专利名称：一种快速检测抗潮霉素hyg蛋白的金标试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种快速检测植物材料中转基因成分的免疫检测试剂盒，尤其是快速、特异性检测抗潮霉素HYG蛋白的金标试剂盒。
背景技术：
在进行研发、筛选和评价转基因产品的过程中，往往需要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。抗潮霉素HYG蛋白编码基因克隆自pCambia Vectorsl304质粒，该质粒选自植物基因转化中常用的载体，具有高潮霉素耐受性。该基因编码的蛋白经分析属于Class I类型，酶活测定显示该蛋白具有高底物亲和能力和低潮霉素亲和力，因此能赋予宿主高潮霉素耐受力。目前，检测转基因产品中抗潮霉素HYG蛋白的技术和仪器主要有酶标仪、放免闪烁仪、离心机等。然而，它们对人员的技术水平、操作环境等要求较高，主要不足有成本高， 步骤繁琐，不易操作，耗时长。其中，酶免检测时间需20小时、放免检测需30分钟 1小时， 很难推广应用。因此，实践中需要有一种不受使用环境、人员技术水平等条件限制，且成本低廉， 快速高效的检测转基因植物中抗潮霉素HYG蛋白，且操作简便、结果准确可靠的装置。
发明内容本实用新型提供了一种快速检测转基因植株中抗潮霉素HYG蛋白的免疫检测试剂盒，不仅操作简便，而且结果准确可靠。本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是一种快速检测抗潮霉素HYG蛋白的金标试剂盒，包括盒体、置于盒体内表面的测试带和上盖，盒体盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述上盖设置有两个观测窗和一个加样孔。所述观测窗的形状选自正方形、矩形、圆形或菱形，两个观测窗分别是测试区和质控区。所述盒体的深度不限，其内表面设置一条可以嵌入所述测试带的凹槽。在盒体的一端可设置有操作手持柄，以方便操作，并可防止进行测试操作时手触碰到观测区及加样区后带入污染；操作手持柄的形状不限。所述盒体或上盖可具有卡槽，以保证盒体与上盖扣紧。所述测试带形状为长方形片状，用于检测抗潮霉素HYG蛋白。所述测试带是一种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料等多层材料制成。测试带分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗体；抗潮霉素 HYG蛋白测试带的样品检测区包被特异功能性抗潮霉素HYG蛋白单克隆抗体或多克隆抗体。[0014]外源基因转入植物表达后，将产生目的蛋白一抗潮霉素HYG蛋白，可通过免疫反应检测样品中是否含有该蛋白来确定该基因是否存在。如果没有检测出抗潮霉素HYG蛋白，表明无此标记外源基因转入植物，或此基因在植物体内不表达或表达量极低。本实用新型的目的是这样实现的当盒体盖入上盖后，观测窗和加样孔对应测试带，通过盒盖上的加样孔和观测窗可进行加样和观察检测结果。检测时，将送检物品的提取液滴加在试剂盒的加样孔中，5-10分钟后，通过肉眼就可以通过上盖的观测窗直接观察到准确的检测结果。对于每个观测窗来说，用以下方式判断检测结果1、阴性(-)反应状况观测窗质控区(3)出现一条蓝色条带。检测结果待检样品中不含待检基因或其含量在其阈值以下。2、阳性(+)反应状况观测窗质控区C3)出现一条蓝色条带，在测试区( 内同时出现蓝色条带。检测结果待检基因含量在阈值以上。3、无效反应状况质控区(3)未出现蓝色条带。检测结果可能的原因为操作过程不正确、试剂盒已变质损坏或出现质量问题。本试剂盒可为快速检测植物种子、叶片及加工产品中是否含有抗潮霉素HYG蛋白基因成份提供直接证据，不需其它任何附加仪器设备。可用于实验室、田间、边防、海关植物检验、检验检疫局、食品安全检测及种子经营销售等部门对可疑样本现场、快速筛查。本试剂盒操作简便、且可防止进行测试操作时手触碰到观测区及加样区后带入污染。
以下结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。图1和图2是本实用新型一个实施例的结构示意图，其中图1是试剂盒盒体的俯视图，图2是试剂盒上盖的俯视图；图中1是加样孔；2是测试区观测窗；3是质控区观测窗；4是测试带；5是手持柄。
具体实施方式
实施例1试剂盒的制备一、制备测试带抗潮霉素HYG蛋白单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL。1周后，将抗潮霉素HYG蛋白单抗杂交瘤细胞注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1 3X106。10天后收获腹水，以上过程皆在无菌条件下完成。1.抗潮霉素HYG蛋白单克隆抗体的纯化1)以DEAE离子交换层析及kphacryl S-300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE 平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3，000 Xg离心15分钟一上清液加50%硫酸铵沉淀，过夜一3，000 X g离心20分钟一沉淀溶于0. OlM磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) — S-300凝胶柱一DEAE Blue层析柱一0-800mM NaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95%以上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的OD值，按以下公式计算蛋白含量0D279/1.4 = mg/mL(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；5)单抗活性测定选用抗潮霉素HYG蛋白抗原包被ELISA板(lyg/孔)，及羊抗鼠IgG-小时P复合物，测定各单抗效价(大于1 5000)。2.羊抗DOAt高效价免疫抗血清的制备和纯化1)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫二次，每次间隔一月一第二次加强后10天左右取血一离心取血清一硫酸铵沉淀一DEAE离子交换层析纯化；幻效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定OD279，计算蛋白浓度。3.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0. 01 % HauCl4 加热至沸，加入一定量的柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 ·2Η20)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入
0. 02% 腳3。2)将胶体金液500mL用0. IM NaOH调pH8. 4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL，搅拌 20分钟。5，500Xg离心30分钟，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗体沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4°C 保存。4.膜反应体系Ml的制备1)将抗潮霉素HYG蛋白抗体及纯化的羊抗鼠IgGWO. IM磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约 0. 2-ang/mL。2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0. IM磷酸盐缓冲液中，浓度为2. Omg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小IOcmX 27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；5)设置喷速为2 μ L/cm, NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗EPSPAD2 (2mg/mL)在 NC膜上包被反应检测线，以1. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线的距离为 4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱M小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素膜1. 8cmX27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置
室温保存备用。5.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，
室温保存。[0058]l)M2a制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 2cm/条；2)M2b制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 8cm/条；3)M3制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 2cm/条。6.膜反应体系M4的制备1)取胶体金-单抗复合物加稀释液，混勻配成工作浓度；2)将溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s ；4)喷制规格为0. 5-1. 5cmX 25cm/条，每条喷2遍；5)于37°C烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。7.反应体组装1)在M6塑料基板上贴双面胶带M7 二条；2)在M7中间贴反应膜Ml (18mm)，离M6上缘约22mm ；3)在M7上贴M5 (22mm)，与M6上缘对齐并与Ml上缘交；4)在M7上贴M2a(12mm)，与Ml下缘相接；5)在 M2 上贴 M4 (IOmm)，压住 Ml 下缘 0. 5mm ；6)在 M7 上贴 M3 (12mm),上缘压住 M4 约 2/3 ；7)在M7上贴M2b (18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住Ml约1. 5mm ；9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与Ml上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴于M6背10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3. 5mm规格。二、试剂盒装配将上述制备好的检测抗潮霉素HYG蛋白的测试带4嵌入图1盒体的凹槽中，然后将上盖与盒体扣紧，即成检测试剂盒。将检测试剂盒、滴管和使用说明书一并装入塑料袋内封装后，即可。 实施例2试剂盒使用过程1.检测样本处理及准备植物种子、叶子、幼苗等待检样本在检测前需充分研磨，并用蒸馏水进行抽提和稀释。为获得最佳检测效果，应根据下表所述对不同样品按比例进行稀释。在充分研磨和稀释后，将样本混合均勻，静置后，抽取上清液作为检测样品。
权利要求1.一种快速检测抗潮霉素HYG蛋白的金标试剂盒，包括盒体、置于盒体内表面的测试带和上盖，盒体盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述上盖设置有两个观测窗和一个加样孔。
2.根据权利要求1所述的快速检测抗潮霉素HYG蛋白的试剂盒，其特征在于所述观测窗的形状选自正方形、矩形、圆形或菱形。
3.根据权利要求1或2所述的检测抗潮霉素HYG蛋白的试剂盒，其特征在于所述盒体的一端设置有操作手持柄。
专利摘要本实用新型涉及一种快速检测抗潮霉素HYG蛋白的金标试剂盒，包括盒体、置于盒体内表面的测试带和上盖，盒体盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述上盖设置有两个观测窗和一个加样孔。本试剂盒可为快速检测植物种子、叶片及加工产品中是否含有抗潮霉素HYG蛋白基因成份提供直接证据，不需其它任何附加仪器设备。本试剂盒操作简便、且可防止进行测试操作时手触碰到观测区及加样区后带入污染。
文档编号G01N33/68GK202018460SQ201120097560
公开日2011年10月26日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者刘奇, 程红梅, 苏晓峰, 郑建, 郭惠明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所