专利名称：一种定量检测肌酸激酶同工酶的荧光免疫层析方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种定量检测急性心肌梗塞标志物肌酸激酶同工酶的荧光免疫层析方法及其试剂盒。
背景技术：
当前，心血管疾病在世界范围内已成为成年人最大的潜在杀手，仅在美国就有超过7000万人患有心脏病，每年大约有600万人因胸痛而进急诊室，每年急性心肌梗死(AMI) 的死亡人数超过了 50万，在我国，心血管疾病的患病率、发病率及其危险因素水平均呈不断上升趋势。近年来统计，心血管病的死亡率在人口死亡中占40%，已高于欧美国家，属心血管病高发国。因此，只有做到早预防、早发现及早救治，才能最大限度的防止致残、致死后果，最大限度的改善心血管患者的预后和生活质量。对心血管疾病，常用的检测指标为心肌酶谱系列。心肌酶是指心肌细胞内的酶类物质，具有催化心肌细胞代谢和调节心肌细胞电活动的作用。心肌酶谱包括天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶MB (CK-MB)等。如果心肌细胞发生坏死、破裂，这些酶类就会释放人血液当中，使之升高。因此，心肌酶谱的升高程度可以间接衡量心肌细胞的损害程度。其中CK和CK-MB是灵敏度较高的指标，能在发病早期心肌尚未大面积坏死时，在患者血液中检测出来，第一时间为临床提供可靠资料。CK是由两种不同亚基(M和B)组成的二聚体，这样正常人体组织主要含3种同工酶，即CK-MM、CK-BB, CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉细胞中，CK-BB主要存在于脑细胞中， CK-MB主要存在于心肌细胞中。CK-MB是目前常用的心肌损伤标志物，曾一度被视为诊断AMI的“金标准”。CK-MB 在急性心肌梗死发病后4 8h内增高，24h达峰值，两三天恢复正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。传统上多用酶联免疫吸附法、化学发光法及胶体金免疫层析法等测定血清中的 CK-MB。但酶联免疫吸附法操作复杂，检测耗时长；化学发光法对技术要求高，不易在临床实验室中进行常规开展。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。中国专利申请号CN200610114997. 9公布了一种血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法。该申请号专利主要利用肌酸激酶催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷反应生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并产生过氧化氢，再经过氧化物酶作用，过氧化氢使鲁米诺氧化而发光。中国专利申请号200520041211. 6披露了一种心血管疾病诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒，该试剂盒采用化学发光法(如辣根过氧化氢酶和鲁米诺)检测，并能同时检测C反应蛋白、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶等八种抗体。虽然化学发光法灵敏度较高，但重复性和稳定性均较差，且仪器复杂、昂贵，不能单人份检测，限制了他们的广泛应用。美国专利US60/576327和60/592202，及其在中国申请的专利200580025931. 6都对胶体金免疫层析检测进行了论述。但相比于荧光检测，吸光度检测具有灵敏度低、线性范围窄等缺陷。量子点(quantum dots, QDs)又称半导体纳米晶，通常是由II VI族或III V族元素组成的稳定的、尺寸介于1 20nm之间的纳米微晶体。其具有许多优良的光学特性(1)量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。(2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3) 量子点具有较强的光学稳定性。Cdk/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。 (4)量子点摩尔吸光系数可以高达106L/(mol ^m)，且荧光量子产率高(50 80% )，因而可产生较强荧光信号。( 量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长(20 50ns)，使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针。将量子点与抗体结合可应用于荧光免疫分析和检测。针对现有CK-MB检测方法灵敏度低、检测范围窄和定量不准确等不足，量子点荧光定量检测方法利用量子点多波长激发、高强度荧光强度、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，可提供一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，对CK-MB进行定量检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题为针对现有技术中检测肌酸激酶同工酶灵敏度低、线性范围窄和仪器昂贵等缺点，提供了一种定量检测CK-MB的荧光免疫层析方法。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种定量检测肌酸激酶同工酶CK-MB的荧光免疫层析方法，包括以下步骤步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将肌酸激酶同工酶CK-MB的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为 550 1300nm ；步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应CK-MB的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现CK-MB的定量检测。本发明提供的一种定量检测CK-MB的荧光免疫层析的方法，是一种以量子点为荧光信号的，采用双色标记技术，在免疫层析试纸条上实现CK-MB快速灵敏检测的方法。本发明定量检测CK-MB的荧光免疫层析方法能够解决现有荧光免疫层析技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的不足和缺陷，可实现对微量样本的检测。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10 1000倍。本发明采用化学交联或生物分子间特异性作用将CK-MB的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，其中特异性抗体为对应CK-MB的一个或多个抗原表位的抗体。本发明中的化学交联为当量子点表面有活性基团，可与抗体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把抗体修饰到量子点表面。在本发明的实施例中采用化学交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的方法为利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将量子点表面的官能团(如羧基、氨基)与蛋白质分子(如抗原、抗体等)表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰。其中EDC/NHS交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的一般步骤为将量子点溶液与EDC和 NHS混合，然后加入一定量的蛋白质，以缓冲液为反应介质，培育4h，加入L-甘氨酸封闭，以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白质修饰的量子点。生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选， 在本发明的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统的结合方式对蛋白质进行量子点修饰，该结合方式具有放大信号的作用。具体为以EDC将链霉亲和素连接到量子点表面，生物素连接到蛋白质分子表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，把蛋白质分子连接到量子点表面。为了提高与背景的区分度，本发明选用发射光波长为550 1300nm的量子点。因为在紫外照射下，层析膜、底板和扣卡的荧光强度在^Onm以下远强于550nm以上，从而对低浓度CK-MB检测时产生一定的影响，故可优选发射波长大于550nm的量子点。另外层析膜、底板和扣卡在近红外区域(750 1300nm)荧光强度极弱，并结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750 1300nm)可进一步提高灵敏度。本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 组成的组中选择的，且可掺杂Cu、Mn和Hg。质控分子修饰的量子点与CK-MB抗体修饰的量子点可选用相同发射波长的量子点。但在本发明中，为了减弱质控分子修饰的量子点对定量带及背景信号的影响，采用双色标记技术，即选用两种发射波长不同的量子点分别标记质控分子和抗体。作为优选，在本发明的实施例中，使用有机相方法合成570nm、600nm和650nm的 CdSe/aiS，并把量子点由脂溶性转为水溶性，此过程中量子点荧光无明显变化；使用水相方法合成900nm的hAs。作为优选，在本发明的一个实施例中，标记垫中CK-MB的抗体修饰的量子点发射波长为650nm，质控分子修饰的量子点发射波长为570nm。作为优选，在本发明的另一个实施例中，标记垫中CK-MB的抗体修饰的量子点发射波长为900nm，质控分子修饰的量子点发射波长为600nm。
为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。作为优选，在本发明实施例中，底板(8)为黑色，表面附有不干胶，且层析膜G)、 扣卡(11)、底板(8)和不干胶均不含有荧光剂。如扣卡含有润湿孔(1 时，则润湿孔可在层析膜的近样品垫一端或在近吸水垫一端。为区别于胶体金免疫层析试纸条的检测带，本发明中层析膜上固定CK-MB抗体的区域称为定量带，用于准确定量检测CK-MB的浓度，并以质控带作内质控校正定量带，以减弱样本、环境因素等的影响。本发明的免疫层析试纸条可采取常规的层析方式，作为优选，本发明采用预润免疫层析进行CK-MB检测。其中预润免疫层析试纸条有直接和间接预润两种，在一个实施例中，直接预润免疫层析试纸条由样品垫(1)、过滤膜( 、标记垫C3)、层析膜(4)、吸水垫(7) 和底板(8)组成，如图1所示。在标记垫上固定有CK-MB的特异性抗体修饰的量子点，以及质控分子修饰的量子点。在试纸条层析膜上分别设有两条定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应CK-MB的与上述标记垫中特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体。CK-MB能与量子点表面的抗体和定量带上的抗体形成双抗体夹心结构。并且通过增加定量带的条数可扩大检测范围，避免HOOK效应。在本发明的另一个实施例中，间接预润免疫层析试纸条由样品垫(1)、标记垫 (3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)组成，如图2所示。本发明实施例中，发明人分别选用的样本为全血和血清，且样本进一步包含血浆。 当样本为全血时，荧光免疫层析试纸条还包括在样品垫与层析膜之间设置的过滤膜，用于凝固、过滤细胞(主要为红细胞)，该过滤膜可分别与样品垫和标记垫直接毛细作用接触， 如图1所示，也可与标记垫和层析膜直接毛细作用接触。本发明实施例采用预润免疫层析方法对样本中的CK-MB进行定量检测。其中预润免疫层析为加入一定体积的缓冲液到层析膜上，润湿一定时间后，把样本加入样品垫中， 样本沿层析膜向吸水垫方向流动。预润的目的是预润湿层析膜，封闭非特异性结合位点，以使量子点标记物均勻通过层析膜，且减少在层析膜上的非特异性吸附，并减缓样本流动速度，从而增加特异性结合。其中缓冲液体积一般为20 80 μ 1，润湿时间一般为30秒 2 分钟，而样本层析时间一般为8 25分钟。本发明的预润免疫层析可为将缓冲液直接或间接滴加于层析膜。而将缓冲液间接滴加于层析膜时，荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。缓冲液通过润湿垫到达层析膜。本发明采用的缓冲液为ρΗ 7. 2 11的碱性缓冲液，且该缓冲液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂。其中表面活性剂可包括吐温20、吐温80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。作为优选，本发明实施例中，使用缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH9. 0 的磷酸缓冲液。 本发明的检测用荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。其中激发光源模块包含光源和聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，波长选择300 400nm之间或500 600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包含图像传感器或光电倍增管。层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号，经过滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，转换为数字信号。其中所获质控带与定量带的荧光强度有一定相关性，主要影响因素有温度、湿度、基质等。本发明检测结果的判定方法为如果质控带荧光信号强度值超过荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效的前提下，定量带荧光强度与质控带比值越高，表示CK-MB浓度越高，反之越低。本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F = f(c)。校正荧光信号强度为F= aFg^/Fgi，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中CK-MB浓度。本发明还提供了一种定量检测肌酸激酶同工酶的荧光免疫层析试剂盒，包括缓冲液、扣卡(11)和荧光免疫层析试纸条，如图3所示。该试剂盒采用间接预润免疫层析方法。扣卡(11)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(12)、视窗(14)和润湿孔 (13)，且具低荧光特性，优选为不含荧光剂。荧光免疫层析试纸条结构如图2所示，其包含样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜0)、 润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)。层析膜(4)包含质控带( 和定量带 (6)。其中样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)和吸水垫(7)搭载于底板(8)之上，样品垫(1)连接于标记垫(3)，且位于上样孔(12)的下方，标记垫(3)连接于层析膜G)，层析膜(4)上固定有两条质控带( 和两条定量带(6)，且质控带(5)位于定量带(6)的两侧，层析膜(4)位于视窗(14)的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(13)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(7)。进行全血样本层析时，试纸条还包括过滤膜O)，具体结构如图1所示，其中试纸条包含样品垫⑴、标记垫⑶、层析膜⑷、吸水垫(7)、底板⑶和过滤膜(2)。过滤膜(2) 与样品垫(1)和层析膜(4)毛细作用接触，即过滤膜可连接于样品垫(1)与标记垫(3)之间，也可连接于标记垫(3)与层析膜G)。本发明构建的预润免疫层析试纸条，其特征是，增加润湿垫(9)和连接垫(10)，其中润湿垫分别与层析膜(4)和连接垫(10)毛细作用接触，用于减小滴加缓冲液时，缓冲液对层析膜的冲击，以润湿层析膜(4)，并减少非特异性吸附。而连接垫(10)分别与润湿垫(9)和吸水垫(7)毛细作用接触，具有缓慢的吸水速度，以减少润湿时的吸水量，促使缓冲液充分润湿层析膜G)，当加样本层析时，吸水垫(7) 可通过连接垫(10)吸水，促使样本层析。试纸条的层析膜(4)具有弱荧光特性，优选不含荧光剂，其荧光噪声在大于550nm 时很弱，以减少对低浓度目标物检测的影响。本发明的主要优点如下1)本发明定量检测CK-MB的荧光免疫层析方法采用量子点作为特异性抗体的标记物，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。并优选了 550 1300nm的量子点，以提高与背景的区分度。2)本发明试剂盒的组成部件中的扣卡、底板以及层析膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，以减少对量子点荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。3)本发明采用荧光定量仪检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带校正定量带荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现CK-MB的定量检测。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F = f(c)。校正荧光信号强度为F= aFg^/Fgi，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中CK-MB浓度。4)本发明利用量子点双色标记技术，减少质控分子对CK-MB检测的影响，也可减少质控分子修饰的量子点对定量带和层析膜背景的影响，方法简单快速，灵敏度高，有利于高灵敏定量检测。5)本发明可利用预润免疫层析技术，增强特异性结合，减少非特异性吸附，增强试剂盒的检测灵敏度，有利于样品中CK-MB含量极低时的准确定量。6)本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏很高。与传统的化学发光法和酶联免疫法检测肌酸激酶同工酶相比，具有操作简便、快速、不需昂贵的检测设备，适合单人份或小批量检测等优点；与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。
图1为直接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为过滤膜，3为标记垫，4为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，8为底板；图2为间接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，3为标记垫，4为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，8为底板，9为润湿垫，10为连接垫；图3为荧光免疫层析试剂盒示意图，其中11为扣卡，12为上样孔，13为润湿孔，14 为视窗，5为质控带，6为定量带。
具体实施例方式本发明公开了一种定量检测肌酸激酶同工酶CK-MB的荧光免疫层析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和试剂盒进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的技术方案为步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将肌酸激酶同工酶CK-MB的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为 550 1300nm ；步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应CK-MB的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现CK-MB的定量检测。本发明荧光免疫层析的原理和检测方法为采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理定量检测人样本(全血、血清或血浆)中的肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。检测时，首先向润湿孔中滴加缓冲液，然后将样本滴加到上样孔中，样本先与标记垫中的量子点标记物相混合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带和质控带。若样本中含有CK-MB，则与量子点表面的CK-MB抗体相结合，当层析至定量带时，会被预先包被于该条带的抗体捕获，从而构成双抗体夹心复合物，量子点停留于定量带。光源激发下，采用荧光定量仪获取定量带和质控带的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而分析样本中CK-MB浓度。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1 以化学交联法将抗体修饰于量子点并采用直接预润免疫层析对CK-MB 的定量检测(一 )量子点与抗体的修饰分别以人CK-MM和CK-BB为抗原，可免疫得到羊抗人CK-MM抗体和CK-BB抗体。由于CK-MB有M和B两个亚基，则CK-MM抗体和CK-BB抗体可分别与CK-MB的M和B亚基结合，形成双抗体夹心结构。，向pH 7.4磷酸缓冲液中加入60 11101发射波长为65011111的量子点、101^ EDC和 15 μ g NHS溶液和10 30 μ g羊抗人CK-BB抗体溶液，混合均勻并于室温下反应4h，加入 Img甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到CK-BB抗体修饰的量子点。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点。其中CK-BB抗体修饰的量子点的荧光发射波长为650nm，羊抗兔抗体修饰的量子点的荧光发射波长为570nm。( 二)试剂盒的构建以摩尔比1 1的比例混合均勻上述两种量子点标记物，其中混合液中含有1 15 %蔗糖、0. 01 2 %牛血清白蛋白(BSA)和吐温20、吐温80、曲拉通X-100等表面活性剂， 其中表面活性剂含量在0.01 2%之间，然后均勻喷涂在标记垫上，37°C干燥后密封，4°C 下保存。以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。 其中两侧的两条为质控带，中间两条为定量带。质控带上喷涂兔免疫球蛋白(兔IgG)，浓度分别为0. 2 lmg/ml和1 ;3mg/ml ；定量带上喷涂CK-MM多抗，浓度分别为0. 2 lmg/ml和0. 5 2mg/ml。37 °C干燥后密封，4°C下保存。在黑色底板上，依次粘贴层析膜(长30cm，宽2. 5cm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、 过滤膜(长3Ocm,宽l6mm)、样品垫(长3Ocm,宽l6mm)、连接垫(长3Ocm,宽IOmm)、润湿垫 (长30cm，宽IOmm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成预润荧光免疫层析试纸大板，示意图如图1所示。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中组装成不含缓冲液的免疫层析试剂盒，干燥后密封，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒，4°C避光保存。(三)样本检测用正常人全血作稀释液，将CK-MB标准品配制系列浓度标准品溶液如下 0. 125ng/mL、0. 25ng/mL、0. 5ng/mL>1. 0ng/mL、2. 0ng/mL、4. 0ng/mL、8. Ong/mL、16ng/mL、 32ng/mL、64ng/mL、128ng/mL 禾口 256ng/mL。缓冲液为含有0. 1 0. 5% BSA和0. 05 1 %吐温20的pH9. O磷酸缓冲液。层析时先将50 μ 1缓冲液滴加到层析膜上，1分钟后，将100 μ 1阴性全血或标准品溶液滴加到上样孔中，13分钟后，以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，绘制标准曲线。将50 μ 1缓冲液滴加到层析膜上，1分钟后，将100 μ 1全血样本滴加到上样孔中， 13分钟后以荧光定量仪检测，依据标准曲线获得样本中CK-MB的浓度。结果表明，其最低检测限为0.5ng/mL，最低定量限为1. Ong/mL，在定量检测范围内，相关系数R2>0. 99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心血管疾病诊断提供参考。实施例2 以生物素-亲和素法将抗体修饰于量子点并采用间接预润免疫层析对 CK-MB的定量检测(一 )量子点合成及修饰根据实施例1的方法，制备链霉亲和素修饰的量子点。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点。将CK-BB单抗用0. lmol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8. 0)稀释到lmg/ml，用Iml 二甲亚砜(DMSO)溶解Img N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)，取Iml单抗溶液加入20 120 μ 1 NHSB溶液，室温下反应4小时后，加入lmol/L NH4Cl,在室温下搅拌10分钟。以超滤离心纯化，以除去游离的生物素，得到生物素化的单抗。以1 3 1 12的比例混合链霉亲和素修饰的量子点和生物素化的单抗，得到 CK-BB单抗修饰的量子点。其中CK-BB抗体修饰的量子点的荧光发射波长为900nm，羊抗兔抗体修饰的量子点的荧光发射波长为600nm。( 二)试剂盒的构建及样本检测根据实施例1的方法把量子点标记物喷涂于标记垫，把抗体和质控分子喷涂于层析膜的定量带和质控带。在黑色底板上，依次粘贴上层析膜(长30cm，宽2. 5cm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、 样品垫(长3Ocm,宽l6mm)、连接垫(长3Ocm,宽10mm)、润湿垫(长3Ocm,宽10mm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成荧光免疫层析试纸大板，示意图如图2所示。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中组装成不含缓冲液的免疫层析试剂盒，如图3所示，干燥后密封，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒，4°C避光保存。(三)样本检测根据实施例1进行标准品配制。缓冲液为含有0. 05 0. 2% BSA和0. 05 1 % Tween-20的pH9. 0磷酸缓冲液。 层析时先将50 μ 1缓冲液滴加到润湿孔中，1分钟后，将100 μ 1阴性血清或标准品溶液滴加到上样孔中，13分钟后以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，绘制标准曲线。将50 μ 1缓冲液滴加到润湿孔中，1分钟后，将100 μ 1血清样本滴加到上样孔中， 13分钟后以荧光定量仪检测，依据标准曲线获得样本中CK-MB的浓度。结果表明，其最低检测限为0. Ing/mL，最低定量限为0. 25ng/mL，在定量检测范围内，相关系数R2 > 0. 99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心血管疾病诊断提供参考。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种定量检测肌酸激酶同工酶CK-MB的荧光免疫层析方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将肌酸激酶同工酶CK-MB的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为 550 1300nm ；步骤幻将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应 CK-MB的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现CK-MB的定量检测。
2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述抗体修饰的量子点的发射波长为650nm，步骤2、所述质控分子修饰的量子点的发射波长为570nm。
3.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述抗体修饰的量子点的发射波长为900nm，步骤2、所述质控分子修饰的量子点的发射波长为600nm。
4.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点。
5.根据权利要求4所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述化合物为选自aiS、 CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一种或几种，且可掺杂Cu、Mn和Hg。
6.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述层析膜在大于 550nm时荧光很弱或不含荧光剂。
7.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述底板为黑色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。
8.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述荧光免疫层析试纸条还包括能使样本中液体与细胞分离的过滤膜。
9.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤4)所述免疫层析为预润免疫层析，其中预润免疫层析为先以缓冲液预润层析膜，再加入样本到样品垫中，样本流经定量带和质控带后，进行荧光定量检测。
10.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述预润层析膜为将缓冲液直接滴加于层析膜。
11.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，当所述预润层析膜为将缓冲液间接滴加于层析膜时，步骤幻所述荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。
12.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述缓冲液为pH7. 2 11的碱性缓冲液。
13.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的碱性缓冲液。
14.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH9. 0的磷酸缓冲液。
15.一种定量检测肌酸激酶同工酶CK-MB的荧光免疫层析试剂盒，包括缓冲液、扣卡 (11)和荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述扣卡(U)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(12)、视窗(14)和润湿孔(1 ；所述荧光免疫层析试纸条包括样品垫 (1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)，其中样品垫 (1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)和吸水垫(7)搭载于底板(8)之上， 样品垫(1)连接于标记垫(3)，且位于上样孔(12)的下方，标记垫(3)连接于层析膜0)， 层析膜(4)上固定有两条质控带( 和两条定量带(6)，且质控带( 位于定量带(6)的两侧，层析膜(4)位于视窗(14)的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(13)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(7)。
16.根据权利要求15所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析试纸条还包括过滤膜O)，其中所述过滤膜( 分别与样品垫(1)或层析膜(4)毛细作用接触。
17.根据权利要求15所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述扣卡(11)具有低荧光特性或不含荧光剂。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测急性心肌梗塞标志物肌酸激酶同工酶CK-MB的荧光免疫层析方法及其试剂盒。本发明的定量检测肌酸激酶同工酶的荧光免疫层析方法利用量子点优良的荧光特性，结合双色标记技术和免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件的基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明试剂盒对CK-MB进行定量检测，适用于全血、血清和血浆样本的检测，可为心脑血管疾病诊断提供参考，广泛用于基层医院和诊所。
文档编号G01N33/573GK102520173SQ20111045381
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者王东 申请人:深圳康美生物科技股份有限公司