专利名称：用于异常泌尿系统细胞的差异染色的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定异常/非典型泌尿系统细胞、包括例如膀胱癌细胞的方法和试剂盒。
背景技术：
泌尿系统(还称为排泄系统或泌尿道(urinary tract))是产生、储存和排出尿的系统。在人类中，它包括两个肾脏、两个输尿管、膀胱和尿道(urethra)。膀胱是中空的肌肉的和可膨胀的器官，收集由肾脏排泄的尿，随后通过排尿丢弃尿。膀胱组织且尤其是下泌尿道(输尿管、膀胱和尿道)的上皮层，其总称为尿路上皮(UiOthelium)，容易遭受以异常/非典型细胞为特征的许多类型的病理，包括损伤、肿瘤和癌症。由于异常尿路上皮细胞可以指示尿路上皮癌，此类细胞的早期鉴定和监测被诊断的个体可用于预防或有效地治疗威胁生命的病理。膀胱癌是指膀胱的恶性生长的许多类型的任一种。它是异常细胞在膀胱中不受控制地繁殖的一种疾病。膀胱癌的最常见类型，移行细胞癌(TCC)，在尿路上皮中开始。膀胱癌在 一般人群中以每100，000人15例的发病率发生。它是男性中第四常见的癌症，在男性中的频率是女性中的3倍。最近诊断的膀胱癌的超过90%是移行细胞癌。当肿瘤局限于膀胱时5年存活率是 95%，当局部地扩散或向远处位点扩散时降低到分别46%和6%，这加强了对有效的早期检测工具的需求。目前用于检测膀胱癌的"金标准"包括尿细胞学和膀胱镜检。膀胱镜检查是一种侵入性的测试，伴有相对高的费用，尿细胞学具有低的灵敏度，尤其是对于低等级的表面TCC0许多临床研究正在进行中，目标是引入新的尿样中的分子标志物用于检测TCC。这些测试可能是昂贵的，因此带来作为一般筛选工具的适用性的挑战。如此，对检测膀胱癌、尤其是在其早期的准确方法存在需求。发明概沭根据本发明的一个方面,提供了一种调理(conditioning)泌尿系统细胞用于鉴定异常细胞的方法，所述方法包括将所述泌尿系统细胞与榕属(Ficus)植物提取物或其一种或多种成分接触，从而调理异常细胞用于鉴定。根据本发明的实施方案，所述榕属植物提取物是叶组织的乙醇提取物。根据本发明的实施方案,所述格属植物是来自亚属格亚属(Urostigma)。根据本发明的实施方案,所述格属植物是印度格(Ficus elastica)。根据本发明的实施方案，鉴定通过用碱性染料和/或酸性染料染色泌尿系统细胞来进行。根据本发明的实施方案,所述碱性染料是新品红(New Fuchsin)且所述酸性染料是亮绿(Light Green)或固绿(Fast green)。根据本发明的实施方案，染色通过用新品红、随后用亮绿或固绿来进行。根据本发明的实施方案，所述泌尿系统细胞的异常细胞的细胞质被染为粉红色、红色或紫色(violet color)。根据本发明的实施方案，所述泌尿系统细胞是尿路上皮细胞。根据本发明的实施方案，所述泌尿系统细胞是膀胱细胞。根据本发明的实施方案，所述泌尿系统细胞从选自以下组成的组的样品获得:组织活检、尿样和尿道拭子。根据本发明的实施方案，所述泌尿系统细胞从尿样获得。根据本发明的实施方案，所述提取物的一种或多种成分包括一种或多种黄酮类(fIavonoid)。根据本发明的实施方案，所述一种或多种黄酮类包括原花色素。根据本发明的实施方案，所述一种或多种黄酮类包括C26H32O15或C23H4404。根据本发明的 另一个方面，提供了一种鉴定尿路上皮细胞样品中的异常细胞的方法，所述方法包括:(a)将尿路上皮细胞与榕属植物提取物或其一种或多种成分接触；(b)顺序地用碱性染料和酸性染料染色所述尿路上皮细胞；和(C)鉴定具有高于预定的阈值的碱性染料颜色的细胞质的至少一个尿路上皮细胞，从而鉴定所述尿路上皮细胞样品中的异常细胞。根据本发明的实施方案，所述碱性染料是新品红且所述酸性染料是亮绿或固绿。根据本发明的实施方案，所述榕属植物是来自亚属榕亚属，优选地是印度榕。根据本发明的实施方案，所述榕属植物提取物是叶组织的乙醇提取物。根据本发明的实施方案，所述尿路上皮细胞从尿样获得。根据本发明的另一个方面，提供了一种鉴定特征为存在细胞异常的膀胱病理的方法，所述方法包括:(a)将膀胱细胞与榕属植物提取物接触，从而调理异常细胞用于鉴定；
(b)用新品红和亮绿或固绿顺序地染色所述膀胱细胞；和(C)鉴定具有指示异常细胞的高于预定的阈值的红色细胞质的至少一个膀胱细胞，从而鉴定所述膀胱病理。根据本发明的实施方案，所述方法还包括:(d)分析具有高于预定的阈值的红色细胞质的所述至少一个膀胱细胞的形态。根据本发明的实施方案，所述方法还包括将所述膀胱细胞与免疫染料接触。根据本发明的实施方案，所述免疫染料是抗Ki67免疫染料。根据本发明的实施方案，所述膀胱病理是膀胱癌。根据本发明的实施方案，所述膀胱癌是移行细胞癌。根据本发明的实施方案，所述榕属植物提取物是叶组织的乙醇提取物。根据本发明的实施方案，所述膀胱细胞从尿样获得。本发明通过提供用于检测受治疗者的泌尿系统中的异常细胞的准确和简单的方法，成功地解决了目前已知配置(configuration)的缺点。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域一般技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等价的方法和材料可用于本发明实施方案的实施或测试，但以下阐述例示性的方法和/或材料。在发生矛盾的情况下，以包括定义在内的本专利说明书为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为阐明性的，并非意欲必然地限制。附图简沭
本文仅通过举例参照附图阐述本发明的一些实施方案。现在具体详细地提及附图，应强调的是显示的细节是举例并用于本发明实施方案的阐明性论述目的。在这点上，描述连同附图使本领域技术人员明了可如何实施本发明实施方案。图la-d说明用苏木精和曙红(H&E)染色的放大40X(
图1a和Ic)或用本发明的染色方法染色的(图1b和Id)的正常膀胱上皮。如这些图中所示的，用本发明方法染色的正常膀胱上皮表现均匀的绿色细胞质颜色。图2a_d说明用H&E (图2a和2c)或本发明方法(图2b和2d)染色的低等级移行细胞癌(TCC)组织；放大40X。用本发明方法染色时，TCC细胞的细胞质表现独特的淡红/紫色。图3a_d说明用H&E (图3a和3c)或本发明方法(图3b和3d)染色的高等级TCC组织；放大40X。用本发明方法染色时，TCC细胞的细胞质表现独特的淡红色。图4a_d说明用H&E (图4a和4c)或本发明方法(图3b和3d)染色的膀胱上皮发育不良；放大40X。用本发明方法染色时，发育不良的细胞的细胞质表现粉红色。图5a_d说明用本发明方法(图5a和5c)或Ki67免疫染料(图5b和5d)染色的低等级TCC组织；放大40X。染为红色的细胞区域(图5a)具有高的Ki67指数(图5b)，而染为绿色的细胞区域(图5c)具有相对低的Ki67指数(图5d)。图6a_b说明用本发明方法(图6a)或Ki67 (图6b)染色的低等级TCC组织；放大IOXo细胞的细胞质染为红色和绿色的混合(图6a)，并显示相对低的Ki67指数(图6b)。图7a_d说明用H&E染色(图7a和7c)或用Ki67和本发明方法双重染色(图7b和7d)的正常膀胱上皮(图7a-b)和低等级TCC (图7c-d);放大40X。正常组织表现蓝色/绿色细胞质染色(图7a)，不含Ki67阳性细胞(图7b)。低等级TCC组织表现均匀的粉红色细胞质染色(图7c)，并包括许多Ki67阳性细胞(图7d)。图8a_b说明从尿样分离、并用本发明方法染色的正常和高等级TCC细胞的尿细胞学；放大40X。正常上皮细胞(和炎性细胞)的细胞质染为蓝色/绿色(图8a)，而高等级TCC细胞的细胞质染为红色 /粉红色(图8b)。发明特定实施方案的描述本发明涉及用于检测异常泌尿系统细胞的方法和试剂盒、和其用于诊断病理诸如膀胱癌的用途。在详细解释本发明至少一个实施方案之前，应该理解本发明在其应用中不必然地限制于以下阐述提出的或通过实施例列举的细节。本发明可有其它实施方案或以不同方式实施或执行。膀胱癌(例如，TCC、鳞状细胞癌和腺癌)是美国第五常见的癌症。TCC是迄今最常见形式的膀胱癌，占美国膀胱癌病例的超过90%。对具有怀疑症状的患者目前使用膀胱镜检和细胞学诊断膀胱癌。用于鉴定尿中的恶性细胞的多种基于尿的肿瘤标志物是已知的。然而，利用此类标志物诊断膀胱癌要求经由膀胱镜检另外地显现肿瘤并通过经尿道切除术(transurethral resection)或组织活检来证实。此外,此类标志物对低等级膀胱肿瘤是高度不灵敏的。本发明人的PCT公布号W02007/102146公开了利用印度榕植物提取物或其活性成分染色或预染色细胞用于检测癌症或代谢疾病导致的细胞异常的方法。回到本发明的实践，修改了 W02007/102146中描述的染色方法并适于用于区分正常和异常尿路上皮细胞(例如，TCC细胞)。如在以下实施例部分的实施例1中清楚显示的，本发明的染色方法(在本文还称为"本发明方法")能够准确和快速地鉴定即使低等级TCC细胞，因此高度适于用于泌尿系统病理诸如膀胱癌的早期检测。而且，本发明的染色方法提供了用于在尿样中鉴定膀胱癌的高准确度和灵敏度的高度有利的诊断平台。这一方法解决了对非侵入性诊断膀胱异常的需求。如此，根据本发明的一个方面，提供了调理泌尿系统细胞用于鉴定异常细胞的方法。如本文所用的，短语"泌尿系统细胞"是指肾脏、输尿管、尿道或膀胱的细胞(例如，上皮细胞)。细胞可从以下获得，或可以是以下的部分:切除的组织、涂片/刮片(例如，来自尿道的)或生物样品(例如，尿样、精液样品)。为了分析，细胞可作为组织切片、细胞悬液或涂片提供。组织切片的厚度可以是约2-50微米、约2-20微米、约2_10微米或约4_5微米。涂片可以是不经任何纯化涂在显微镜载玻片上的泌尿系统细胞的粗制样品。用于为了细胞学准备尿细胞的其他方法包括但不限于，细胞离心涂片器或基于液体的细胞学方法诸如ThinPrep (Hologic, USA)。还可 在调理和染色之前培养泌尿系统细胞。此类培养可使用本领域已知的方法进行，参见例如，Hertz 等人." Short-term culture ofexfoliated cells from the urineof patients with bla dder tumors" , Urological Research,卷21, Numberl,23-26,1993 ;和 Belik 等人." Improvements in Culturing Exfoliated Urothelial Cells In Vitrofrom Human Urine" Journal of Toxicology and Environmental Health,Part A,卷71,Issuel3andl4January2008, pages923_929。为了增加检测准确度，可使用细胞分离领域公知的方法(例如，体积排除、选择性细胞溶解、等)预处理细胞样品以除去非泌尿系统细胞诸如循环系统细胞(例如，白细胞和红细胞)和类似细胞。方法通过将泌尿系统细胞与榕属植物提取物或其一种或多种成分接触来进行，从而调理异常细胞用于鉴定。如本文所用的，提及细胞或组织使用的术语"调理(conditioning)"是指使得细胞(尤其是异常细胞)更顺从于随后的经由组织学染色或经由生化或分子方法的检测的步骤。本发明的调理步骤优选地使用印度榕叶组织的乙醇提取物进行。将泌尿系统细胞样品与榕属植物提取物或其成分接触可通过将榕属植物提取物或其成分施加到泌尿系统细胞样品上，或在包含榕属植物提取物或其成分的容器中浸溃、浸泡和/或培养泌尿系统细胞样品来进行。此类接触进行使得能够调理异常细胞，从而它们经由本文描述的检测方法之一可检测到的时间段。接触可在环境条件或升高的热和压力下进行约1-20分钟或更长时间。如本文所用的，短语"榕属植物提取物"是指来自榕属植物、优选地亚属榕亚属、更优选地印度榕物种的完整或切割/研磨的植物组织(例如，叶)的乙醇/甲醇提取物。植物组织的乙醇提取物可包括约10% (v/v乙醇/水(v/v ethanol in water))、约20%、约30%、约40%、约50%乙醇、约60%乙醇、约70%乙醇、约80%乙醇约90%乙醇或约100%乙醇。然而，应该采取措施以不过度稀释提取物，因为这可影响随后的染色。示例性的提取程序在以下描述。提取物如下产生。从印度榕获得长度为15至25cm(从叶的基部到尖端测量的)的暗黑色叶。将IOOOgr叶样品切成l-3cm2的片并用去离子水(DIW)洗涤。将叶片与3升70%乙醇混合，并在密封容器中在黑暗中保持14天(室温)。其后，从固体分离液体，在室温保持用于进一步的使用。可选地，在烘箱中干燥叶片直到含水量为约4% (65°C持续24小时)，并将干燥的叶材料混合为粉末(700-1000微米)。然后在以下回流系统中将粉末用于提取:每次提取I小时，溶剂:70%乙醇，40°C。进行三次连续提取，每次再提取粉末。每次提取中70%乙醇的量:第一次-1: 5;第二次-1: 4;第三次-1: 3。混合三种所得的提取物，在真空滤器(40号滤纸(paper filter N0.40))中过滤。在旋转蒸发器中在真空下在60°C蒸发混合的、过滤的提取物，直到获得稳定的重量。在研磨器中进一步混合所得的粉末(最终含水量-3%)。重构粉末提取物用作调理试剂。将粉末悬浮在带有1.3% TDS w/v、最终pH为
7.4的70%乙醇中。植物提取物的成分优选地是该植物的活性成分[例如，低聚形式的黄酮类(可包括2-10聚体，例如，C26H32O15)或多聚形式的黄酮类，C23H44O4或原花色素]，其提供本文描述的典型的调理能力。此类成分可从植物提取物分离，或可合成。如上所述，本发明的调理步骤随后可以是检测步骤，其利用生化、分子或细胞/组织染色方法进行。对于检测，细胞/组织·样品可在载玻片上准备或以悬液使用。使细胞贴壁到显微镜载玻片的方法在本领域众所周知，包括例如(利用涂片或基于液体的细胞学，例如，ThinPrep )使显微镜载玻片的细胞分层，离心载玻片上的细胞(例如使用细胞离心涂片器)，在载玻片上封固组织切片(例如使用石蜡包埋切片)，或在显微镜载玻片上将细胞涂片。包括细胞样品的显微镜载玻片本身即可使用，或可用增加细胞与载玻片粘附性的物质(例如聚-L-赖氨酸或硅烷)预包被。可将载玻片加热、冷冻或使其经受特定波长的能量(例如紫外线)，以便增加细胞与载玻片的粘附性。应该注意，可在检测之前用固定剂固定泌尿系统细胞样品。固定细胞的方法在本领域众所周知，包括使用诸如多聚甲醛、戊二醛、乙酸、三氯乙酸等等固定剂。细胞悬液可在容器诸如盘、烧瓶、试管等中分析。可将细胞悬浮在DIW或TRIS缓冲盐水(TBS)中。载玻片或悬液的分析可使用主观方法进行(例如，以下实施例部分中描述的病理学家)，或通过使用利用例如光学(图像)分析软件的客观方法(例如，自动筛选)。因为本发明优选的染色方法依赖于颜色差异(正常与异常细胞之间)以及形态学差异，自动分析可利用为自动检测此类颜色差异以及颜色密度/质地、有色区域的大小、等设计的计算机算法。能够基于差异染色/颜色检测细胞的算法的一个实例是THREEC0ND。光学检测算法可与形态测定的检测算法组合，以改进结果的可靠性。
本发明方法还可包括免疫细胞学筛选的步骤。近年来，美国食品药品管理局(FDA)已经批准了对于肿瘤标志物的多种非侵入性测试。用于诊断膀胱癌的可购买获得的测试包括 ImmunoCyt/uCyt+、BTA TRAK 、BTA stat 、NMP22 、NMP22Bladder- Cliek 和UroVysionTM。如果需要,此类测试可用于进一步验证本发明方法获得的结果。细胞样品的染色是目前优选的。细胞样品的染色使用使得能够独特地或差异地染色异常细胞的染色剂(例如，染料)和条件进行。碱性染料和酸性染料、及其组合是优选的。如本文所用的,短语"差异染色(differential staining)"是指以与相同类型的正常细胞不同的颜色或色调染色异常细胞或其细胞区室(例如，细胞质)。可用于染色经调理的细胞样品的染料的实例包括但不限于，以下染料(所示目录号是来自 StainsFile (http: //stainsf ile.1nfo/StainsFile/ iindex, html):乙酉先黄13015、硝基固黄，酸性黑120470、偶氮酰氨基黑10B，酸性蓝2242755、三芳基甲烷、水蓝I，酸性蓝9342780、三芳基甲烷、甲基蓝，酸性品红42685、三芳基甲烷酸性品红，酸性绿42095、三芳基甲烷、亮绿SF浅黄，酸性绿110020、亚硝基萘酚绿B，酸性绿542095、三芳基甲烷亮绿SF浅黄，酸性品红(Acid magenta) 42685、三芳基甲烷、酸性品红(Acidfuchsin)，酸性橙1016230、偶氮橙G，酸性红414710、偶氮偶氮-曙红，酸性红2616150、偶氮二甲基苯胺丽春红，酸性红2916570、偶氮铬变素2R，酸性红4416250、偶氮丽春红6R，酸性红5145430、荧光酮赤藓红B，酸性红6626905、偶氮Biebrich猩红，酸性红7327290、偶氮Woodstain猩红，酸性红8745380、荧光酮曙红Y Ws，酸性红9145400、荧光酮曙红B，酸性红9245410、荧光酮 焰红B，酸性红9445440、荧光酮、玫瑰红，酸性红10150085、苯醌-亚胺偶氮卡红G，酸性红10350090、苯醌-亚胺偶氮卡红B，酸性品红(Acid roseine) 42685、三芳基甲烷酸性品红，酸性品红(Acid rubin)42685、三芳基甲烷酸性品红，酸性紫1942685、三芳基甲烷酸性品红，酸性黄110316、硝基萘酚黄S，酸性黄913015、硝基固黄，酸性黄2319140、偶氮酒石黄，酸性黄2410315、硝基马休黄，酸性黄3613065、偶氮间胺黄，酸性黄7345350、荧光酮荧光素，酸性黄S10316、硝基萘酚黄S，酸性黄T19140、偶氮酒石黄，吖啶橙46005、吖啶吖啶橙，吖啶黄46000、吖啶吖啶黄，阿尔新蓝74240、酞菁阿尔新蓝8GX，阿尔新黄12840、偶氮阿尔新黄，乙醇可溶性45386、荧光酮乙基曙红曙红，茜草素58000、蒽醌茜草素，茜草素蓝67410、蒽醌茜草素蓝，茜草素蓝2RC58605、蒽醌蒽蓝SWR，茜草素洋红58005、蒽醌、茜草素红S，茜草素花青素BBS58610、蒽醌茜草素花青素BBS，Alizarol花青素R43820、三芳基甲烷铬花青R，茜草素红S58005、蒽醌茜草素红S茜草素红紫素58205、蒽醌红紫素，试铝灵43810、三芳基甲烷铬紫CG，酰氨黑10B20470、偶氮酰氨基黑10B，酰氨萘酚红18050、偶氮偶氮焰红，Amidoschwarz20470、偶氮酰氨基黑10B，苯胺蓝WS-三芳基甲烷苯胺蓝WS，苯胺紫一吖嗪(Azin)苯胺紫，蒽蓝SWR58605、蒽醌蒽蓝SWR，蒽蓝SWX58610、蒽醌茜草素花青素BBS，槐黄041000、二芳基甲烷槐黄0，偶氮-曙红14710、偶氮偶氮-曙红，偶氮洋红B50090、苯醌-亚胺偶氮卡红B，偶氮洋红G50085、苯醌-亚胺偶氮卡红B，偶氮曙红G14710、偶氮偶氮-曙红，偶氮重氮537125、重氮盐固红B，偶氮重氮4837235、重氮盐固蓝B，偶氮焰红18050、偶氮偶氮焰红，伊文斯蓝23860、偶氮伊文斯蓝，天蓝A52005、噻嗪天蓝A，天蓝B52010、噻嗪天蓝B，天蓝C52002、噻嗪天蓝C，碱性蓝842563、三芳基甲烷维多利亚蓝4R，碱性蓝952015、噻嗪亚甲蓝，碱性蓝1251180、噁嗪尼罗蓝A，碱性蓝1544085、三芳基甲烷夜蓝，碱性蓝1752040、噻嗪甲苯胺蓝0，碱性蓝2042585、三芳基甲烷甲基绿，碱性蓝2644045、三芳基甲烷维多利亚蓝B，碱性棕121000、偶氮俾斯麦棕Y，碱性品红一三芳基甲烷碱性品红，碱性绿442000、三芳基甲烷孔雀绿，碱性绿552020噻嗪亚甲绿，碱性橙1446005、吖啶吖啶橙，碱性红250240、番红番红O，碱性红550040、Eurhodin中性红，碱性红942500、三芳基甲烷副品红，碱性紫242520、三芳基甲烷新品红，碱性紫342555、三芳基甲烷结晶紫，碱性紫442600、三芳基甲烷乙基紫，碱性紫1045170、若丹明若丹明B，碱性紫1442510、三芳基甲烷玫瑰苯胺，碱性黄149005、噻唑硫黄素T，碱性黄241000、二芳基甲烷槐黄0，Biebrich猩红26905、偶氮Biebrich猩红，Biebrich猩红R26105、偶氮苏丹IV，俾斯麦棕Y21000、偶氮俾斯麦棕Y，巴西红木精75280、天然巴西红木精，巴西苏木素75280、天然巴西苏木素，亮藏花精27290、偶氮Woodstain猩红，亮结晶16250、偶氮丽春红6R猩红6R，钙红60760、蒽醌核固红，洋红75470、天然洋红，胭脂红酸75470、天然洋红，二蓝光酸性红6R16570、偶氮铬变素2R，天青石蓝B51050、噁嗪天青石蓝B，中国蓝——苯胺蓝，氯冉亭坚牢28160、偶氮天狼星红(Sirius red) 4B红5B，胭脂虫红75470、天然洋红，Coelestine蓝51050、噁嗪天青石蓝B，芝加哥蓝4B—偶氮滂胺天蓝5B，铬紫CG43810、三芳基甲烷铬紫CG，铬变素2R16570偶氮铬变素2R，铬花青R43820三芳基甲烷铬花青R，刚果科林斯红22145、偶氮刚果科林斯红，刚果红22120、偶氮刚果红，棉蓝42780、三芳基甲烷甲基蓝，棉红22120、偶氮刚果红，Croceine猩红26905、偶氮Biebrich猩红，Crocein猩红3B27290、偶氮Woodstain猩红，Crocein猩红M0027290、偶氮Woodstain猩红，藏红花素75100、天然藏红花，结晶丽春红6R16250、偶氮丽春红6R，结晶猩红16250、偶氮丽春红6R，结晶紫42555、三芳基甲烷结晶紫，大丽紫42530、三芳基甲烷霍夫曼氏紫，金刚绿B42000、三芳基甲烷孔雀绿，直接蓝1423850、偶氮锥虫蓝，直接蓝5823860、偶氮伊文斯蓝，直接红22120、偶氮刚果红，直接红1022145偶氮刚果科林斯红，直接红2822120、偶氮刚果红，直接红8035780、偶氮天狼星红F3B，直接红8128160、偶氮天狼星红4B，直接黄749010、噻唑硫黄素S，耐尔晒蓝4R—偶氮耐尔晒蓝4R，耐尔晒蓝8G—酞菁耐尔晒蓝8G，曙红B45400、荧光酮曙红B，曙红浅蓝45400、荧光酮曙红B，曙红45380、荧光酮曙红Y Ws，曙红Y45380、荧光酮曙红Y Ws,曙红浅黄45380、荧光酮曙红Y Ws, Eosinol-荧光酮Eosinol，伊利石榴红B22145、偶氮刚果科林斯红，羊毛铬花青素R43820、三芳基甲烷铬花青R，赤藓红B45430、荧光酮赤藓红B，乙基曙红45386、荧 光酮乙基曙红，乙基绿42590、三芳基甲烷乙基绿，乙基紫42600、三芳基甲烷乙基紫，伊文斯蓝23860、偶氮伊文斯蓝，固蓝B37235、重氮盐固蓝B，固绿FCF42053、三芳基甲烷固绿FCF，固红B37125、重氮盐固红B，固黄13015硝基固黄，固黄extral3015、硝基固黄，固黄G13015、硝基固黄，固黑HB26150、偶氮苏丹黑B，荧光素45350、荧光酮荧光素，Foodgreen342053、三芳基甲烷固绿FCF，倍因45445、荧光酮倍因，加拉明蓝51045、噁嗪加拉明蓝，倍花青素51030、噁嗪倍花青素，龙胆紫一三芳基甲烷甲基紫2B，苏木红75290、天然苏木因，苏木精75290、天然苏木因，苏木精素75290、天然苏木精，Helio固品红BBL60760、蒽醌核固红，黑耳夫蒂斯蓝42780、三芳基甲烷甲基蓝，苏木因75290、天然苏木因，苏木精75290、天然苏木因，苏木精75290、天然苏木精，霍夫曼氏紫42530、三芳基甲烷霍夫曼氏紫，肼黄19140、偶氮酒石黄，皇家红45400荧光酮曙红B，深染蓝174240、酞菁阿尔新蓝8GX，深染黄112840、偶氮阿尔新黄，INT-四唑碘硝基四唑盐，洋红75460天然胭脂红，胭脂酮酸75460、天然胭脂红，Kernechtrot60760、蒽醌核固红，Lac75450天然紫胶酸，紫胶酸75450、天然紫胶酸，劳思氏紫52000、噻嗪硫素，亮绿42095、三芳基甲烷亮绿SF浅黄，丽丝胺固18965、偶氮丽丝胺固黄黄，丽丝胺绿SF42095、三芳基甲烷亮绿SF浅黄，Luxol固蓝一酞菁Luxol固蓝MBS，品红042500、三芳基甲烷副品红，品红142510、三芳基甲烷玫瑰苯胺，品红II—三芳基甲烷品红II，品红11142520、三芳基甲烷新品红，孔雀绿42000、三芳基甲烷孔雀绿，曼彻斯特棕21000、偶氮俾斯麦棕Y，马休黄10315、硝基马休黄，苯胺紫--吖嗪苯胺紫，苯胺紫--吖嗪苯胺紫，汞溴红一荧光酮红汞220，红汞一荧光酮红汞220,间胺黄13065、偶氮间胺黄,亚甲天蓝A52005噻嗪天蓝A,亚甲天蓝B52010、噻嗪天蓝B，亚甲天蓝C52002、噻嗪天蓝C，亚甲蓝52015、噻嗪亚甲蓝，亚甲绿52020、噻嗪亚甲绿，甲基蓝42780、三芳基甲烷甲基蓝，甲基绿42585、三芳基甲烷甲基绿，甲基紫42535三芳基甲烷甲基紫2B，甲基紫2B42535、三芳基甲烷甲基紫2B，甲基紫10B42555、三芳基甲烷结晶紫，Milling黄3G—偶氮Milling黄3G，媒染蓝343820三芳基甲烷铬花青R，媒染蓝1051030、噁嗪倍花青素，媒染蓝1451050、噁嗪天青石蓝B，媒染蓝2358610、蒽醌茜草素花青素BBS，媒染蓝3258605、蒽醌蒽蓝SWR，媒染蓝4551045、噁嗪加拉明蓝，媒染红358005蒽醌茜草素红S，媒染红1158000、蒽醌茜草素，媒染紫2545445、荧光酮倍因，媒染紫3943810、三芳基甲烷铬紫CG，萘蓝-偶氮萘蓝黑黑，萘酚蓝黑20470偶氮酰氨基黑10B，萘酚绿B10020、亚硝基萘酚绿B，萘酚黄S10316、硝基萘酚黄S，天然黑175290、天然苏木因，天然红58205、蒽醌红紫素，天然红375460、天然胭脂红，天然红475470、天然洋红，天然红858205、蒽醌红紫素，天然红1658205、蒽醌红紫素，天然红2475280、天然巴西苏木素，天然红2575450、天然紫胶酸，天然红28、一天然 地衣红，天然黄675100、天然藏红花，NBT-四唑硝基蓝盐四唑，中性红50040,Eurhodin中性红，新品红42520、三芳基甲烷新品红，尼亚加拉蓝3B23850、偶氮锥虫蓝，夜蓝44085、三芳基甲烷夜蓝，尼罗蓝51180、噁嗪尼罗蓝A，尼罗蓝A51180、噁嗪尼罗蓝A，尼罗蓝硫酸盐51180、噁嗪尼罗蓝A，尼罗红一噁嗪酮尼罗红，硝基BT-四唑硝基蓝盐四唑，硝基蓝一四唑硝基蓝四唑盐四唑，核固红60760、蒽醌核固红，油红026125、偶氮油红0，橙G16230、偶氮橙G，地衣红一天然地衣红，副品红42500三芳基甲烷副品红，Perkin' s紫--吖嗪苯胺紫，焰红B45410、荧光酮焰红B，苦味酸10305硝基苦味酸，丽春红2R16150、偶氮二甲基苯胺I 春红，I 春红6R16250、偶氮_春红6R, _春红B26905、偶氮Biebrich猩红，丽春红去二甲基苯胺(Ponceau de Xylidine) 16150、偶氮二甲基苯胺丽春红,丽春红S27195、偶氮丽春红S，滂胺天一偶氮滂胺天蓝5B蓝5B，报春花42530、三芳基甲烷霍夫曼氏紫，樱草素49000、噻唑樱草素，红紫素58205、蒽醌红紫素，派洛宁B45010、派洛宁派洛宁B，派洛宁G45005、派洛宁派洛宁Y，派洛宁Y45005派洛宁派洛宁Y，若丹明B45170若丹明若丹明B，玫瑰苯胺42510、三芳基甲烷玫瑰苯胺，玫瑰红45440、荧光酮玫瑰红，藏红花75100、天然藏红花，番红050240、番红番红0，猩红R26105、偶氮苏丹IV，猩红26105、偶氮苏丹IV，Scharlach R26105、偶氮苏丹IV，紫胶75450、天然紫胶酸，天狼星红F3B35780、偶氮天狼星红F3B，天狼星红4B28160、偶氮天狼星红4B，天狼supra—偶氮耐尔晒蓝4R蓝F3R，搔洛铬花青素R43820、三芳基甲烷铬花青R，溶性蓝-苯胺蓝，溶剂黑326150、偶氮苏丹黑B，溶剂蓝38-酞菁Luxol固蓝MBS，溶剂红2326100、偶氮苏丹III，溶剂红2426105、偶氮苏丹IV，溶剂红2726125、偶氮油红0，溶剂红4545386、荧光酮乙基曙红，溶剂黄9445350、荧光酮荧光素，醇溶性45386、荧光酮乙基曙红曙红，苏丹11126100、偶氮苏丹III，苏丹IV26105、偶氮苏丹IV，苏丹黑B26150、偶氮苏丹黑B，苏丹红BK26100偶氮苏丹III，硫黄S10316、硝基萘酚黄S，瑞士蓝52015噻嗪亚甲蓝，酒石黄19140、偶氮酒石黄，硫黄素S49010、噻唑硫黄素S，硫黄素T49005噻唑硫黄素T，硫素52000、噻嗪硫素，甲苯胺蓝52040、噻嗪甲苯胺蓝O，Toluyline红50040、Eurhodin中性红，金莲橙G13065、偶氮间胺黄，锥虫黄46000、吖啶吖啶黄，台盼蓝23850、偶氮台盼蓝，荧光素钠45350、荧光酮荧光素，维多利亚蓝4R42563、三芳基甲烷维多利亚蓝4R，维多利亚蓝B44045、三芳基甲烷维多利亚蓝B，维多利亚蓝R44040、三芳基甲烷维多利亚蓝R，维多利亚绿B42000、三芳基甲烷孔雀绿，水蓝142755、三芳基甲烷水蓝I，水溶性曙红45380、荧光酮曙红Y Ws, Woodstain猩红27290、偶氮Woodstain猩红，二甲苯胺丽春花16150、偶氮二甲基苯胺丽春红,浅黄曙红45380、突光酮曙红Y Ws0优选的染料包括碱性染料新品红、阳离子染料阿尔新蓝、和酸性染料亮绿或固绿。新品红用浓的红色染色异常泌尿系统细胞-如本文所述预调理的，而留下正常细胞以较浅、较不浓的色调的红色(浅红色或粉红色)染色。此类染色集中在细胞核和细胞质，并指示异常表型。可从不同制造商例如Sigma(目录号N0638)、Fluka(目录号72200)或Merck(目录号1052260100)获得粉末形式的新品红。新品红的优选浓度(对于固定和封片(mounted)的组织)可以是在水中2_20%[体积比(volume per volume) (v/v)]乙醇的溶液中约 0.05-0.5% (w/v)。新品红可以以约0.02% [重量体积比(weight per volume) (w/v)]、约 0.1 % (w/v)、约 0.2% (w/v)、约 0.3% (w/v)、约 0.4% (w/v)、约 0.5% (w/v)、约 0.6% (w/v)或约0.7% (w/v)的浓度使用。新品红溶液可以是基于水和/或乙醇的，并可包含约2 %乙醇、约5 %乙醇、约10 %乙醇、约15%乙醇、约20%乙醇、约25%乙醇、约30%乙醇、约35%乙醇、约40%乙醇或约50%乙醇。用新品红染色泌尿系统细胞样品可通过将新品红施加到泌尿系统细胞样品上，向泌尿系统细胞样品加入新品红，或在包含新品红的容器中浸溃、浸泡和/或培养泌尿系统细胞样品来进行。用新品红染色泌尿系统细胞样品可进行使得能够以新品红差异染色异常细胞的时间段，例如，至少5秒、至少约10秒、至少约I分钟、约1-10分钟。为了减少正常泌尿细胞的非特异性背景染色水平或为了在粘蛋白尿的情形中染色粘蛋白，本发明可使用阿尔新蓝。而且，阿尔新蓝可用作已知快速褪色的亮绿的媒染剂，使得能够延迟脱色。可从不同制造商例如Sigma(目录号5500)或Merck(目录号1052340010)获得粉末形式的阿尔新蓝。阿尔新蓝的优选浓度(对于固定和封片的组织)可以是水中约0.05-0.5% (w/V)。阿尔新蓝可以以约0.05% [重量体积比(w/v)]、约0.1 % (w/v)、约0.2% (w/v)、约 0.3% (w/v)、约 0.4% (w/v)、约 0.5% (w/v)的浓度使用。用阿尔新蓝染色泌尿系统细胞样品可通过将阿尔新蓝施加到细胞样品上或在包含阿尔新蓝的容器中浸溃、浸泡和/或培养细胞样品来进行。用阿尔新蓝染色泌尿系统细胞样品可进行使得能够减少非特异性背景、粘蛋白的染色和保护亮绿不褪色的时间段(例如，至少30秒)。 优选地，用阿尔新蓝染色在用新品红染色之后进行。
泌尿系统细胞样品可以可选地或优选地另外用亮绿或固绿染色。亮绿和固绿是酸性染料，其将正常细胞的细胞质染为绿色(留下在新品红染色后异常细胞的细胞质为红色/粉红色/紫色)。可从不同制造商诸如Merck (C.1.42095)或Sigma (目录号62110)获得粉末形式的亮绿。可从Sigma-Aldrich (F7258)获得粉末形式的固绿。亮绿可以以约0.02% [重量体积比(w/v)]、约0.1 % (w/v)、约0.2% (w/v)、约0.3% (w/v)、约 0.4% (w/v)、约 0.5% (w/v)、约 0.6% (w/v)、约 0.7% (w/v)、约 0.8% (w/V)、约 I % (w/V)、约 2% (w/V)、约 3% (w/V)、约 4% (w/V)、约 5% (w/V)、约 6% (w/v)、约7% (w/v)、约 8% (w/v)、约 9% (w/v)或约 10% (w/v)的浓度使用。亮绿溶液可以是基于水和/或乙醇的，并可包含1%乙醇、约5%乙醇、约10%乙醇、约15%乙醇、约20%乙醇、约25%乙醇、约30%乙醇、约35%乙醇、约40%乙醇、约50%乙醇、约70%乙醇。优选地，本发明方法利用的亮绿染料是20%乙醇中约4% (w/v)(用于固定和封片的组织样品时)。亮绿的浓度可以是比用于细胞学样品的低10倍(即，2%乙醇中0.4% )。固绿可以以约0.02% [重量体积比(w/v)]、约0.1 % (w/v)、约0.2% (w/v)、约
0.3% (w/v)、约 0.4% (w/v)、约 0.5% (w/v)、约 0.6% (w/v)、约 0.7% (w/v)、约 0.8% (w/V)、约 I % (w/V)、约 2% (w/V)、约 3% (w/V)、约 4% (w/V)、约 5% (w/V)、约 6% (w/v)、约7% (w/v)、约 8% (w/v)、约 9% (w/v)或约 10% (w/v)的浓度使用。固绿溶液可以是基于水和/或乙醇的，并可包含约0.01%乙醇、约5%乙醇、约10 %乙醇、约15 %乙醇、约20 %乙醇、约25 %乙醇、约30 %乙醇、约35 %乙醇、约40 %乙醇、约50%乙醇、约70%乙醇。
优选地，本发明方法利用的固绿染料是20%乙醇中约1%。用亮绿/固绿染色泌尿系统细胞样品可通过将亮绿/固绿施加到泌尿系统细胞样品上，向泌尿系统细胞样品加入亮绿/固绿，或在包含亮绿/固绿的容器中浸溃、浸泡和/或培养泌尿系统细胞样品来进行。用亮绿/固绿染色泌尿系统细胞样品进行使得能够差异染色正常细胞为绿色的时间段，例如，至少10秒、至少约30秒、至少约I分钟或约30秒至10分钟。优选地，用亮绿/固绿染色在用新品红和任选地阿尔新蓝染色后进行。用新品红和任选地阿尔新蓝染色和用亮绿/固绿染色如下进行。细胞首先用新品红染色，然后洗涤(例如，用乙醇)以除去多余的染料。细胞然后用阿尔新蓝染色并洗涤。最后，细胞用亮绿/固绿染色并洗涤(更详细的描述参见实施例1)。新品红与亮绿/固绿的共同使用由于这些染料对细胞组分的不同亲和力，提供了颜色对比(红色对比绿色)。新品红对癌细胞和癌前期细胞(如本文所述地调理的)具有更大亲和力，而亮绿/固绿对正常细胞(如本文所述地调理的)具有更大亲和力。阿尔新蓝的使用减少非特异性背景，染色粘蛋白，并阻止染料的快速褪色。如此，本发明方法使得能够基于染色差异，鉴定异常细胞以及异常细胞与正常细胞之间的差异。当使用单种染料诸如新品红时，主要被染色为暗红色或深红色的细胞在本文被鉴定为异常细胞，即，阳性结果(对于病理学)，而主要被染色为浅红色至粉红色的细胞在本文被鉴定为正常细胞，即，阴性结果。当使用双重染色方法时，主要被染色为红色(红色的任何色荫/色调(shade/tone)，例如，粉红色/浅红色至紫色或暗红色)的细胞在本文被鉴定为异常细胞，即，阳性结果(对于病理学)，而主要被染色为绿色/蓝色(绿色或蓝色的任何色荫或其组合)的细胞在本文被鉴定为正常细胞，即，阴性结果。分析了经受本文描述的调理和双重染色步骤的来自膀胱的组织样品，结果展示在以下实施例部分的实施例1中。简言之，本发明的调理和染色方法导致组织学和细胞学样品中低等级和高等级TCC细胞的几乎均匀的粉红色/红色细胞质颜色。正常尿路上皮均匀地染为绿色。相对小数目的TCC区域染为绿色或混合色(红色/绿色)，显示低的Ki67指数，与之相比，TCC的红色区域显示高的Ki67指数。用新品红和/或亮绿/固绿染色泌尿系统细胞可用苏木精(例如，苏木精Gill溶液)进一步染色约10秒至约9分钟的染色时间段，以复染细胞核。这优选地在固定后、在施加榕属植物提取物之前进行。这种染料突出了另外的细胞核超微结构特征。用于鉴定生化组分(例如，免疫染料诸如抗Ki67)或分子组分(例如，多核苷酸特异性探针)的另外的染料和染剂可用于进一步确定细胞类型、细胞状态和细胞来源(尤其是当从尿样获得时)。显微镜分析也可用于确定细胞来源的类型。肾小管上皮细胞通常比粒细胞大，包含大的圆形或卵形细胞核，并通常以小的数目脱落到尿中。来自肾盂、输尿管或膀胱的移行上皮细胞比鳞状上皮细胞具有更规则的细胞边界、更大的细胞核，和更小的总大小。肾小管上皮细胞比移行上 皮细胞更小和更圆，其细胞核占据更大的总细胞体积。如此，本发明提供调理泌尿系统细胞样品的异常细胞从而使得此类细胞更顺从于随后的检测的方法。本发明还提供独特的染色方法，其高度有效地独特地染色预调理的异常泌尿系统细胞。尽管本发明人此前已经描述了调理和双重染色细胞的基本概念，此类方法用于染色尿路上皮细胞的使用要求在调理和染色步骤二者中的校准。回到本发明的实践，本发明人发现，W02007/102146中描述的染色方法不能有效地产生尿路上皮细胞的期望的差异染色。校准这一此前描述的双重染色方法以检测异常尿路上皮细胞导致用新品红和亮绿的可观地更长的染色时间。有效的新品红染色要求的培养时间比W02007/102146中描述的那些长至少两倍，而有效的亮绿染色要求的培养时间比W02007/102146中描述的培养时间长至少五倍。本发明方法可用于伴随有异常细胞的存在的任何泌尿系统病理。使用本发明方法可鉴定的一种病理是膀胱癌。如在随后的实施例部分中描述的，本发明方法被证明在检测膀胱组织中的早期TCC方面高度有效(实施例1)。由于膀胱癌的存活机会随早期检测而显著增加，本发明方法为医师提供了对抗膀胱癌的重要的诊断工具。因此，根据本发明的另一个方面，提供了鉴定受治疗者(例如，人类)中以存在细胞异常为特征的膀胱病理的方法。优选地，此类膀胱病理是膀胱癌，且受治疗者被怀疑患有、或易感染此类病理。该方法通过将膀胱细胞(生物活检或尿细胞)与榕属植物提取物接触来进行，从而调理异常细胞用于鉴定。调理之后，用碱性和/或酸性染料(优选地用如上所述的新品红和亮绿/固绿)染色膀胱细胞。染色之后，如本文所述地主观或客观地分析细胞样品以鉴定细胞质被染色为粉红色至红色/紫色的一个或多个膀胱细胞。此类细胞被认为是异常的，并指示膀胱病理诸如膀胱癌。细胞样品然后可被进一步形态学分析或测试癌症特异性标志物的存在。组织活检可经由膀胱镜检进行。简言之，清洁和麻木受治疗者的尿道。然后将膀胱镜(例如，标准硬式膀胱镜)经尿道插入膀胱，水或盐水经膀胱镜施用并进入膀胱。随着流体装满膀胱，其拉伸膀胱壁。这使得能够观察整个膀胱壁和鉴定可疑的损伤/生长、等。然后使用膀胱镜收集和回收可疑组织的样品。尿样可从中段尿获得或在膀胱镜检期间收集。样品可被固定(例如用50%乙醇)，然后使用膜收集方法以细胞离心涂片器、或基于液体的细胞学准备方法加工。对细胞样品分析颜色和形态学二者。颜色分析如本文所述地进行，绿色细胞质颜色指示对恶性肿瘤为阴性，且粉红色至红色细胞质颜色指示对恶性肿瘤为阳性。TCC形态学标准如本领域已知地确定。简言之，低等级乳头状尿路上皮癌特征为结构上和细胞学上有序的外观。细胞是均匀地间隔和粘性的。存在极少但明确的核异型证据，其由以下组成:零散的染色过度的核、主要朝向基底的不常见的有丝分裂特征、和核大小和形状的轻微变化。高等级乳头状尿路上皮癌包含可以是粘性不良、具有大的染色过度的核的细胞。一些肿瘤细胞显示明显的退行发育。有丝分裂特征，包括异型的特征，是常见的。发育不良根据以下标准鉴定:尿路上皮极化改变、核大小变化、核拥挤。本文描述的本发明的剂可被包括在诊断试剂盒/制品中，优选地伴有指示管理机构批准用于诊断和分级膀胱癌、监测疾病复发、筛选处于风险中的患者的适当的使用说明书和标签。
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此类试剂盒可包括上述的调理和染色剂、和用于染色特定细胞制品类型(载玻片、悬液、涂片)的说明书、以及用于解释结果的说明书。还可提供提供进一步的信息、故障排除、图像数据库和诊断服务(对于上载的图像)的网址。如本文所用的，术语“约”是指±10%。应该了解，为清楚起见以单独实施方案背景阐述的本发明的某些特征，亦可以以单个实施方案来组合提供。相反地，为简洁起见以单个实施方案背景阐述的本发明的不同特征，亦可以分别提供或以任何合适的亚组合或若合适以任何其它本发明所述的实施方案来提供。除非没有这些要素实施方案不可操作，否则不应该认为以不同实施方案背景阐述的某些特征是这些实施方案的必要特征。如上所述并如以下权利要求部分中所要求保护的本发明的不同实施方案和方面，得到以下实施例的实验支持。
实施例现在提及以下实施例，其连同以上阐述一起以非限制性方式阐明本发明某些实施方案。实施例1使用本发明方法检测膀胱癌
设计研究以测试本发明方法检测具有已知病理的膀胱活检中的异常细胞的能力。本研究的目的是校准和优化本发明的染色方法的细胞调理步骤以及染色步骤，从而使得能够准确检测异常膀胱细胞，尤其是使得能够早期诊断膀胱癌。材料与方法样品收集收集来自正常膀胱、浅表膀胱癌-Ta、Tl、Tis (低等级)、和肌层浸润性癌(高等级)的膀胱活检(保存的石蜡块)，并如以下所述地调理。收到共73个样品，15个样品未包括在本研究中。收到的所有样品带有在RabinMedical Center进行的已知病理诊断。每个石蜡块由病理学实验室调理，以准备载玻片用于染色。将来自每个石蜡块的载玻片如下所述地染色，并将染色结果与样品的病理学结果比较。对于每个病例，为了比较的目的由H&E方法染色一个载玻片。H&E 染色将石蜡包埋的组织样品以4微米切片，并放置在标准显微镜载玻片上。脱石蜡如下进行:浸入二甲苯100%中，两次(各3分钟)；乙醇100%，两次(各3分钟)；浸入乙醇95%，两次(各3分钟)；DIW(3分钟)。用苏木精，Dye-1，(I分钟)染色切片，在流动自来水中洗涤直到水清澈，然后在流动DIW中洗涤10秒。然后在曙红，Dye-C，(1-2分钟)中染色切片，如上所述地在自来水和DIW中洗涤。对于滑动盖片(cover-slipping)，将切片在递增的系列乙醇浓度(50%、70%、80%、95%、100%两次)中脱水，在二甲苯100%中清洁(3-4次),然后在Permount、或相当的可购买获得的产品中封片。膀胱活检的染色染色程序在载玻片 容器中进行。使用的溶液体积对容器大小调整。对于脱石蜡，将载玻片加热到70°C持续15分钟，然后浸入二甲苯100%中，两次(各3分钟)；乙醇100%，两次(各3分钟)；乙醇95%，两次(各3分钟)；DIW(3分钟)。用苏木精(I分钟)染色切片，在流动自来水中洗涤直到水清澈，然后在流动DIW中洗涤10秒。然后将切片在植物提取物溶液中培养(4分钟)，在流动DIW中洗涤10秒，在乙醇20%中的0.5%新品红中培养(2分钟)，如上所述地洗涤，在乙醇20%中的4%亮绿中培养(4分钟)，并再次洗涤。对于滑动盖片，将切片空气干燥30分钟，浸入二甲苯100%中3次并用Entellan封片。样品分析每个染色样品如下分析:(i)细胞颜色-染为绿色/蓝色的细胞(正常细胞)、染为红色的细胞(可能的癌细胞)、或二者的存在。准备颜色的描述(主要为绿色、少量的红色细胞、等)。(ii)还进行样品中细胞的形态学分析。如以上指出的，本发明的染色方法的一个重要益处在于其允许形态学分析。进行颜色和细胞形态学的比对并记录以建立细胞形态学与细胞颜色之间的相关性。记录另外的量度，包括颜色强度、颜色浓淡、染色细胞的范围、等。针对其他研究量度(即，细胞形态学)分析这些量度。染色柃准为了最优的培养参数，使用不同浓度的染色溶液、不同染色顺序和不同培养时间校准染色方案。建立最优的参数后，为了验证可再现性产生并测试了优化的染色方法。在多轮的校准和测试后，本发明的染色方法提供了高度可重复的结果。然后校准的染色方案用于染色另外的样品。结果准备对每个病例的所得染色的详细分析，并与历史诊断以及平行染色的H&E载玻片二者比较。每个病例("H&E染色的载玻片"和使用本发明方法染色的载玻片二者)首先由专业的病理学家分析。完成分析后，将载玻片转给专家病理学家独立地回顾和分析。来自病理报告的数据用于汇编本研究的结果。表I将病例分类为疾病组，如临床程序中所示的。表1:根据临床诊断组分类的病例
权利要求
1.一种调理泌尿系统细胞用于鉴定异常细胞的方法，所述方法包括将所述泌尿系统细胞与榕属(FiCUS)植物提取物或其一种或多种成分接触，从而获得被调理用于鉴定的异常细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述榕属植物提取物是叶组织的乙醇提取物。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述格属植物是来自亚属格亚属(Urostigma)。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述格属植物是印度格(Ficuselastica)。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述鉴定通过用碱性染料和酸性染料染色经调理的泌尿系统细胞来进行，从而，所述泌尿系统细胞的异常细胞的细胞质被染为主要为粉红色到红色。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述碱性染料是新品红且所述酸性染料是亮绿或固绿。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述鉴定通过用新品红、随后用亮绿或固绿染色经调理的泌尿系统细胞来进行。
8.如权利要求7所述的方法，还包括将所述泌尿系统细胞暴露于阿尔新蓝。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述泌尿系统细胞是尿路上皮细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述泌尿系统细胞是膀胱细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述泌尿系统细胞从组织活检、尿样或尿道拭子获得。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物的一种或多种成分包括一种或多种黄酮类。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种黄酮类包括原花色素。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述泌尿系统细胞从尿样获得且所述榕属植物提取物是叶组织的乙醇提取物。
15.一种鉴定尿路上皮细胞样品中的异常细胞的方法，所述方法包括: (a)将尿路上皮细胞与榕属植物提取物或其一种或多种成分接触； (b)顺序地用碱性染料和酸性染料染色所述尿路上皮细胞；和 (c)鉴定具有高于预定的阈值的碱性染料颜色的细胞质的至少一个尿路上皮细胞，从而鉴定所述尿路上皮细胞样品中的异常细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述榕属植物提取物是印度榕的叶组织的乙醇提取物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述碱性染料是新品红且所述酸性染料是亮绿或固绿。
18.如权利要求17所述的方法，还包括暴露所述尿路上皮细胞于阿尔新蓝的步骤。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述尿路上皮细胞从尿样获得。
20.一种鉴定特征为存在细胞异常的膀胱病理的方法，所述方法包括: (a)将膀胱细胞与印度榕提取物接触，从而调理异常细胞用于鉴定； (b)用新品红和亮绿或固绿顺序地染色所述膀胱细胞；和 (c)鉴定具有高于预定的阈值的红色细胞质的至少一个膀胱细胞，从而鉴定指示所述膀胱病理的细胞异常。
21.如权利要求20所述的方法，还包括:(d)分析具有主要为粉红色至红色细胞质的所述至少一个膀胱细胞的形态。
22.如权利要求20所述的方法，还包括将所述膀胱细胞与免疫染料接触。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述免疫染料是抗Ki67免疫染料。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述膀胱病理是膀胱癌。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述膀胱癌是移行细胞癌。
26.如权利要求20所述的方法，还包括暴露所述膀胱细胞于阿尔新蓝的步骤。
27.如权利要求20所述 的方法，其中所述膀胱细胞从尿样获得。
全文摘要
本发明提供了一种调理泌尿系统细胞用于鉴定异常细胞的方法。该方法通过将泌尿系统细胞与来自榕属植物的提取物或其一种或多种成分接触来进行，从而调理异常细胞用于鉴定。还提供了用于随后检测异常细胞的方法。
文档编号G01N33/48GK103249841SQ201180055667
公开日2013年8月14日 申请日期2011年11月17日 优先权日2010年11月22日
发明者P·伊德莱维克, A·埃尔克莱斯, D·特基尔陶布, A·埃亚尔 申请人:泽蒂克科技有限公司