硫磷免疫速测试剂盒。
背景技术：
对硫磷(0，O-二乙基-0-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯)为浅黄色液体，沸点113°C /6.7Pa，熔点6°C，易溶于大多数有机溶剂，在水中溶解度约为24ppm。在中性及弱酸性介质中比较稳定，但在碱性溶液中很快水解。对硫磷是广谱高毒的有机磷酸酯类杀虫、杀螨剂，具有强烈的触杀与胃毒作用并有一定的熏蒸作用。对硫磷对人畜的毒性很高，中毒事件常有发生，且在食品和蔬菜中的残留量超标情况较多。对硫磷对人类的毒副作用主要表现为抑制胆碱酯酶活性，引起慢性中毒、迟发性神经毒性问题，引起神经生理功能紊乱。此外，我国出口的农产品也因有机磷农药残留超标而屡屡发生被拒收、扣留、退货、索赔和撤消合同等事件，造成了巨大的经济损失。鉴于以上情况，我国政府已决定停止生产和使用对硫磷，并将其列为农药残留的重要检测对象。因此，建立快速、高效、灵敏的对硫磷检测方法具有重要意义。对硫磷残留量的检测方法主要依赖于昂贵、费时、前处理复杂的仪器分析方法，如HPLC、GC、GC-MS等。ELISA具有选择性好、灵敏度高、实用性强等特点弥补了仪器方法的不足，成为快速筛选检测方法发展的一种趋势。在常规ELISA中，小分子半抗原需要与载体蛋白偶联，合成半抗原-蛋白偶联物，并通过疏水作用固定在酶标板表面。然而这种非特异性吸附存在着很多弊端:首先半抗原与载体蛋白偶联反应没有好的重复性，不利于分析标准化。其次半抗原-载体蛋白是通过静电作用固定在酶标板表面，该过程很容易导致小分子半抗原被载体蛋白屏蔽。在微孔板表面直接偶联半抗原的形式可以克服上述的一些缺点。通常酶标板表面没有功能基团与半抗原偶联，所以需要在聚苯乙烯表面修饰上一些功能基团，如羟基，醛基，氨基等。
发明内容
本发明的目的是提供一种直接包被ELISA方法用于对硫磷的快速检测。本发明的技术方案概述如下:一种氨基对硫磷，其结构式如式I所示:
权利要求
1.一种对硫磷半抗原,具有式I结构:
2.式I所示对硫磷半抗原的制备方法，由如下步骤组成: 称取对硫磷5g溶于50mL乙醚，倒入分液漏斗中，用冷的1 %碳酸钠溶液萃取四次，每次.1OmL,弃去水层；上述乙醚相中加入40mL乙酸-浓盐酸(9/1，v/v)，加入8g锌粉(分多次缓慢加入)，将混合物搅拌回流反应45min，生成黄色反应物；冷却后过滤去除沉淀,用氯仿洗涤沉淀，合并滤液后用25mL蒸馏水洗涤，弃去上层水相，氯仿层用无水硫酸钠干燥过夜；过滤后，在旋转蒸发器中减压下除去溶剂，得到橙红色油状物即为氨基对硫酸粗品，上述粗品中加入2%盐酸，调节pH为1-2，除去不溶物；该混合物用己烷萃取2次，每次10mL，弃去己烷层，水层中加入10%的NaOH溶液，调节pH为10 11时，出现桔红色油状物，再用CHCl3萃取2次，每次10mL，分出保留CHCl3层，加无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏得到桔红色油状物。
3.一种用于对硫磷快速检测的直接包被ELISA检测方法，具体步骤如下: .0.0lmol L_1 pH9.6碳酸盐缓冲液将戊二醛稀释成6%，加入到中度吸附微孔板中，每孔100 μ L，37°C孵育2h ;去离子水洗涤3次，每次200 μ L ；80mmol L-1 ρΗ8.0PBS缓冲液将氨基化对硫磷稀释成适当浓度加入到微孔板中，37°C孵育2h ;PBST洗涤后，加含1%甘氨酸的0.0lmol/LPB封闭溶液，37°C反应Ih除去戊二醛网络结构上剩余的醛基；洗涤后干燥保存； 洗涤后，加入含1 % BSA的PB稀释的50 μ L抗对硫磷抗体以及50 μ L标准溶液(100，.20,4,0.8,0.16，0.032,0.0064,0.00128,0.000256，O μ g mL-1)，37。。反应 1.5h ;充分洗涤后，每孔加入100 μ L酶标二抗(0.0lmol L-1PBS, pH 7.4含有适当浓度的BSA)，37°C孵育.45min ;洗涤6次后，加入100 μ L底物37°C反应IOmin ;加入H2SO4 (2mol L-1,50μL终止反应，酶标仪测定450nm处吸光值。
全文摘要
本发明公开了一种对硫磷的快速检测方法，属于生物检验技术领域，本发明首先将对硫磷进行氨基化改造，使用戊二醛溶液处理聚苯乙烯微孔板，使微孔板表面产生带有醛基的网络结构，利用醛基与氨基对硫磷的氨基反应进行偶联，从而完成氨基对硫磷的直接包被。通过对戊二醛浓度、氨基化对硫磷浓度、封闭条件等条件进行优化，建立了一种氨基化对硫磷直接包被ELISA用于检测对硫磷。与常规ELISA相比，氨基化对硫磷直接包被ELISA具有较高的灵敏度，通过实际样品加标回收分析，氨基化对硫磷直接包被ELISA表现出较高的稳定性(CV为3.21％～6.32％)和精确度(回收率为83％-116.6％)，该方法相比传统包被完全抗原的ELISA方法相比，更简单快速，该方法可以用于研制快速检测对硫磷残留的免疫速测试剂盒。
文档编号G01N33/543GK103172660SQ20111044063
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者高志贤, 彭媛, 宁保安, 赛娜, 白家磊, 孙思明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所