专利名称：葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法
技术领域：
本发明涉及食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法，特别是涉及葡萄球菌肠毒素A (SEA)和B (SEB)的检测方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是常见的食物中毒致病菌，能引起人和动物多种疾病，其致病性主要与其分泌的肠毒素密切相关。葡萄球菌肠毒素(SEs)是一组耐高热的低分子量可溶性蛋白，其中SEB是食物中毒的重要致病因子，并被列为生物战剂的主要毒素之一。SEB蛋白对热稳定，引起食物中毒的最低浓度是200ng/100g食品，误食被其污染食品的人在4 他后引起恶心、呕吐及腹泻，因此，研究快速灵敏的检测SEB和其他多种SEs，如SEA，SEC1, SEC2 等的方法显得尤为重要，理想的食品检测手段对SEB的检测应该达到ng/mL级，而且样品不需过多的处理。目前，SEs的检测的方法有单、双向琼脂扩散法、反向间接血凝法(RPHA)、固相放射免疫法(RIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)等免疫学方法。血清学方法所需的抗体制备工艺繁杂，周期长，效价受到众多生物因素的影响。RIA、ELISA和RPHA检测灵敏度虽然可达ng 级，但其实验条件要求苛刻，反应中有假阳性出现等缺点限制了其应用范围。近年来又发展起来的基因探针检测方法，由于放射性同位素标记探针的半衰期短及放射污染等缺点限制了该技术的推广应用。随着科学技术的发展，出现了分子印迹技术(molecular imprinting technique, MIT)，该技术又称分子烙印(molecular imprinting)，属超分子化学中主客体化学范畴，是源于高分子化学、生物化学、材料科学等学科的一门交叉技术。该技术具有特异选择性的聚合物的过程，当模板分子与聚合物单体接触时会尽可能地同单体形成多重作用点，如果通过聚合，把这些多重作用点固定或“冻结”下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用点的空穴。获得的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)具有模拟生物抗体的功能，被形象的称为“人工抗体”，已成为当今研究的热点课题之一，其制备过程简单，成本低廉，物理化学性质稳定，并且具有效预定性、特异识别性和广泛实用性。但传统的印迹聚合物是三维块体，一般密度较大，大分子模板难以达到和离开结合位点，不良的物质传输和永久的模板保留对识别性能产生负面影响，再由于常规的非生理性印迹条件和实验中常用的有机溶剂都会使蛋白变性，使得三维的印迹技术并不适合识别大分子蛋白质。二维蛋白分子印迹仅使模板蛋白分子印迹在聚合物的表面，印迹位点也处于薄膜的表面，这可克服空间位阻的影响，便于除去模板和蛋白分子接近识别位点，而且使用的溶剂大多数是温和型和水溶性溶剂，以及生物实验中常用的缓冲液，可使得靶标蛋白质保持其生理活性和正常的空间结构。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法。本发明的技术方案概述如下一种葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法，包括如下步骤(1)石英晶振电极表面活性处理；将三个表面镀金的石英晶振电极浸入 0. 05-0. 2M的11-巯基醇酸的乙醇溶液中，浸泡8-16h，取出，用无水乙醇冲洗，氮气吹干，分别标记为A、B和C电极；(2)初始溶胶凝胶的制备将2 3mL原硅酸四乙酯，100 200 μ 1苯基三甲氧基硅烷，100 200 μ 1甲基三甲氧基硅烷，400 600 μ 1浓度为0. 05-0. 2Μ的HCl水溶液和2 3ml的H2O混合，超声 20 30分钟制备成初始溶胶凝胶；(3)含有SEA或SEB模板的印迹溶胶凝胶的制备取2 4mL初始溶胶凝胶和100 200 μ 1浓度为0. 1 0. 3mg/mL的SEA磷酸盐缓冲液，混合均勻，超声20-40分钟，获得含有SEA模板的印迹溶胶凝胶；取2 4mL初始溶胶凝胶和100 200 μ 1浓度为0. 1 0. 3mg/mL的S^磷酸盐缓冲液，混合均勻，超声20-40分钟，获得含有SEB模板的印迹溶胶凝胶；(4)对石英晶振电极表面进行涂布处理①以1000 3000转/分钟的转速将所述含有SEA模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述A电极表面20 30秒，以1000 3000转/分钟的转速将所述含有SEB模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述B电极表面20 30秒，静置10 15分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；②重复步骤①3-5次；得到表面结合有分子印迹聚合物膜的石英晶振电极，室温下干燥；③将步骤(2)获得的初始溶胶凝胶，以1000 3000转/分钟的转速均勻涂布于C 电极表面20 30秒，静置10 15分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；④重复步骤③3-5次；室温下干燥；(5)去除模板蛋白分子SEA和SEB 用40 50°C的双蒸水对步骤中步骤②获得的电极进行冲洗，去除模板蛋白， 用氮气吹干，得到包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B，并置于室温下干燥后备用；用40 50°C的双蒸水对步骤中步骤④获得的C电极进行冲洗，用氮气吹干， 得到参比电极，并置于室温下干燥后备用；(6)葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器的构建及待测液检测将包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B以及参比电极C分别置于三个加样池中，并连接于石英晶体微阵列传感器E4上，构建出葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器，往各加样池中加入200 μ 1 PBS，待其频率稳定后分别向浸有包被有分子印迹膜的石英晶振电极A、B的加样池中分别加入200 μ 1待测液，检测频率变化直至稳定，检测待测液中葡萄球菌肠毒素SEA或SEB ；所述待测液的配制为下述两种方法之一种方法一直接取液体样品为待测液或按体积比为1 0. 5 1. 5的比例将液体样品与PBS混合后为待测液或按体积比为1 0.5 1.5的比例将液体样品与PBS混合后用滤器过滤，取滤液为待测液；方法二 按Ig 0. 5 1. 5ml的比例将粉碎后的固体样品与PBS混合为待测液或按Ig 0.5 1.5ml的比例将粉碎后的固体样品与PBS混合，用滤器过滤，取滤液为待测液。本发明的优点本发明的方法针对食品中毒重要致病因子葡萄球菌肠毒素中常见的SEA和SEB大分子蛋白进行快速检测。摒弃了常规金黄色葡萄球菌肠毒素血清学和免疫学方法抗体制备工艺繁杂，周期长、实验步骤繁琐、成本高的不足，制备方法简单、不需任何标记，检测快速，受外界干扰较小，成本低廉，结果获得稳定可靠，整个检测过程30分钟内完成，在食品安全、卫生检测、环境监测、临床检验、生物恐怖监测等领域具有广泛的应用前
旦
ο本发明以单片阵列式质量传感器件为换能器，在石英晶振表面通过有机硅烷化自组装溶胶凝胶法原位合成SEA和SEB分子的二维分子印迹聚合物，并洗掉模板，构建的多种葡萄球菌肠毒素检测的二维分子印迹阵列式质量传感器，取代生物抗体作为识别元件，通过分子识别，膜吸附样品中的待测分子，进而使得MPs的质量发生变化，引起石英晶振振动频率发生变化，以此对样品中待测的靶标物进行检测。
图1为包被有SEA、SEB分子印迹膜和非印迹膜的石英晶振频率随时间变化的曲线。图2为PBS缓冲液中不同浓度的SEA和SEB对包被有SEA、SEB分子印迹膜和非分子印迹膜的石英晶振所产生的浓度-频率(Hz)变化曲线图(n = 3)。图3为葡萄球菌肠毒素检测的二维分子印迹阵列式质量传感器的特异度测定(a) SEA反应池中加入10 μ g/ml的SEB、SEC1、BSA、OVA和PBS的石英晶振频率(Hz) 变化；(b) SEB反应池中加入100 μ g/ml的SEB、SEC” BSA, OVA和PBS的石英晶振频率(Hz) 变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进
实验材料
巯基十一酸
TEOS(Tetraethyl orthosilicate)
PTMOS(phenyltrimethoxysilane)
MTMOS(methyl trimethoxysilane)
无水乙醇
盐酸
SEA
SEB
实验所用仪器如下
耗散型石英晶体微阵列传感器(E4，Q-Sense)实施例1—种食品中多种金黄色葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法，包括如下步骤(1)石英晶振电极表面活性处理；将三个表面镀金的石英晶振电极浸入0. IM的 11"巯基醇酸的乙醇溶液中，浸泡12h，取出，用无水乙醇冲洗，氮气吹干，分别标记为A、B和 C电极；(2)初始溶胶凝胶的制备将2. 5mL原硅酸四乙酯，150 μ 1苯基三甲氧基硅烷，150 μ 1甲基三甲氧基硅烷， 500 μ 1浓度为0. IM的HCl水溶液和2mL的H2O混合，超声25分钟制备成初始溶胶凝胶；(3)含有SEA或SEB的模板的印迹溶胶凝胶的制备 取3mL初始溶胶凝胶和150 μ 1浓度为0. lmg/mL的SEA磷酸盐缓冲液，混合均勻， 超声30分钟，获得含有SEA模板的印迹溶胶凝胶；取3mL初始溶胶凝胶和150 μ 1浓度为0. lmg/mL的SEB磷酸盐缓冲液，混合均勻， 超声30分钟，获得含有SEB模板的印迹溶胶凝胶；(4)对石英晶振电极表面进行涂布处理①以2000转/分钟的转速将所述含有SEA模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述 A电极表面25s，以2000转/分钟的转速将所述含有SEB模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述B电极表面25s，涂布后静置13分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；②重复步骤①4次；得到表面结合有分子印迹聚合物膜的石英晶振电极，室温下干燥24小时；③将步骤( 获得的初始溶胶凝胶，以2000转/分钟的转速均勻涂布于C电极表面25s，静置13分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；④重复步骤③4次；室温下干燥M小时；(5)去除模板蛋白分子SEA和SEB 用45°C的双蒸水对步骤中步骤②获得电极进行冲洗，去除模板蛋白，用氮气吹干，得到包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B，并置于室温下干燥24h后备用；用45°C的双蒸水对步骤(4)中步骤④获得的C电极进行冲洗，用氮气吹干，得到参比电极，并置于室温下干燥24h后备用；(6)葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器的构建及待测液检测将包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B以及参比电极C分别置于三个加样池中，并连接于石英晶体微阵列传感器E4上，构建出葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器，往各加样池中加入200 μ 1 PBS，待其频率稳定后分别向浸有包被有分子印迹膜的石英晶振电极A、B的加样池中分别加入200 μ 1待测液，检测频率变化直至稳定，检测待测液中葡萄球菌肠毒素SEA或SEB ；待测液的配制按体积比为1 1的比例将牛奶与PBS混合。按上述同样的方法制备10个包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和10个包被有分子印迹膜的石英晶振电极B。实施例2一种食品中多种金黄色葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法，包括如下步骤(1)石英晶振电极表面活性处理；将三个表面镀金的石英晶振电极浸入0. 05M的 11"巯基醇酸的乙醇溶液中，浸泡16h，取出，用无水乙醇冲洗，氮气吹干，分别标记为A、B和 C电极；(2)初始溶胶凝胶的制备将2mL原硅酸四乙酯，200μ 1苯基三甲氧基硅烷，100 μ 1甲基三甲氧基硅烷， 600 μ 1浓度为0. 05Μ的HCl水溶液和3mL的H2O混合，超声20分钟制备成初始溶胶凝胶；(3)含有SEA或SEB的模板的印迹溶胶凝胶的制备取2mL初始溶胶凝胶和100 μ 1浓度为0. 2mg/mL的SEA磷酸盐缓冲液，混合均勻， 超声20分钟，获得含有SEA模板的印迹溶胶凝胶；取2mL初始溶胶凝胶和100 μ 1浓度为 0. 2mg/mL的SEB的磷酸盐缓冲液，混合均勻，超声20分钟，获得含有SEB模板的印迹溶胶凝胶；(4)对石英晶振电极表面进行涂布处理①以1000转/分钟的转速将所述含有SEA模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述A 电极表面20秒，以1000转/分钟的转速将所述含有SEB模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述B电极表面20秒，涂布后静置15分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；20秒②重复步骤①3次；得到表面结合有二维分子印迹聚合物膜的石英晶振电极，室温下干燥M小时；③将步骤( 获得的初始溶胶凝胶，以1000转/分钟的转速均勻涂布于C电极表面20秒，静置15分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；④重复步骤③3次；室温下干燥M小时；(5)去除模板蛋白分子SEA和SEB用40°C的双蒸水对步骤中步骤②获得的电极进行冲洗，去除模板蛋白，用氮气吹干，得到包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B，并置于室温下干燥24h后备用；用 40°C的双蒸水对步骤(4)中步骤④获得的C电极进行冲洗，用氮气吹干，得到参比电极C，并置于室温下干燥24h后备用；(6)葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器的构建及待测液检测将包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B参比电极C分别置于三个加样池中， 并连接于石英晶体微阵列传感器E4上，构建出葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器，往各加样池中加入200 μ 1 PBS，待其频率稳定后分别向浸有包被有分子印迹膜的石英晶振电极A、B的加样池中分别加入200 μ 1待测液，检测频率变化直至稳定，检测待测液中葡萄球菌肠毒素SEA或SEB ；待测液的配制按体积比为1 0. 5的比例将剩菜汤与PBS混合，用滤器过滤，取滤液为待测液。(本实施例也可以按体积比为1 05的比例将剩菜汤与PBS混合，用滤器过滤，取滤液为待测液。)实施例3一种食品中多种金黄色葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法，包括如下步骤(1)石英晶振电极表面活性处理；将三个表面镀金的石英晶振电极浸入0. 2M的 11"巯基醇酸的乙醇溶液中，浸泡他，取出，用无水乙醇冲洗，氮气吹干，分别标记为A、B和 C电极；(2)初始溶胶凝胶的制备将3mL原硅酸四乙酯，100μ 1苯基三甲氧基硅烷，200 μ 1甲基三甲氧基硅烷， 400 μ 1浓度为0. 2Μ的HCl水溶液和2ml的H2O混合，超声30分钟制备成初始溶胶凝胶；(3)含有SEA或SEB模板的印迹溶胶凝胶的制备 取4mL初始溶胶凝胶和200 μ 1浓度为0. 3mg/mL的SEA磷酸盐缓冲液，混合均勻， 超声40分钟，获得含有SEA模板的印迹溶胶凝胶；取4mL初始溶胶凝胶和200 μ 1浓度为 0. 3mg/mL的SEB的磷酸盐缓冲液，混合均勻，超声40分钟，获得含有SEB模板的印迹溶胶凝胶；(4)对石英晶振电极表面进行涂布处理①以3000转/分钟的转速将所述含有SEA模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述A 电极表面30秒，以3000转/分钟的转速将所述含有SEB模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述B电极表面30秒，涂布后，静置10分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；②重复步骤①5次；得到表面结合有分子印迹聚合物膜的石英晶振电极，室温下干燥24小时；③将步骤( 获得的初始溶胶凝胶，以1000 3000转/分钟的转速均勻涂布于 C电极表面30秒，静置10分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；④重复步骤③5次；室温下干燥M小时；(5)去除模板蛋白分子SEA和SEB用50°C的双蒸水对步骤中步骤②获得的电极进行冲洗，去除模板蛋白，用氮气吹干，得到包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B，并置于室温下干燥24h后备用；用50°C的双蒸水对步骤(4)中步骤④获得的C电极进行冲洗，用氮气吹干，得到参比电极，并置于室温下干燥24h后备用；(6)葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器的构建及待测液检测将包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B以及参比电极C分别置于三个加样池中，并连接于石英晶体微阵列传感器E4上，构建出葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器，往各加样池中加入200 μ 1 PBS，待其频率稳定后分别向浸有包被有分子印迹膜的石英晶振电极A、B的加样池中分别加入200 μ 1待测液，检测频率变化直至稳定，检测待测液中两种葡萄球菌肠毒素SEA或SEB ；待测液的配制将酱制食品研碎，再按Ig Iml的比例将粉碎后的酱制品样品与PBS混合用滤器过滤，取滤液为待测液。
(也可以再按Ig 0. 5ml的比例或Ig 1. 5ml的比例将粉碎后的酱制品样品与 PBS混合，其它步骤同本实施例)每次测定前电极和加样池都用40°C的去离子水反复冲洗，然后用氮气吹干。实施例4葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器对葡萄球菌肠毒素的重复性测定将200 μ 1含有10 μ g/ml SEA的磷酸盐缓冲溶液反复10次注入浸有包被有分子印迹膜的石英晶振电极A的加样池中，将200μ 1含有 ομ g/ml SEB的磷酸盐缓冲溶液反复10次注入浸有包被有分子印迹膜的石英晶振电极B的加样池中，在同一条件下测定电极的频率变化(Δ f)，以此对批内重复性进行检测。接下来，使用实施例1制备的3个包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和3个包被有分子印迹膜的石英晶振电极B，在同一条件下测定Δ f，以此对批间重复性进行检测。结果如表1所示。表1葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器检测葡萄球菌肠毒素的批内和批间重复性比较
权利要求
1. 一种葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法，其特征是包括如下步骤(1)石英晶振电极表面活性处理；将三个表面镀金的石英晶振电极浸入0.05-0. 2M的 11-巯基醇酸的乙醇溶液中，浸泡8-16h，取出，用无水乙醇冲洗，氮气吹干，分别标记为A、B 和C电极；(2)初始溶胶凝胶的制备将2 3mL原硅酸四乙酯，100 200μ 1苯基三甲氧基硅烷，100 200μ 1甲基三甲氧基硅烷，400 600 μ 1浓度为0. 05-0. 2Μ的HCl水溶液和2 3ml的H2O混合，超声20 30分钟制备成初始溶胶凝胶；(3)含有SEA或SEB模板的印迹溶胶凝胶的制备取2 4mL初始溶胶凝胶和100 200 μ 1浓度为0. 1 0. 3mg/mL的SEA磷酸盐缓冲液，混合均勻，超声20-40分钟，获得含有SEA模板的印迹溶胶凝胶；取2 4mL初始溶胶凝胶和100 200 μ 1浓度为0. 1 0. 3mg/mL的SEB的磷酸盐缓冲液，混合均勻，超声20-40分钟，获得含有SEB模板的印迹溶胶凝胶；(4)对石英晶振电极表面进行涂布处理①以1000 3000转/分钟的转速将所述含有SEA模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述A电极表面20 30秒，以1000 3000转/分钟的转速将所述含有SEB模板的印迹溶胶凝胶均勻涂布于所述B电极表面20 30秒，静置10 15分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；②重复步骤①3-5次；得到表面结合有分子印迹聚合物膜的石英晶振电极，室温下干燥；③将步骤( 获得的初始溶胶凝胶，以1000 3000转/分钟的转速均勻涂布于C电极表面20 30秒，静置10 15分钟，用水冲洗掉表面物理吸附的所述凝胶，用氮气吹干；④重复步骤③3-5次；室温下干燥；(5)去除模板蛋白分子SEA和SEB用40 50°C的双蒸水对步骤中步骤②获得的电极进行冲洗，去除模板蛋白，用氮气吹干，得到包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B，并置于室温下干燥后备用；用40 50°C的双蒸水对步骤中步骤④获得的C电极进行冲洗，用氮气吹干，得到参比电极，并置于室温下干燥后备用；(6)葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器的构建及待测液检测将包被有分子印迹膜的石英晶振电极A和B以及参比电极C分别置于三个加样池中， 并连接于石英晶体微阵列传感器E4上，构建出葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感器，往各加样池中加入200 μ 1 PBS，待其频率稳定后分别向浸有包被有分子印迹膜的石英晶振电极A、B的加样池中分别加入200 μ 1待测液，检测频率变化直至稳定，检测待测液中葡萄球菌肠毒素SEA或SEB。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法，包括如下步骤(1)石英晶振电极表面活性处理；(2)初始溶胶凝胶的制备；(3)含有SEA和SEB的模板的印迹溶胶凝胶的制备；(4)对石英晶振电极表面进行涂布处理；(5)去除模板蛋白分子SEA和SEB；6)SEA和SEB检测的分子印迹阵列式质量传感器的构建，本发明针对食品中毒重要致病因子葡萄球菌肠毒素中常见的SEA和SEB大分子蛋白进行快速检测。方法简单、不需任何标记，检测快速，受外界干扰较小，成本低，结果稳定可靠，整个检测过程时间短，在食品安全、卫生检测、环境监测、临床检验、生物恐怖监测等领域具有广泛的应用前景。
文档编号G01N27/327GK102565161SQ20111045980
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者刘楠, 李晓丽, 欧国荣, 陈翔, 马新华, 高志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所