专利名称：化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒，属于化学发光法以及体外诊断检测领域。
背景技术：
丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus, HCV)呈球形，直径小于80nm(在肝细胞中为36 40nm，在血液中为36_62nm)，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。丙型肝炎病毒可引起丙型肝炎主要经输血，针刺，吸毒等传播。HCV感染通常是持续性的终生感染，抗体检测是一个非常有效的方法。但因感染HCV后，抗HCV出现较慢，一般情况下，抗体的血清学转换可以延迟到暴露后几个月才发生，此时可发生抗HCV的假阴性(也就是说在抗体可检出之前或在血清学转换之中即所谓的“窗口期”)，故在早期诊断丙肝感染上有困难。HCV核心抗原检出时间早于抗体，HCV-cAg检测可作为HCV抗体检测的补充试剂。目前丙型肝炎的检测方法主要有三类1.丙型肝炎抗体检测其缺点是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2-26周的潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口期可延长至6-9个月或更长。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检，机体感染HCV后，在抗HCV抗体出现之前约2周左右，血循环中即可出现病毒颗粒，此时丙型肝炎病毒HCV的RNA经PCR方法检测可为阳性，血液具有感染性，而用抗体检测方法根本无法测出。2.丙型肝炎病毒HCV核酸检测感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即可检测到HCV-RNA。因此，HCV核酸检测(HCV RT-PCR检测)可用于丙型肝炎的早期诊断，并且通过对病毒拷贝数的定量检测可对其临床疗效进行监测。因为PCR法检测HCV-RNA影响因素较多，在样本收集、储存和检测方面都有严格的要求，并且PCR的检测操作过程复杂、费时。3.丙型肝炎抗原检测丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的l-2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。与RT-PCR方法相比具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒，主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。最主要解决的问题是缩短窗口期，可用于早期急性丙型肝炎诊断。本发明采用化学发光法，直接标记抗原联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体。该发明建立双抗夹心的基础之上，在这里，样品中的抗原抗体首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abl、丙型肝炎病毒重组抗原AgI捕获。在洗掉样品的其它部分，再加入HRP标记物(HRP标记抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI1、丙型肝炎病毒重组抗原AgII)，就可以形成单克隆抗体Ab1-丙型肝炎病毒抗原-单克隆抗体AbII HRP标记物复合物与重组抗原Ag1-丙型肝炎病毒抗体-重组抗原AgII HRP标记物复合物，洗板加入A液、B液，用化学发光分析仪测量发光值，发光值与样本中抗原抗体总浓度呈正相关，与临界值相比较，从而判断阴阳性。与现有技术相比，本发明具 有以下突出优点1.本发明采用丙型肝炎抗原抗体联合检测大大缩短窗口期。现阶段丙型肝炎的检测一般是检测丙型肝炎抗体其缺点是感染丙型肝炎病毒后，有2-26周的潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口期可延长至6-9个月或更长。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检。本发明采用丙型肝炎抗原检测，丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的l-2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。本发明应用联合检测能够将抗原与抗体检测的优势据发挥出来，且本发明具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断。2.本发明是采用先进的化学发光法。化学发光法灵敏度高、线性范围宽、标记物的有效期长、无放射性危害。本发明的技术方案是在进行检测前需完成下列准备工作首先制备包被板，所用的包被板为特异性抗原抗体包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条的制备包括以下步骤(I)将纯化的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abl、丙型肝炎病毒重组抗原AgI用50mmol/L碳酸盐缓冲液稀释，稀释至O. 1_10 μ g/ml，然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条；(2)将丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。其次是丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测HRP标记物的制备，包括以下步骤取5mgHRP溶于1. Oml NaHCO3溶液，充分溶解HRP。加入适量O. 06M NaIO4 ;室温避光搅拌30分钟。移入透析袋，用O. 01M，pH9. 6碳酸盐缓冲液透析过夜。取纯化标记原料(抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abll、丙型肝炎病毒重组抗原AgII按照质量比为1: 1混合)511^，用0.01现的NaHCO3,溶液充分溶解，与酶液混合，装入透析袋，用O. 01M, pH9. 6碳酸盐缓冲液4°C避光透析24小时，换液4次。取透析后结合液，加入O. 2ml 0.4% NaBH4搅拌30分钟后，4°C放置4小时。将透析液上S印hadex G-200层析柱，用O. 01M, PH7. 2的PBS洗脱，收集第一个的洗脱峰，稀释为HRP标记物工作液后2-8°C保存备用。检测操作过程I)试剂的准备2)丙型肝炎病毒抗原抗体阴阳性对照品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴封片。
3)水浴4)洗板。5)加入标记物工作液6)水浴孵育7)洗板8)加 A 液，B 液 9)测值10)与临界值比较后判断结果。
具体实施实例I制备包被板，所用的包被板为特异性抗原抗体包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条的制备包括以下步骤(I)将纯化的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI用50mmol/L碳酸盐缓冲液稀释至3 μ g/ml、丙型肝炎病毒重组抗原AgI用50mmol/L碳酸盐缓冲液稀释至6 μ g/ml,然后将两种包被液按照1:1比例混合后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条；(2)将丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。2丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测酶标记物的制备，包括以下步骤取5mg HRP溶于1. OmlNaHCO3溶液，充分溶解HRP。加入适量O. 06M NaIO4 ;室温避光搅拌30分钟。移入透析袋，用O. 01M, pH9. 6碳酸盐缓冲液透析过夜。取纯化标记原料(抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abll、丙型肝炎病毒重组抗原AgII按照质量比为1:1混合)5mg，用O. OllM的NaHCO3,溶液充分溶解，与酶液混合，装入透析袋，用O. 01M, pH9. 6碳酸盐缓冲液4°C避光透析24小时，换液4次。取透析后结合液，加入O. 2ml 0.4% NaBH4搅拌30分钟后，4°C放置4小时。将透析液上S印hadex G-200层析柱，用O. 01M, PH7. 2的PBS洗脱，收集第一个的洗脱峰，稀释为HRP标记物工作液后2-8°C保存备用。4. HCV抗原抗体阴阳性对照品的制备5. 20X浓缩洗涤液6. A液的制备。7. B液的制备。8.检测操作过程I)试剂的准备2)丙型肝炎病毒抗原抗体阴阳性对照品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴封片。3)水浴4)洗板。5)加入标记物工作液6)水浴孵育7)洗板
8)加 A 液，B 液9)测值10)与临界值比较后判断结果。
权利要求
1.“化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体”，其特征在于如下检测原理本发明采用化学发光法，联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体。该发明建立双抗夹心的基础之上，在这里，样品中的抗原抗体首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abl、丙型肝炎病毒重组抗原AgI捕获。在洗掉样品的其它部分，再加入HRP标记物(HRP 标记抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abll、丙型肝炎病毒重组抗原AgII)，就可以形成单克隆抗体Ab1-丙型肝炎病毒抗原-单克隆抗体AbII HRP标记物复合物与重组抗原Ag1-丙型肝炎病毒抗体-重组抗原AgII HRP标记物复合物，洗板加入A液、B液，用化学发光分析仪测量发光值，发光值与样本中抗原抗体总浓度呈正相关，与临界值相比较，从而判断阴阳性。
2.化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体检测试剂盒，其特征在于包括盒体，设在盒体内的包被板和设在盒体内试剂及不干胶封片和使用说明书。
3.根据权利要求2所述包被板，其特征在于包被板上包被的是抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体与丙型肝炎病毒重组抗原，制备工艺是将包被抗体用包被缓冲液稀释作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭。
4.根据权利要求3所述包被缓冲液，其特征在包括Tris-HCl缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求2所述设在盒体内试剂，其特征在于所述试剂包括HRP标记物(HRP 标记抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI1、丙型肝炎病毒重组抗原AgII) ,HCV抗原抗体阴性对照品、HCV抗原抗体阳性对照品、A液、B液、20X浓缩洗涤液。
6.根据权利要求5所述HRP标记物，其特征在于制备方法为取5mgHRP溶于1. Oml NaHCO3溶液，充分溶解HRP。加入适量O. 06M NaIO4 ;室温避光搅拌30分钟。移入透析袋，用·0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液透析过夜。取纯化标记原料(抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体 Abll、丙型肝炎病毒重组抗原AgII按照质量比为1:1混合)5mg，用·O. OllM的NaHCO3，溶液充分溶解，与酶液混合，装入透析袋，用O. 01M, pH9. 6碳酸盐缓冲液4°C避光透析24小时， 换液4次。取透析后结合液，加入O. ·2ml 0.4% NaBH4搅拌30分钟后，4°C放置4小时。将透析液上S印hadex G-200层析柱，用O. 01M, PH7. 2的PBS洗脱，收集第一个的洗脱峰，-20°C 保存备用。
全文摘要
本发明公开了化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒。本发明通过分析丙型肝炎病毒序列而得到2株抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体(AbI，AbII)，2种丙型肝炎病毒重组抗原(AgI，AgII)，且2株抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体与2种丙型肝炎病毒重组抗原之间两两不发生交叉反应。使用其中的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI、丙型肝炎病毒重组抗原AgI作为包被原料，其中的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbII、丙型肝炎病毒重组抗原AgII作为标记原料，用双抗体夹心法检测丙型肝炎病毒抗原，用双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗体。
文档编号G01N21/76GK103018455SQ20121037696
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者张年 申请人:张年