专利名称：一种研究血液相容性材料的蛋白质选择性吸附模型及其验证方法
技术领域：
本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及血液相容性生物材料领域中的有关血浆蛋白中的纤维蛋白原和白蛋白在材料表面选择性吸附的研究模型及其验证方法，即选择性吸附模型及其验证方法。
背景技术：
生物材料和生物器件已经广泛应用于现代医疗矫形领域，包括组织工程、人造器官、药物传递系统等，在挽救病人生命和提高生活质量方面有着重要意义，这也引发出更大的商业市场。生物相容性是生物材料植入人体时最基本和最关键的因素，也是最难实现的， 其包括组织相容性和血液相容性。血液相容性反映了生物材料与血液之间相互适应的程度。它是指生物材料与血液接触时，不引起凝血和/或溶血现象。其中，血液凝固是植入与血液接触的组织和器官时存在的主要问题。目前的血液相容性材料主要集中在医用高分子材料、二氧化钛薄膜材料和碳素材料。这三大类材料各有优点，但其血液相容性仍存在不足。研究表明，当生物材料与血液接触的时候，会引起血液一系列变化，最快的变化是血浆蛋白在材料表面的吸附及其构象的变化。生物材料与血液接触后，在材料表面上迅速形成蛋白吸附层，蛋白吸附层的组成、构象以及变性对材料的血液相容性具有重大的影响。 在血浆蛋白中，与凝血有关的蛋白主要有两种即纤维蛋白原和白蛋白，其中白蛋白的吸附有助于抑制生物材料表面凝血，而纤维蛋白原的吸附和构象变化将激活凝血因子和血小板，使血小板变形和聚集，导致凝血发生，产生级联的凝血反应，最后形成血栓。因此，材料表面蛋白吸附问题主要包括蛋白吸附总量、吸附厚度、竞争吸附、吸附过程是否可逆和蛋白构象变化等，这些问题都与生物材料的表面、界面有很大关系。生物材料的表面形貌、表面化学性质、表面电学性质和表面能是与蛋白质吸附有关的四个表面界面特征。其中表面形貌包括表面晶体结构、粗糙度和表面非均匀性。例如生物材料表面粗糙度的影响，过高的粗糙度或者十分光洁的表面都容易引起凝血，研究表明宏观光滑，微观多相分离结构的生物材料，抗凝血性能较好。表面化学性质包括表面化学成份，亲疏水性和化学组成，例如类金刚石薄膜中，SP2和SP3的比例不同，血浆蛋白在其表面的吸附性质也不一样，提高SP3成份，有利于提高白蛋白/纤维蛋白原的比率，或者说该材料优先吸附白蛋白，可能具有较好的抗凝血性能。由于在血浆中，血小板和血浆蛋白都带有负电性，所以一般生物材料表面带有一定负电荷，有利于抑制这些组分在材料表面的吸附。对于材料的表面能问题，研究人员也提出了很多学说，如表面自由能、界面自由能、临界表面张力、黏附功、极性色散比等。
发明内容
本发明提供了一种研究血液相容性材料的蛋白质选择性吸附模型及其验证方法，利用生物物理模型、表面性质测试和生物表征的检验方法，目的在于筛选血液相容性优异的生物材料，开发设计出新型的凝血或抗凝血生物材料，以及为血液接触医疗器件的表面改性方法提供理论依据。为了实现上述的发明目的，本发明提出了一种研究血液相容性材料的蛋白质选择性吸附模型；为了验证本发明中的选择性吸附模型，本发明一方面提供了模拟验证，另一方面提供了实验验证。模拟验证方法中，包括建立生物材料模型和纤维蛋白原模型，所述的方法包括(I)建立氧化锌晶体原胞，切割一个(002)表面，并且对表面进行优化；(2)将上述氧化锌表面积扩大为50 5000A2，优选500 2000A2，建立真空层厚度为 20 100人；(3)用同样的方法建立掺杂的氧化锌晶体模型，掺杂轻稀土元素的质量百分比浓度为O. 1% 20%，优选为1% 10%。(4)建立A肽非晶胞模型，进行能量、几何优化和分子动力学优化，使得A肽处于能量最低点，结构更加合理。(5)进行分层建模，将A肽添加到氧化锌或者掺杂氧化锌晶体表面，进行动力学优化，得到体系的总能量，然后分别计算出A肽和氧化锌/掺杂氧化锌晶体的能量，就可以计算出A肽与氧化锌/掺杂氧化锌晶体之间的相互作用能。相互作用能越大，A肽越容易从纤维蛋白原中脱离，表明材料表面的血液相容性越差。另一方面，为了实验本发明的目的，本发明还提供了实验验证，通过掺杂，改变生物材料表面的表面性质，对两种血浆蛋白的吸附有选择性，所述方法包括(I)采用射频磁控溅射的方法，利用纯的氧化锌陶瓷靶和掺杂轻稀土元素的氧化锌陶瓷靶，沉积氧化锌薄膜和轻稀土掺杂的氧化锌薄膜；(2)通过扫描电子显微镜(SEM)观察氧化锌薄膜表面粗糙度和颗粒度；(3)通过静态接触角测试，使用多种测试液体，如去离子水、甲酰胺等，表征氧化锌薄膜的表面性质，如静水接触角、表面能、表面粘附功、与血浆成分之间的相互作用能；(4)在生物表征方面，采用酶联免疫法测量两种重要的血浆蛋白纤维蛋白原和白蛋白在氧化锌表面的吸附量，采用血浆蛋白原的浓度为O. I 20μ g/mL，优选为I 10 μ g/mL,薄膜的表面积是I 400mm2,优选为10 50mm2 ；(5)血小板粘附实验是最终反映生物材料的血液相容性，以临床应用证明抗凝血性能较好的聚氨酯(PU)作为阴性对照样品，以抗凝血性能较差的玻璃作为阳性对照样品。 在扫描电镜下观察血小板在薄膜表面的黏附状况，如血小板的形貌(变形、尺寸、伪足等)、
聚集、数量等。在上述的验证方法中，两种血浆蛋白都经过免疫酶标记，经过染色后就可以在酶标仪上测量出溶液的吸光度值，反映出吸附蛋白的数量，吸附蛋白的数量越多，吸光度值越大。借由上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果如下(I)本发明的选择性吸附模型通过制备某些特殊表面，使其对血液中的白蛋白和纤维蛋白原具有选择性吸附性能；对白蛋白优先吸附的材料及其表面有利于抗凝血，而对纤维蛋白原优先吸附的材料及其表面有助于凝血发生；本发明可为筛选血液相容性生物材料提供理论和实验指导。(2)本发明所提出的蛋白质选择吸附模型及其验证方法，是以表面、界面和吸附理论为基础，研究材料的表面特性，以及材料与血液成分之间的相互作用，适合于包括凝血和抗凝血材料的筛选、以及为血液接触型医疗器件的设计和制备提供理论基础。
图I是血液相容性生物物理模型理论及研究方法的整体流程示意图。图2是蛋白质选择吸附模型及其验证方法的的整体流程示意图。图3是纤维蛋白原官能团A肽与氧化锌晶体表面的相互作用结构模型图。10 :稀土掺杂氧化锌结构；20 :人纤维蛋白原官能团A肽图4不同轻稀土元素钕掺杂氧化锌薄膜的SEM表面形貌图和接触角图；其中，(a)纯氧化锌薄膜；(b) Iat. %钕掺杂氧化锌薄膜；(c) 2at. %钕掺杂氧化锌薄膜；(d) 3at. %钕掺杂氧化锌薄膜。图5不同轻稀土元素钕掺杂氧化锌薄膜对纤维蛋白原(HFG)和白蛋白(HSA)的吸附实验结果对比图。
具体实施例方式请参阅图I和2所示，本发明建立一个材料表面对血浆中的白蛋白和纤维蛋白原具有选择吸附的研究模型及其验证方法，即生物材料对白蛋白/纤维蛋白原的选择性吸附模型。该选择性吸附模型以材料表面、界面和吸附理论作为理论基础，采用Materials Studio材料模拟软件的研究方法，建立不同轻稀土掺杂的氧化锌生物材料结构(稀土掺杂氧化锌结构10)表面模型和纤维蛋白原中的官能团A肽(人纤维蛋白原功能团A肽20)结构，计算生物材料表面与官能团A肽的相互作用能。所述生物材料结构模型和人纤维蛋白原官能团A肽结构是利用Materials Studio材料模拟软件的分层建模工具，将A肽和生物材料结构模型整合成一个总体结构模型，通过进行动力学优化后，得到体系的总能量、A肽结构模型和生物材料模型的分能量，从而计算出A肽与生物材料表面之间的相互作用能。在上述验证方法中，A肽是纤维蛋白原中的重要肽链，带有较强的负电荷，在静电斥力的作用下，阻止纤维蛋白原分子间聚集，所以纤维蛋白原在血浆中有较高的溶解度。当纤维蛋白原与生物材料相接触的时候，如果A肽被吸附到材料表面，而从纤维蛋白原上脱离，剩下纤维蛋白单体(fibrin monomer)之间的电荷斥力被解除，同时原来被纤维蛋白肽所掩盖的位点暴露出来，它们是与两段球状区的位点互补的，这样剩下的纤维蛋白单体借助非共价相互作用，聚集成纤维蛋白软凝块，促发凝血的发生。通过实验沉积不同轻稀土掺杂的氧化锌薄膜，改变薄膜的表面形貌、粗糙度、亲疏水性和表面能参数，采用酶联免疫法测量在薄膜表面上吸附纤维蛋白原和白蛋白的数量， 验证选择性吸附模型，通过建立生物材料对白蛋白和纤维蛋白原的选择性吸附模型，为研发新型血液相容性材料以及寻求生物材料表面改性新方法提供理论依据。以下结合附图及较佳实施例来进一步说明本发明，但本发明不局限于这些实施例，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。实施例I模拟仿真A肽与氧化锌表面的相互作用氧化锌和A肽模型的构建和分子动力学模拟主要用到Materials Studio 4· 4中的 Material VisualizerAmorphous Cell、Discover 三个模块。建立氧化锋原胞，切割一个(002)表面，接着进行表面优化，扩大表面积为1055.8 A2并建立真空层厚度为30 A。同理， 通过用钕原子取代锌原子的方式建立钕掺杂氧化锌模型，增加钕原子的数量，达到提高掺杂含量的目的。如图2和3所不,本实施例中的钕原子掺杂含量可以为lat. %>2at. %和 3at. %。建立A肽分子模型，其结构如下Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg经过能量、几何优化和分子动力学优化后，使用分层建模工具，将A肽添加到氧化锌以及氧化锌的表面上，即纤维蛋白原官能团A肽与氧化锌晶体表面的相互作用结构模型 (如图3所示)。分子动力学优化后，分别计算出体系的总能量Etrtal、氧化锌表面能量Esurf. 和A肽分子能量EFinA，最后通过公式Einterartim = Etotal- (Esurface+EFinA)计算，得到A肽与氧化锌表面的相互作用能。实施例2氧化锌薄膜的制备和表面性质的测暈采用射频磁控溅射(13. 56M Hz)的方法，在室温下制备氧化锌薄膜样品。本底真空度为3X 10_3Pa，溅射功率100W，以高纯氩气为溅射气体，溅射气压为4Pa。以单晶硅(100) 作为衬底，以纯度为99. 99%的氧化锌陶瓷靶和掺杂钕原子含量分别为lat. %,2at.
3at. %的氧化锌陶瓷靶作为溅射靶，靶材与衬底之间的距离为7cm，制备出氧化锌薄膜和钕掺杂氧化锌薄膜样品，薄膜厚度分别为250nm、303nm、310nm和290nm。制备的薄膜具有明显的(002)择优生长取向，随着钕掺杂量的增加，衍射峰强度逐渐减弱。从扫描电子显微镜图片(如图4所示)发现，掺杂前后的薄膜都呈现出连续、致密、均匀的薄膜，随着Nd掺杂量的增加，粒径逐渐减小，变得更加均匀，表明稀土 Nd掺杂有利于细化薄膜的颗粒。采用0CA20光学接触角/表面张力测量仪，在室温下测量薄膜表面的接触角，以去离子水和甲酰胺作为标准溶液，选取5个不同位置测量接触角，得出统计平均值。稀土钕掺杂氧化锌薄膜都具有疏水性，，且随掺杂浓度而变化。通过计算表面能和薄膜与血液成分之间的界面能(见下面表I)，钕掺杂后表面能和界面能都有所降低，有利于降低材料表面的活性，减少材料与组织之间的黏附。表I薄膜的表面能和薄膜与血液成分之间的界面能
掺杂摩尔含量表面能(dyn/cm)界面能；(dyn/cm)rs =rds+r"y s-bloodYs-HSATs-HFGNd-0%44.6645.1732.6240.82Nd-1%12.1526.4229.1132.39Nd-2%12.1224.9527.9230.97Nd-3%22.5730.9221 Al32.70
实施例3酶联免疫法计算血■浆蛋白在氧化锌表面的吸附暈酶联免疫法实验采用的蛋白质为人纤维蛋白原、人血清白蛋白、辣根过氧化物酶标记的羊抗人纤维蛋白原和白蛋白。使用人纤维蛋白原溶液的浓度为3 μ g/mL，选用薄膜的面积为36mm2，每块薄膜上人纤维蛋白原溶液的用量是400 μ L，在37°C孵化箱孵育2h。洗涤 3遍后，接着将辣根过氧化物酶标记的羊抗人纤维蛋白原溶液按比例稀释得到抗体溶液，每块薄膜上抗体溶液的用量也是400 μ L，在37°C下孵育样Ih，洗涤3次后就完成了免疫反应。 最后利用TMB工作液，在37°C下避光反应IOmin进行显色。加入浓度为O. 2M的硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定溶液在450nm下的吸光度(OD)值。对于白蛋白的吸附过程，与吸附纤维蛋白原相似。如图5所示，为不同轻稀土元素钕掺杂氧化锌薄膜对纤维蛋白原(HFG)和白蛋白 (HSA)的吸附实验结果对比图。实验结果表明，对于白蛋白，掺杂前后的氧化锌薄膜吸附数量的变化不明显；而对于纤维蛋白原，吸附数量随着钕的掺杂量变大而减少；随着钕掺杂含量的增加，吸附白蛋白与纤维蛋白原数量的比值增大，这表明了钕掺杂有利于增强氧化锌薄膜对白蛋白的选择性吸附过程，薄膜的抗凝血性能得到改善。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种研究血液相容性材料的蛋白质选择性吸附模型，其特征在于其包括选择性吸附模型结构及参数、模拟仿真验证方法和实验验证方法及材料体系三个部分。
2.根据权利要求I所述的蛋白质选择性吸附模型，其特征在于所述蛋白质选择性吸附模型结构及参数包括生物材料表面的粗糙度、表面能、粘附功、以及材料与血液成分之间的相互作用能；所述血液成分包括血浆、纤维蛋白原和白蛋白，进一步优选为血浆中纤维蛋白原和白蛋白两种蛋白质在材料表面的选择性吸附。
3.根据权利要求I所述的蛋白质选择性吸附模型，其特征在于所述模拟仿真验证方法采用Materials Studio材料模拟软件的研究方法,建立了轻稀土掺杂氧化锌晶体的生物材料结构模型和人纤维蛋白原官能团结构的A肽。
4.根据权利要求3所述的蛋白质选择性吸附模型，其特征在于所述生物材料结构模型和人纤维蛋白原官能团A肽的结构是利用Materials Studio材料模拟软件的分层建模工具，将A肽和生物材料结构模型整合成一个总体结构模型，通过进行动力学优化后，得到体系的总能量、A肽结构模型和生物材料模型的分能量，从而计算出A肽与生物材料表面之间的相互作用能。
5.一种研究血液相容性材料的蛋白质选择性吸附模型的验证方法，其特征在于包括以下以下的模拟仿真验证方法步骤(1)建立氧化锌晶体原胞，切割一个(002)表面，并且对表面进行优化；(2)将上述氧化锌表面积扩大为50 5000A2，优选500 2000A2，建立真空层厚度为 20 100人；(3)用同样的方法建立掺杂的氧化锌晶体模型，掺杂轻稀土元素的质量百分比浓度为O.1% 20%，优选为1% 10%。(4)建立A肽非晶胞模型，进行能量、几何优化和分子动力学优化，使得A肽处于能量最低点。(5)进行分层建模，将A肽添加到氧化锌或者掺杂氧化锌晶体表面，进行动力学优化， 得到体系的总能量，然后分别计算出A肽和氧化锌/掺杂氧化锌晶体的能量，就可以计算出 A肽与氧化锌/掺杂氧化锌晶体之间的相互作用能。
6.根据权利要求5所述的蛋白质选择性吸附模型的验证方法，其特征在于所述步骤 (3)中，建立的氧化锌晶体结构模型是保持(002)择优取向，掺杂的轻稀土元素包括镧、铈和钕等元素，掺杂的摩尔含量在O. I % 20%之间，优选为1% 10%。所建立结构模型的表面积为50 5000 A2，优选500 2000 A2，建立真空层厚度为10 200 A，优选20 100 A。
7.根据权利要求5所述的蛋白质选择性吸附模型的验证方法，其特征在于所述氧化锌薄膜采用射频磁控溅射(13.56M Hz)的方法，在室温下制备氧化锌薄膜样品本底真空度为3X 10_3Pa，溅射功率100W，以高纯氩气为溅射气体，溅射气压为4Pa。以单晶硅(100) 作为衬底，以纯度为99. 99%的氧化锌陶瓷靶和掺杂钕原子含量分别为lat. %,2at.3at. %的氧化锌陶瓷靶作为溅射靶，靶材与衬底之间的距离为7cm，制备出氧化锌薄膜和钕掺杂氧化锌薄膜样品，薄膜厚度分别为250nm、303nm、310nm和290nm。
8.根据权利要求5所述的蛋白质选择性吸附模型的验证方法，其特征在于其还进一步包括以下的实验验证方法步骤(a)采用射频磁控溅射的方法，利用纯的氧化锌陶瓷靶和掺杂轻稀土元素的氧化锌陶瓷靶，沉积氧化锌薄膜和轻稀土掺杂的氧化锌薄膜；(b)通过扫描电子显微镜(SEM)观察氧化锌薄膜表面粗糙度和颗粒度；(c)通过静态接触角测试，使用多种测试液体，如去离子水、甲酰胺等，表征氧化锌薄膜的表面性质，如静水接触角、表面能、表面粘附功、与血浆成分之间的相互作用能；(d)在生物表征方面，采用酶联免疫法测量两种重要的血浆蛋白纤维蛋白原和白蛋白在氧化锌表面的吸附量；(e)血小板粘附实验是最终反映生物材料的血液相容性，以临床应用证明抗凝血性能较好的聚氨酯(PU)作为阴性对照样品，以抗凝血性能较差的玻璃作为阳性对照样品。在扫描电镜下观察血小板在薄膜表面的黏附状况，如血小板的形貌(变形、尺寸、伪足等)、聚集、数量等。
9.根据权利要求8所述的蛋白质选择性吸附模型的验证方法，其特征在于所述步骤 (d)中的酶联免疫法采用的纤维蛋白原和白蛋白的浓度分别为O. I 20μ g/mL，优选为 I 10 μ g/mL,薄膜的表面积是I 400mm2,优选为10 50mm2。
10.根据权利要求9所述的蛋白质选择性吸附模型的验证方法，其特征在于所述酶联免疫法实验采用的蛋白质为人纤维蛋白原、人血清白蛋白、辣根过氧化物酶标记的羊抗人纤维蛋白原和白蛋白；使用人纤维蛋白原溶液的浓度为3 μ g/mL,选用薄膜的面积为36mm2, 每块薄膜上人纤维蛋白原溶液的用量是400 μ L，在37°C孵化箱孵育2h ;洗涤3遍后，接着将辣根过氧化物酶标记的羊抗人纤维蛋白原溶液按比例稀释得到抗体溶液，每块薄膜上抗体溶液的用量也是400μ L，在37°C下孵育样lh，洗涤3次后就完成了免疫反应。最后利用 TMB工作液，在37°C下避光反应IOmin进行显色。加入浓度为O. 2M的硫酸溶液终止反应， 用酶标仪测定溶液在450nm下的吸光度(OD)值；对于白蛋白的吸附过程，与吸附纤维蛋白原相似。
全文摘要
本发明公开了一种研究血液相容性材料的蛋白质选择性吸附模型及其验证方法。本发明包括模拟仿真验证和实验验证。模拟仿真验证是以生物材料结构模型和纤维蛋白原官能团A肽结构为基础，通过计算轻稀土元素掺杂的氧化锌晶体与人纤维蛋白原中A肽之间的相互作用能来实现的。实验验证方法是由在不同条件下制备出的氧化锌薄膜，通过分析薄膜表面的特征参数，结合酶联免疫法测量材料表面对纤维蛋白原和/或白蛋白的吸附量差异，验证不同表面特征的薄膜对血浆蛋白质的选择性吸附的结果。本发明所提出的蛋白质选择吸附模型及其验证方法，适合于包括凝血和抗凝血材料的筛选、以及为血液接触型医疗器件的设计和制备提供理论基础。
文档编号G01N33/00GK102590452SQ20121003097
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者何振辉, 罗平, 陈弟虎, 黄展云 申请人:中山大学