专利名称：一种利用人泪液快速检测糖尿病的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种利用人泪液快速检测糖尿病的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
糖尿病是一种慢性新陈代谢疾病，主要是因为胰腺的P细胞分泌胰岛素不足或者分泌出来的胰岛素不能发挥应有的作用，不能将吸收的葡萄糖带入细胞内有效地转化为我们日常所需的能量，也不能将这些葡萄糖有效地储存起来，导致过多葡萄糖在血液中积聚，使血糖升高。按照世界卫生组织(WHO)及国际糖尿病联盟(IDF)专家组的建议，糖尿 病可分为I型、2型、其它特殊类型及妊娠糖尿病4种。新版《糖尿病图集》的数据表明，到2010年，全世界将有2. 85亿糖尿病患者，糖尿病患病率在20-79岁人群组中将达到6. 6%。而其中的70%主要来自低、中收入国家。2010年糖尿病患者个人的糖尿病相关费用平均将达到703美元，根据MS统计数据显示，2009年全球糖尿病药物的销售额在超过300亿美
J Li o据卫生部调查，我国目前至少有3400万糖尿病患者，约占人口总数的2. 6%。而在30年前，这个数字仅为0. 7%。另据世界卫生组织预测，到2025年，全球将有3亿名糖尿病患者，而中国很可能会成为糖尿病“第一大国”。目前用于诊断糖尿病的手段主要是血糖检测，包括空腹血糖、随机血糖和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。OGTT检测是目前国际上公认的确诊糖尿病的金标准。在这个测试中，人必须空腹来喝葡萄糖浆，并在2个小时后采集血液样本进行检测。这个复杂的检测程序使糖尿病的诊断成为一项艰巨而繁琐的过程。目前，临床上建议不再使用口服葡萄糖耐量试验来检测糖尿病,而采用空腹血糖来监测和诊断糖尿病。126mg/dL或更大的空腹血糖浓度是诊断糖尿病的阈值，这个阈值和影响眼睛、神经、肾脏的糖尿病并发症的风险增加有关。对于这样的测试，病人仍然需要空腹抽血，忍受用注射器针头获得血液样本来检测空腹血糖水平。血液样本通常会被送到专门的实验室进行检测，它通常需要一两天才能取得检测结果。如果检测结果表明，病人的空腹血糖浓度为126mg/dL或更高，就需要进行第二次检测，以确认诊断。虽然空腹值可以很容易地在例行就诊时获得，即使诊所就在工作的地方，或其他情况下，空腹检测仍可能不方便，不舒服和麻烦。因此，仍需要为一种快速筛查糖尿病的方法，以便可以减轻病人的不适和不便。医学研究发现眼泪含有蛋白质、小分子和矿物质等20多种物质。眼泪中含有葡萄糖的报告最早在1932年面世，而眼泪中的葡萄糖含量，与血液中的葡萄糖含量维持一个固定的比率。2005年，美国印第安纳州眼科研究所的查特吉博士对200名糖尿病患者进行了研究，他发现，眼泪中的糖分含量可以非常准确地反映出血液中的糖分水平。不仅如此，当人体的血糖含量发生变化时，眼泪中的糖分含量也会相应地改变。据报道，印度Kolkata地区眼科学研究所的P. R Chatterjee教授及其同事开展了一项随机研究，对在门诊就医的200名糖尿病患者的血液与和泪液中葡萄糖水平的相关性进行了观察性分析，并定量测定了血葡萄糖水平，同时用葡萄糖氧化酶试条(DX)测试。Chatterjee教授强调指出，91. 2%患有不同程度高血糖症的病人其泪滴中的葡萄糖呈阳性颜色反应，与血糖水平非常一致。在接受葡萄糖耐受试验的患者中，血液和泪滴中的葡萄糖水平具有一定的平行关系。本发明正是基于泪液和血液中葡萄糖水平的平行正相关关系，眼泪糖分检测的费用要远远低于血液检测，而且也不会给患者带来生理和心理的压力。非常适合早期诊断糖尿病和发现发生糖尿病高风险者，并对他们进行及时的干预和规范化治疗，可以减少糖尿病的发病人数和延缓糖尿病并发症的发生和发展，从而减少社会的疾病和经济负担。
发明内容
本发明提供了一种微创伤糖尿病快速检测试剂盒，利用人泪液快速筛查糖尿病，大大降低了检测成本，避免了口服葡萄糖浆和扎针抽血给病人带来的痛苦和不便。
一方面，本发明提供了一个快速检测糖尿病的试剂盒，该试剂盒包括两个泪液收集装置和一种泪液葡萄糖快速检测试剂。其中所述泪液，需要在不同的时间采集两次，即第一个时刻采集的第一个泪液样本和给予糖负荷后的第二个时刻采集的第二个泪液样本，这两次泪液的采集需要用两个相同类型的(但不是同一个)泪液收集装置。在一个实施方式中，所述泪液收集装置包括水凝胶条、毛细管和/或水凝胶隐形眼镜中的一种或多种。所述泪液葡萄糖快速检测试剂包括一个受体和一对示踪物，其中所述受体能够和葡萄糖发生可逆性结合反应，当受体与葡萄糖可逆性结合时，产生一个可检测的光学信号，所产生的可检测光学信号具有葡萄糖浓度依赖性，该可检测的光学信号来源于受体相关的一个或更多示踪物。该光学信号可使用分光光度计进行检测，主要检测450nm处的吸光度。测量泪液中葡萄糖的浓度，关键是要找到能够与葡萄糖有较强的亲和力，而与其它的分子几乎没有亲和力的一种物质。能与葡萄糖发生相互作用产生共价键的蛋白质，主要有两种，它们分别为半刀球蛋白A与右旋糖苷(以下用其英文Con A/dextran代替)以及D-葡萄糖和D-半乳糖结合蛋白(以下用其英文GGBP代替)。两种蛋白质与葡萄糖分别有弱吸附以及强吸附，虽然两种蛋白质对于葡萄糖的吸附都是特异性吸附，但两者之间有一定的差别，首先从吸附的效果来说，GGBP高于Con A/dextran，另外从对于葡萄糖的识别效果而言，由于Con A/dextran组成的混合物其对于葡萄糖作用的位点不固定，可能出现在这个混合物许多地方，而由于GGBP是人为的由大肠杆菌通过蛋白质改性后生成的。通过大肠杆菌改性后获得的GGBP，其与葡萄糖作用的位点是可以控制的，根据制备过程中的差异，其由大肠杆菌生成的GGBP可以有不同的类型，如K137GGBP，A213GGBP和E149GGBP等，GGBP前面的字符代表了蛋白质发生变性的部位。当GGBP吸附了葡萄糖后，其空间形状会发生一定的变化，从而将葡萄糖分子包裹在其中。通常GGBP通过使用埃希氏大肠杆菌中的染合体片断构造而成，在使用PCR技术使得其数量不断扩大，最后从大肠杆菌中分离出来。其中受体可包括D-半乳糖/D-葡萄糖结合蛋白(GGBP)、刀豆素A、无活性的葡萄糖氧化酶、无活性的葡萄糖脱氢酶和硼酸中的一种或多种，在一个优选的实施方式中，首选的受体是GGBP，更优选的是该GGBP是E149C定点突变的，以提高其与葡萄糖结合的特异性。本发明中使用的GGBP蛋白，并非野生型蛋白，而是经过E149C和/或G74C定点突变后的蛋白，定点突变后的蛋白，比野生型蛋白稳定，在常温下保持活性的时间也更长。现在已经知道大量合适的示踪物。例如，所述示踪物可能是一种荧光示踪物。“荧光示踪物”是指包括至少一个荧光基团，当其连接到一个分子上时，便可促使这种分子通过荧光检测手段检测。典型的荧光示踪物包括异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-dextran)、夹氧杂蒽染料、荧光染料、罗丹明B型染料和菁型染料，等等。一个荧光基团也可以作为荧光蛋白，例如藻胆蛋白的。在本专利中，所述一对示踪物，其中一个是荧光能量供体，能够产生一个可检测的光学信号，该光学信号具有葡萄糖浓度依赖性，另一个是荧光能量受体或非荧光能量受体。可检测的光信号可能是由一对突光基团衍生出来的，即第一突光基团和第二突光基团。这两个荧光基团中的一个是能量供体，例如第一荧光基团，在其吸收光谱的激发波长激发的能量，并发出在其发射光谱波长的能量；其它的荧光基团可能是能量受体，例如第二荧光基团，接受供体发出波长受体的吸收光谱范围内的能量和发射能量在波长内受体的发射光谱。供体荧光最大吸收波长比受体荧光最大吸收波长较短，和供体荧光最大发射波长是比受体荧光最大发射波长更短。据报道，能量转换效率取决于几个因素，如供体的发射光 谱和受体的吸收光谱，供体和受体荧光之间的空间距离相对取向，供体和受体荧光量子产率之间的光谱重叠，供体的供应量和激发态的寿命。其中上述能量接受荧光基团可以通过一个非荧光能量转移受体，例如，如接受内受体的吸收光谱的能量在波长发出由供体荧光的染料取代，但不在荧光或发光的形式发出能量。荧光示踪物本质是受体的一部分。例如，一个受体可以是一个融合蛋白，其中包括至少荧光蛋白的荧光部分和至少一种受体蛋白的结合部分。另外，荧光示踪物可以是荧光标记的，而不是受体天然相关，但它是由一种化学链接的方式，如共价键。本发明一个优选的实施方式，以四甲异硫氰酸D-半乳糖D-葡萄糖结合蛋白(TRITC-GGBP)作为受体，异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-dextran)作为淬灭基团。FITC-dextran与TRITC-GGBP结合，FITC荧光通过荧光共振能量转移猝灭TRITC。当增加葡萄糖浓度时，FITC-dextran就会被释放，并发出荧光，这个荧光强度和葡萄糖浓度是成正比的。GGBP与葡萄糖的结合具有高度的专一性和亲和性，对天然的GGBP进行一些遗传改造，使其更加适应葡萄糖检测的需要是非常必要的。所以根据实验的需要对GGBP进行遗传改造。GGBP缺少半胱氨酸残基，通过定点突变引入半胱氨酸残基，可以赋予GGBP通过巯基与荧光探针、其它化学发光剂以及载体结合的能力。在远离裂缝的位点进行E149C突变，在GGBP上引入巯基，增加它的可结合位点，将大大提高GGBP蛋白质与葡萄糖的结合能力。改造后的GGBP蛋白质的特性由经过改造的多个突变位点共同作用影响。通过商业化的试剂盒来完成GGBP蛋白质的培养、提取、突变、纯化和检验。另一方面，本发明提供了一个快速筛查糖尿病的方法，该方法包括以下步骤①首先利用第一个泪液收集装置来收集病人的第一个泪液样本；②通过测定特定数量的第一个泪液样本来确定第一个葡萄糖浓度；③然后给患者投喂一定量糖负荷；④在给患者投喂糖负荷后的50分钟内，使用第二个泪液收集装置来收集第二个泪液样本；⑤通过测定特定数量的第二个泪液样本来确定第二个葡糖糖浓度；⑥将第二个的葡萄糖浓度和第一个的葡萄糖浓度进行对比，以确定患者是否具有患糖尿病的可能性。
其中泪液收集装置可包括水凝胶条、毛细管和/或水凝胶隐形眼镜中的一种或多种。且第一个泪液收集装置和第二个泪液收集装置是相同的。本发明中，所述糖负荷是指40克葡萄糖加200毫升水。即给待检测患者口服含有40克葡萄糖的葡萄糖浆。第二个泪液样本的采集时间，或者说第二个葡萄糖浓度的测定时间，是在给患者口服糖负荷15分钟后测定的，最好不要超过口服糖负荷后50分钟。本发明中，糖尿病检测的结果是这样判定的利用上述泪液糖尿病快速检测试剂盒，测量两个时刻的葡萄糖浓度，如果第二个葡萄糖浓度比第一个葡萄糖浓度高，则表示患者已经患有糖尿病或有发展为糖尿病的风险。总而言之，本发明的试剂盒具有以下有点(I)使用泪液为检测样本，是一种微创伤的检测方式，大大减轻了病人的痛苦和心理压力；
(2)检测特异性高，由于使用了定点突变的GGBP，大大提高了检测特异性；(3)操作简捷，准确率高，这是因为避免了间接放大信号过程中产生的各种误差，从而使检测的假阳性和假阴性都同时降低；(4)检测快速省时，避免了使用二抗与酶联底物等物质放大信号的步骤。
图I正常患者和糖尿病患者口服糖负荷后，每15分钟采集的泪液样本中的葡萄糖浓度比较。
具体实施例方式实施例I :泪液快速检测糖尿病的试剂盒使用方法使用对葡萄糖有特异性吸附的D-半乳糖/D-葡萄糖结合蛋白(GGBP)，研究泪液葡萄糖检测的方法。实验中针对不同的GGBP蛋白配置了不同浓度的葡萄糖溶液，其中GGBPE149C(E149C为突变位点)有最高的灵敏度，在测量葡萄糖水溶液浓度0. 5mg/L-5mg/L时有较好的线性。I. E149C定点突变GGBP的制备GGBP通过使用埃希氏大肠杆菌中的染色体片断构造而成，使用PCR技术使得其数量不断扩大，最后从大肠杆菌中分离出来。通过商业化的试剂盒来完成GGBP蛋白质的培养、提取、突变、纯化和检验。2. GGBP的荧光标记GGBP的TRITC、FITC荧光标记依标记试剂盒(Qiagen)操作手册进行，吸取lmg/mlGGBP 25ul至200ul pH = 7. 0的磷酸盐溶液中，温和反应45min，4°C终止反应10min，G_25柱分离纯化洗柱-平衡-过样收集-检测。3.泪液中葡萄糖含量检测利用第一个泪液收集装置收集患者第一个泪液样本，分析一定数量的第一个泪液样本确定第一个葡萄糖浓度；给患者投喂糖负荷；在给患者投喂糖负荷后50分钟内，第二个葡萄糖浓度是在患者被投喂糖负荷15分钟后测定，用第二个泪液收集装置收集第二个泪液样本，分析一定数量的第二个泪液样本确定第二个葡萄糖浓度；将第二个葡萄糖浓度和第一个葡萄糖浓度进行比较。4.结果分析使用荧光分光光度计,分别检测第二个泪液样本和第一个泪液样本反应后荧光信号强度。实施例2 :临床样本的检测试验 在给空腹患者投喂40克糖负荷前，用一个微毛细管试管收集空腹患者泪液样本。投喂糖负荷后每15分钟采集同一个患者的泪液样本。投喂糖负荷后180分钟采集最后一滴泪液样本。已经对12个患者进行了筛查，其中3名是正常的，9名是糖尿病患者。利用改良后的Amplex Red Assay (包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和荧光底物)试剂盒对这些泪液样本的葡萄糖浓度进行测定。图I显示正常人和糖尿病患者每15分钟的泪液葡萄糖值(+标准差)的平均值。在第15分钟，正常人和糖尿病患者之间有明显的差异。在30，45和60分钟正常人和糖尿病患者之间具有决定性的统计学差异。
权利要求
1.ー种利用人泪液快速检测糖尿病的试剂盒及其使用方法。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括两个泪液收集装置和泪液葡萄糖检测试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于其中所述两个泪液收集装置是相同的，包括水凝胶条带、毛细管、软水凝胶隐形眼镜中的一种或更多。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于其中所述泪液葡萄糖检测试剂包括一个受体和一对示踪物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中所述受体能够和葡萄糖发生可逆性结合反应，当受体与葡萄糖可逆性结合时，产生ー个可检测的光学信号，所产生的可检测光学信号具有葡萄糖浓度依赖性，该可检测的光学信号来源于受体相关的ー个或更多示踪物。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中所述ー对示踪物，即第一示踪物和第二示踪物，第一和第二示踪物中的一个是荧光能量供体，另ー个是荧光能量受体或非荧光能量受体。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中所述受体为D-半乳糖D-葡萄糖结合蛋白(GGBP)、刀豆素A、无活性的葡萄糖氧化酶、无活性的葡萄糖脱氢酶和硼酸的ー种或多种结合。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于其中所述荧光能量供体包括异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-dextran)、夹氧杂蒽染料、荧光染料、罗丹明B型染料、菁型染料和藻胆蛋白中的一种或更多。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于荧光能量供体是共价或非共价结合在受体上的，形成发光基团-受体-淬灭基团的三明治结构。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于其中所述GGBP是经过E149C定点突变的。
11.ー种利用人泪液快速检测糖尿病的方法，首先利用第一个泪液收集装置收集患者的第一个泪液样本，分析一定数量的第一个泪液样本，确定第一个葡萄糖浓度；给患者投喂糖负荷；在给患者投喂糖负荷后50分钟内，用第二个泪液收集装置收集第二个泪液样本，分析一定数量的第二个泪液样本，确定第二个葡萄糖浓度；将第二个葡萄糖浓度和第一个葡萄糖浓度进行比较，以确定患者发展为糖尿病的可能性。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于其中所述第二个葡萄糖浓度是在患者被投喂糖负荷15分钟后测定的。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于其中所述糖负荷是指40克葡萄糖加200晕升水。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于如果第二个葡萄糖浓度比第一个葡萄糖浓度高，则显示患者已经患有糖尿病或有发展为糖尿病的风险。
全文摘要
本发明名称为一种利用人泪液快速检测糖尿病的试剂盒，属于生物医药领域。所述试剂盒中包括泪液葡萄糖检测试剂及其快速检测试剂盒的使用方法。所述泪液葡萄糖检测试剂包括一个受体和一对示踪物，其中所述受体能够和葡萄糖发生可逆性结合反应；所述一对示踪物，其中一个是荧光能量供体，能够产生一个可检测的光学信号，该光学信号具有葡萄糖浓度依赖性，另一个是荧光能量受体或非荧光能量受体。所述糖尿病快速检测试剂盒灵敏度高，特异性强，对人体微创伤，检测费用低，可用于早期诊断糖尿病和发现糖尿病高风险者，减少糖尿病发病人数和延缓糖尿病并发症的发生和发展，从而减少社会的疾病和经济负担。
文档编号G01N21/64GK102798619SQ20121025943
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者张开山, 苏广宇, 高阳, 刘艳省 申请人:杭州华得森生物技术有限公司