专利名称：快速检测软骨藻酸的试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测生物毒素的试剂盒以及方法，具体是涉及一种快速检测软骨藻酸的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
据统计，全世界因食用被赤潮毒素污染的贝类中毒事件约300多起，死亡300 多人。而我国，近年来，在福建、台湾、香港等地均有赤潮毒素中毒事件的发生，导致人员的死亡。记忆缺失性贝毒软骨藻酸是由硅藻门、羽纹硅藻纲(Permatae)、管壳缝目 (Aulonoraphidinals)、菱形藻科(Nitzschiaceae)中的拟菱形藻属(Pseudo-nitzschia) 和菱形藻属(Nitzschia)中硅藻的某些种产生的，人类中毒后会出现恶心、呕吐、胃炎，严重时可以导致头晕眼花、视觉障碍、记忆丧失、昏迷等症状。目前较常用的检测软骨藻酸(DA)的方法包括小白鼠生物检测法、高效液相色谱 (HPLC)检测、酶联免疫吸附法等。小白鼠检测法检测周期长，检出限高。高效液相色谱法准确度高，检出限低，但是仪器昂贵、笨重不宜进行现场监测，酶联免疫吸附法灵敏度高，便于携带，适宜应用于软骨藻酸的现场快速监测。目前国内已开发的试剂盒检测原理多为间接竞争ELISA，先将固相抗原固定在酶标板上，加入封闭液封闭以减少抗体抗原的非特异性结合，洗涤，加入抗体和样品发生竞争反应，温育一定时间后洗涤，加入二抗，温育洗涤，加入显色液常温显色20min，加入终止液， 终止反应，测定样品在450nm和630nm下的光密度值(0D值)，通过光密度值来对样品中的软骨藻酸进行定量。间接竞争ELISA法开发的试剂盒，检测灵敏，特异性高，但是需要添加二抗，二抗与抗体的结合需要一定的时间，增加了检测的操作过程和时间，市售的软骨藻酸试剂盒大部分是间接竞争ELISA试剂盒，检测时间在2 池，有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供了一种快速、准确地检测样品中软骨藻酸的试剂盒以及方法，避免了二抗的使用，步骤简单，操作方便，能够使检测时间大大缩短，降低了成本和检测人员的工作量，适用于快速检测。本发明是通过以下的技术方案实现的，第一发明，本发明涉及一种快速检测软骨藻酸的试剂盒，该试剂盒包括酶标板、 酶标抗原、稀释液、洗涤液、显色液、终止液，所述酶标抗原为软骨藻酸与辣根过氧化物酶的偶联物，所述酶标板已用抗软骨藻酸的抗体包被、并用封闭液封闭。第二方面，本发明还涉及应用前述试剂盒快速检测软骨藻酸的方法，包括以下步骤步骤一，取已用抗软骨藻酸的抗体包被、并用封闭液封闭的酶标板，每孔加入软骨藻酸与辣根过氧化物酶偶联形成的酶标抗原，并分别加入已知不同浓度的软骨藻酸标准溶液，同时在其余孔内加入待测样品，温育，洗涤液洗涤，拍干；步骤二，每孔加入显色液，显色，加入终止液终止反应，测定OD值；步骤三，绘制所述已知不同浓度的软骨藻酸标准溶液的对数值和相应的结合率 (0D标/OD0)的标准曲线；步骤四，将所述待测样品的OD值带入所述标准曲线，即可求得样品中软骨藻酸的浓度。优选地，所述软骨藻酸与辣根过氧化物酶的偶联通过碳化二亚胺法完成。优选地，待测样品进行测定前进行预处理，该预处理步骤包括取样品，加入勻浆液，勻浆后，漩涡振荡，超声提取，离心，取出上清液至容量瓶，剩余残渣再加入勻浆液，重复提取，上清液均移至容量瓶中，蒸馏水定容，滤膜过滤。优选地，所述离心为4000rpm离心20min。优选地，所述重复提取的次数为2次。优选地，所述滤膜的孔径为0. 22 μ m。优选地，所述温育的温度为37°C，时间为60min。优选地，所述包被酶标板所用的抗体为抗软骨藻酸单克隆抗体，4°C包被过夜。优选地，所述的封闭液为质量分数为的明胶，37°C封闭60min制成封闭好的酶标板。本发明具有如下的有益效果本发明采用了直接竞争ELISA方法，避免了二抗的使用，步骤简单，操作方便，能够使检测时间大大缩短，降低了成本和检测人员的工作量，适用于快速检测。
图1为实施例1中ELISA酶联免疫吸附试验标准曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1本实施例涉及一种检测软骨藻酸的方法，包括如下步骤(1)贻贝、文蛤、扇贝等贝类按以下方式进行预处理取生鲜带壳或冷冻后在室温下解冻的样品，用刀切开闭壳肌取出贝肉，将可食用部分与中肠腺分离，放在网孔细小的金属网上浙水5min;取5g该样品，加入IOml勻浆液(体积比1 1的甲醇的水溶液)，勻浆后，漩涡振荡lmin，超声提取5min，4000rpm离心20min ；取出上清液至25ml容量瓶，剩余残渣再加入勻浆液5min，重复提取2次，上清液均移至25ml容量瓶中，蒸馏水定容；0. 22 μ m 滤膜过滤；(2)取已用抗软骨藻酸的抗体包被、并用封闭液封闭的酶标板，每孔加入软骨藻酸与辣根过氧化物酶偶联形成的酶标抗原50 μ L，并分别加入一系列Ong · HiL-1UOng · mL—1、50ng 'Hir1UOOng 'mr\250ng 'mL^^OOng ml/1、IOOOng Γ1 的软骨藻酸标准溶液 50 μ L， 每个浓度做三个重复，同时在其余孔内加入待测样品50μ L，每个样品做三个重复，在37°C 下温育60min，洗涤液洗涤三次，每次三分钟，拍干；(3)每孔加入显色液100 μ L，常温下显色20min，加入50 μ L终止液，测定0D450和 0D630，制得标准曲线，将待测样品的OD值带入标准曲线，即可计算得到样品中软骨藻酸的浓度；检测结果如下以抗原DA标准溶液浓度的对数值为横坐标，以结合率(ODfeA)Dtl)为纵坐标，绘制本次直接竞争ELISA实验的标准曲线，如图1所示，相关系数R2 = 0. 97235， 线性方程为y = -0. 1169x+l. 06312。取抑制率为90%时的DA浓度，为该法的检出限，得检出限为24. 85ng · ml/1。图1为ELISA酶联免疫吸附试验标准曲线；通过直接竞争ELISA 法的测定得到不同种类的贝类的DA含量，测定结果如表1所示，确定该法的检出限为 24. 85ng · rnL—1，得到的浓度均小于24. 85ng · πι Λ可以得知贝类样品中不含DA。表1贝类样品中DA的测定结果
权利要求
1.一种快速检测软骨藻酸的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括酶标板、酶标抗原、 稀释液、洗涤液、显色液、终止液，所述酶标抗原为软骨藻酸与辣根过氧化物酶的偶联物，所述酶标板已用抗软骨藻酸的抗体包被、并用封闭液封闭。
2.一种应用权利要求1所述的试剂盒快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一，取已用抗软骨藻酸的抗体包被、并用封闭液封闭的酶标板，每孔加入软骨藻酸与辣根过氧化物酶偶联形成的酶标抗原，并分别加入已知不同浓度的软骨藻酸标准溶液， 同时在其余孔内加入待测样品，温育，洗涤液洗涤，拍干；步骤二，每孔加入显色液，显色，加入终止液终止反应，测定OD值；步骤三，绘制所述已知不同浓度的软骨藻酸标准溶液的对数值和相应的结合率的标准曲线；步骤四，将所述待测样品的OD值带入所述标准曲线，即可求得样品中软骨藻酸的浓度。
3.如权利要求2所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，所述软骨藻酸与辣根过氧化物酶的偶联通过碳化二亚胺法完成。
4.如权利要求2所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，待测样品进行测定前进行预处理，该预处理步骤包括取样品，加入勻浆液，勻浆后，漩涡振荡，超声提取，离心， 取出上清液至容量瓶，剩余残渣再加入勻浆液，重复提取，上清液均移至容量瓶中，蒸馏水定容，滤膜过滤。
5.如权利要求4所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，所述离心为4000rpm离心 20mino
6.如权利要求4所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，所述重复提取的次数为2次。
7.如权利要求4所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为 0. 22 μ m。
8.如权利要求2所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，所述温育的温度为 37°C，时间为 60min。
9.如权利要求2所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，所述包被用的抗体为抗软骨藻酸单克隆抗体，4°C包被过夜。
10.如权利要求2所述的快速检测软骨藻酸的方法，其特征在于，所述封闭液为质量分数为的明胶，37°C封闭60min制成封闭好的酶标板。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测软骨藻酸的试剂盒及其使用方法，所述快速检测软骨藻酸的试剂盒，包括酶标板、酶标抗原、稀释液、洗涤液、显色液、终止液，所述酶标抗原为软骨藻酸与辣根过氧化物酶的偶联物，所述酶标板已用抗软骨藻酸的抗体包被、并用封闭液封闭。本发明还涉及应用前述试剂盒快速检测软骨藻酸的方法；本发明采用了直接竞争ELISA方法，避免了二抗的使用，步骤简单，操作方便，能够使检测时间大大缩短，降低了成本和检测人员的工作量，适用于快速检测。
文档编号G01N33/543GK102539746SQ20111044247
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者余朝毅, 唐庆丽, 王茜, 皮帅帅, 程金平 申请人:上海交通大学