专利名称：一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明属于检测试剂盒领域，涉及兴奋剂检测试剂盒，尤其是一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒及其使用方法。
背景技术：
沙丁胺醇(Salbutamol, SAL)属于β _2兴奋剂的一种，是一种能与β _2肾上腺素能受体结合的药物，临床上主要用于治疗哮喘、支气管痉挛等。将SAL作为饲料添加剂使用，能显著促进动物生长、增加饲料转化率和瘦肉率、长期超量使用，则会在动物组织中蓄积，人食用了这种动物产品后会引发中毒。β -2兴奋剂中最常作为促生长剂使用的是克伦特罗(Clenbuterol，CL)，但随着对CL检测力度的加大，非法使用者开始转向其他替代品。由于SAL与CL的促生长作用相差不大，其在动物体内的消除时间比克伦特罗短、毒性较弱，因此，沙丁胺醇(Salbutamol， Sal)是继克伦特罗(Clenbuteix)I,CL)之后最常被滥用的一种β类动物生长促效剂。2.沙丁胺醇的促生长作用实验证实，沙丁胺醇在动物体内可通过刺激蛋白质的合成而引起纤维细胞内物质增多，体积增大及蛋白质降解减缓，同时沙丁胺醇可减少胭体的脂肪含量，减少非胭体部分的脂肪沉积。沙丁胺醇在畜禽体内的吸收速度也较快，I. 5h左右达到血药浓度的最高峰。 分布半衰期为3. 29h。对猪的实验证明，沙丁胺醇有显著的降脂作用，且肥育猪比瘦肉猪效果好。3.沙丁胺醇动物性食品残留对人体产生的危害沙丁胺醇部分在肝中降解，部分以原形从尿中排出。停药后若干大其对蛋白质、脂肪代谢的作用随即消失。因此，沙丁胺醇作为营养重分配剂常常采用混饲给药，以2_8mg/ 吨饲料饲养猪1-3月，达到促生长的效果，但同时也会造成药物蓄积，主要是在内脏、毛发、 视网膜内残留时间较久。用药后沙丁胺醇可出现在尿及身体各器官中，在肝脏中可保留十余天，而在视网膜组织中至少可保留4个月。人在食用含沙丁胺醇较高的动物组织后出现肌肉颤动、肌痈、头痛、晕眩、神经过敏、心悸、心动过速，甚至恶心、呕吐等中毒症状，此类病状可持续1-6天，一般食后15分钟-6h内出现症状，症状持续90分钟-6天，症状虽可逆， 但对有心血管病的人仍有较大危害。4.沙丁胺醇检测方法研究进展目前国外对于沙丁胺醇的残留检测技术，主要有薄层色谱技术、高效液相色谱、化学发光法、气相色谱-谱分析方法等理化分析技术以及放射性免疫、荧光免疫、酶免疫等免疫分析技术，并且均能够达到较高的灵敏度。但是理化分析方法一般耗时、成本高、操作繁琐、样品前处理复杂、难以进行大批量检测，而免疫分析技术是以抗原、抗体的特异性结合反应为基础的分析技术，它涉及抗原与抗体间的立体化学、电荷、氢键和偶极间的综合作用，因而具有常规理化分析方法无可比拟的选择和高度的灵敏度，非常适用于复杂基质中痕量组分的分析。此外，免疫分析方法还具有简便、快速的特点，因而，无疑是最具发展和应用潜力的技术之一，是在残留药物分析方面的重大创新和突破。4. I色谱法色谱技术为检测沙丁胺醇的经典技术，主要有薄层层析(TLC)，高效液相色谱 (HPLC)，高效液相色谱/三极管陈列(HPLC/PDA)，高效液相色谱/荧光(HPLC/FLU)，液相色谱-质谱联用(LC/MS)，气相色谱-质谱联用(GS-MS)，气相色谱-质用(GC-FTIP)，毛细管电泳等方法。这些方法灵敏、准确，常作为沙丁胺醇残留检测的确证方法。国内外应用HPLC 进行沙丁胺醇分析的研究报道很多。国内已经成功建立起反相高效液相色谱-荧光检测法、反相高效液相色谱-外检测法、同相苯取高效液相色谱法等SAL方法。正是由于HPLC 测方法的准确性，因而常被用于抽查工作中沙丁胺醇假阳性的确认工作。如欧盟、美国等国家将GS-MS法作为“确证法”用于沙丁胺醇检测。我国也将HPLC和GC/MS作为沙丁胺醇检测的确证法。虽然这些方法具有灵敏、准确的特点，但样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备，因此限制了其广泛应用。4. 2生物传感器检测法生物传感技术是一部生物传感器外联电脑，当前的技术可用于检测尿液、血清等样品。该检测法具有灵敏度低、精度差等缺点。4. 3免疫学检测法免疫分析是以抗原与抗体特异性、可逆结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间的立体化学、电荷、氢键和偶极间的综合作用，因而具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度，非常适用于复杂基质中痕量组分的分析，如动物组织中兽药残留的分析与检测。免疫分析技术具有敏感、特异、快速且一次能检测大量样品的特点，检测精度可达ng级。土耍有放射免疫技术(RIA)，酶免疫技术(EIA)，试纸条检测技术，其中应用最广泛的为酶免疫分析技术。目前欧盟、美国等许多检测机构都将其列为主要的“筛选法”，用于沙丁胺醇非法使用的检测。总之，在各种检测方法中，适合应用于大批检测样品的是ELISA检测方法，它具有快速、灵敏、操作简单和一次检测样品量大的特点，而且可以直接对尿液、血液样品进行检测，与HPLC、GC/MS有较高的相符率，而且非常适合活体动物的检测。而HPLC和GC/MS方法均需要昂贵的仪器、复杂的样品处理程序以及专门的操作技能，且比较费时，因此不适合用做大批样品的检测，但其有效性、准确性和敏感性，使其仍有ELISA方法不能替代的优势。 目前，进行检测时，一般应用ELISA试剂盒进行筛检，再用HPLC和GC/MS等方法对阳性样品进行确认，从而可确保检测结果的可靠性。酶联免疫吸附测定(ELISA)方法作为一种筛选方法，具有简便、快速、灵敏、成本低的特点，因此，在现场监控和基层的大规模筛选检测中，免疫学检测方法更实际，有广阔的应用前景。我公司通过混合酸酐法将沙丁胺醇与卵清蛋白(OVA)合成免疫原，用偶联免疫原免疫绵羊制备多克隆抗体抗体，并用硫酸铵沉淀法初步纯化，用亲和层析法进一步纯化用ELISA方法进行鉴定，酶标抗原采用戊二醛二步法将辣根过氧化物酶和盐酸克伦特罗半抗原交联而成。用所得抗体和酶标抗原建立直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测沙丁胺醇，最低检测限为O. lng/mL·
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种使用范围广、使用方便、检测准确的沙丁胺醇酶联免疫试剂盒及其使用方法。本发明的目的是这样实现的一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒，组成如下包括包被板、校准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液， 浓缩提取液，所述包被板为孔底包被有抗沙丁胺醇多克隆抗体；包被量为I μ g/ml,包被温度 4°C过夜；所述校准品为不同浓度的系列校准品；所述酶标记物工作液含有标记HRP的盐酸克伦特罗半抗原，为过碘酸钠法将HRP 同盐酸克伦特罗半抗原结合；所述底物液A为过氧化氢脲溶液、B为TMB溶液；所述终止液为2M硫酸。而且，所述浓缩洗涤液为20X浓缩洗涤液，使用前以蒸馏水按照I : 19v/v的比例稀释，混匀后使用。而且，所述浓缩提取液20X浓缩提取液，使用前以蒸馏水按照I : 19v/v的比例稀释，混匀后使用。而且，所述包被板的包被步骤如下A)抗体包被用抗沙丁胺醇多克隆抗体最佳包被浓度包被酶标板，IOOul/孔，4°C 过夜，最佳包被量为I μ g/ml,O. 05M pH9. 6 CBS作为稀释液用于包被固相载体；B)洗板将孔内液体甩干，用洗漆液250 μ I/孔充分洗漆4_5次,每次间隔IOs,用吸水纸拍干；C)封闭将1% BSA+10% sucrose封闭液加入酶标板，IOOul/孔，37°C温育2小时，将孔内液体甩干，用吸水纸拍干，真空干燥，加铝箔袋真空封装。一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒的使用方法，步骤如下(I)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；(2)取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入铝钼袋，保存于2_8°C ；(3)洗涤液在使用前也需回温；(4)编号将样本和校准品对应微孔按序编号，每个样本和校准品做2孔平行，并记录校准孔和样本孔所在的位置；(5)加校准品/样本加入校准品/样本50 μ I到对应的微孔中，随即加入酶标记物50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置25°C避光环境中反应30min ；(6)洗板小心揭开封板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μ I/孔充分洗涤4-5 次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；(7)显色加入显色液100 μ I/孔，底物A液和底物B液I : I混匀，轻轻振荡混勻，用封板膜封板后，置25 °C避光环境中反应15min ；(8)测定加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值；
(9)结果所获得的校准和样品吸光度值的平均值除以第一个校准的吸光度值再乘以100。本发明的优点和积极效果是I、本发明制备的试剂盒可用于尿液样或血清、肌肉或组织、饲料、牛奶等样品中沙丁胺醇残留量的快速定量检测，具有使用范围广、使用方便、检测准确的优点。2、本发明制备的试剂盒的灵敏度为O. lppb，精密度批内变异系数(CV% )，CV%
<10% ;批间变异系数(CV%)，CV%< 15% ;准确度以回收率表示准确度，回收率应在 70%-110%之间。IC50范围在O. 6-1. Oppb之间，线性相关系数Ir :不小于O. 9900。3、本试剂盒成功的将沙丁胺醇抗原与载体蛋白0VA，通过混合酸酐法使SAL与OVA 偶联合成免疫抗原SAL-0VA。4、本发明通过免疫绵羊和纯化技术得到了高纯度的多克隆抗体。5、本发明采用戊二醛二步法将辣根过氧化物酶和盐酸克伦特罗半抗原交联而成酶标记抗原。6、本试剂盒的开发和建立，依托成熟的ELISA液体系统平台，经查阅大量的参考文献，并参考国内外同类试剂盒，经大量的实验和体系的优化，最终确立了试剂盒的生产和反应条件。
图I为本发明单克隆抗体制备程序；图2为本发明沙丁胺醇抑制曲线；图3为本发明沙丁胺醇尿液基质抑制曲线。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明试剂盒的测定原理为试剂盒采用直接竞争抑制ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被抗体,样本中残留的沙丁胺醇和酶标抗原竞争抗沙丁胺醇抗体,用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物沙丁胺醇的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中沙丁胺醇的含量。一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒，其组成如下本试剂盒是由包被板、校准品、高浓度校准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液 B、终止液、20X浓缩洗涤液，20X浓缩提取液，具体见表I。表I试剂盒组成成分表
权利要求
1.一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒，其特征在于组成如下包括包被板、校准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液，浓缩提取液，所述包被板为孔底包被有抗沙丁胺醇多克隆抗体；包被量为I μ g/ml,包被温度4°C过夜；所述校准品为不同浓度的系列校准品；所述酶标记物工作液含有标记HRP的盐酸克伦特罗半抗原，为过碘酸钠法将HRP同盐酸克伦特罗半抗原结合；所述底物液A为过氧化氢脲溶液、B为TMB溶液；所述终止液为2M硫酸。
2.根据权利要求I所述的沙丁胺醇酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为 20X浓缩洗涤液，使用前以蒸馏水按照I : 19v/v的比例稀释，混匀后使用。
3.根据权利要求I所述的沙丁胺醇酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓缩提取液20X 浓缩提取液，使用前以蒸馏水按照I : 19v/v的比例稀释，混匀后使用。
4.根据权利要求I所述的沙丁胺醇酶联免疫试剂盒，其特征在于所述包被板的包被步骤如下A)抗体包被用抗沙丁胺醇多克隆抗体最佳包被浓度包被酶标板，IOOul/孔，4°C过夜，最佳包被量为I μ g/ml,O. 05M pH9. 6 CBS作为稀释液用于包被固相载体；B)洗板将孔内液体甩干，用洗漆液250μ I/孔充分洗漆4-5次,每次间隔IOs,用吸水纸拍干；C)封闭将1%BSA+10% sucrose封闭液加入酶标板，IOOul/孔，37°C温育2小时，将孔内液体甩干，用吸水纸拍干，真空干燥，加铝箔袋真空封装。
5.一种如权利要求I所述的沙丁胺醇酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于步骤如下(1)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；(2)取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入铝钼袋，保存于2-8°C；(3)洗涤液在使用前也需回温；(4)编号将样本和校准品对应微孔按序编号，每个样本和校准品做2孔平行，并记录校准孔和样本孔所在的位置；(5)加校准品/样本加入校准品/样本50μ I到对应的微孔中，随即加入酶标记物 50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置25°C避光环境中反应30min ；(6)洗板小心揭开封板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μ I/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；(7)显色加入显色液100μ I/孔，底物A液和底物B液I : I混匀，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后，置25°C避光环境中反应15min ；(8)测定加入终止液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值；(9)结果:所获得的校准和样品吸光度值的平均值除以第一个校准的吸光度值再乘以100。
全文摘要
本发明涉及一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒及其使用方法，组成如下包括包被板、校准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液，浓缩提取液。本发明制备的试剂盒可用于尿液样或血清、肌肉或组织、饲料、牛奶等样品中沙丁胺醇残留量的快速定量检测，具有使用范围广、使用方便、检测准确的优点。本发明制备的试剂盒的灵敏度为0.1ppb，精密度批内变异系数(CV％)，CV％＜10％；批间变异系数(CV％)，CV％＜15％；准确度以回收率表示准确度，回收率应在70％-110％之间。IC50范围在0.6-1.0ppb之间，线性相关系数|r|不小于0.9900。
文档编号G01N33/543GK102608310SQ201210038858
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者钟凯 申请人:天津康利缘生物工程有限公司