专利名称：检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法
技术领域：
本发明属于生物技术和农作物病虫害防治领域，涉及一种检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，尤其是一种检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的分子检测方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌产生的Cry毒素是目前转基因作物中应用最为成功的抗虫基因。Cry毒素毒杀昆虫的机制有两种假说。第一种假说认为Cry毒素经中肠蛋白酶水解活化，并与中肠特异性受体结合，毒素亚基低聚，在膜上形成孔洞结构，导致细胞膨胀和裂解，进而造成昆虫死亡；另一种假说则认为毒素的毒性与低聚化无关，毒素与中肠特异性受体蛋白结合后，激活了 Mg2+依赖的信号通路，干扰细胞骨架和离子通道的稳定性，最终导致细胞死亡。以上两种假说均认为Cry毒素与中肠受体的结合能力是其毒力表现的关键因素。
害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性分子机制了解的基础上建立起来的。前人研究表明，与敏感品系相比，棉铃虫、烟蚜夜蛾等鳞翅目昆虫抗性品系中肠Bt结合蛋白与Bt毒素的结合能力下降(即杂交膜结合位点亮度减弱)。二化螟Chilo suppressalis是我国水稻上危害最为严重的害虫之一,至今一直依赖化学农药对其进行防治。化学农药的大面积使用不仅带来了害虫抗药性，次要害虫再猖獗等不利现象，而且引起了一系列的食品安全问题。转基因抗虫水稻的成功研制，为二化螟的综合防治提供了经济而有效的途径。虽然目前仍无有关二化螟Bt抗性品系的报导，但随着转基因水稻的推广，使得二化螟在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的高压选择，存在产生抗性的危险。目前有关二化螟抗药性的监测大都局限于生物测定，生物测定本身的局限性是这种常规的检测方法不能检测早期抗性和低频率抗性等位基因。生物测定方法普遍存在的缺点还有(1)灵敏度低。生物测定检测早期抗性和低频率抗性等位基因，尤其是抗性等位基因是隐性或不完全隐性；(2)周期长。生物测定结果一般需要24小时以上，对特殊作用方式的杀虫剂需要更长时间，如内吸性杀虫剂、生长调节剂和取食阻断剂等；(3)对试虫要求高。生物测定不但需要大数量的试虫,而且要求试虫生长整齐划一,很难直接由田间获得。在二化螟Bt蛋白快速检测技术想需求日益上升之际，一种分子检测方法显得十分重要，而普通的生物测定检测方法根本不能满足这些要求。
发明内容
本发明的目的是克服现有的生物测定方法的缺陷，提供一种检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的分子检测方法。上述目的是通过以下技术方案实现的一种检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，该方法包括以下步骤(I) 二化螟中肠刷状缘膜囊泡的提取收集二化螟幼虫中肠，依次加入匀浆缓冲液、蛋白酶抑制剂和20-30mM MgCl2溶液，匀浆、离心提取1_5次，将离心后的沉淀风干，力口入溶解缓冲液，得中肠蛋白溶液；
(2)双向电泳分离利用蛋白质纯化试剂盒纯化中肠蛋白溶液，纯化后的蛋白溶解于上样缓冲液，离心，上清液加入聚焦盘中，IPG胶条按正负极方向反向置于上清液中，覆盖适量矿物油，设置等电聚焦程序，在聚焦好的胶条槽内加入平衡缓冲液冲洗胶条，冲洗完毕后进行SDS-PAGE电泳；(3)酶联免疫反应=SDS-PAGE电泳结束后，将切下的胶在转膜缓冲液中浸泡20_60分钟，同时将超厚滤纸、印迹膜浸入转膜缓冲液中浸泡5-10分钟，按超厚滤纸-凝胶-印迹膜-超厚滤纸的顺序于电转仪上转膜，转膜完成的印迹膜浸入5%PBST脱脂牛奶中常温封闭1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，然后加入30ml PBST缓冲液、10-15 μ I生物素标记的CrylAc毒素，常温下反应1_5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，最后再加入30mlPBST缓冲液、5-10 μ I碱性磷酸酶-生物素抗体，常温下反应1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，应用BCIP/NBT显色试剂盒进行显色，拍照得杂交膜显色照片；(4)photoshop软件分析应用photoshop软件得出杂交膜照片上结合蛋白点的平均灰度值和平均像素值，与敏感品系的二化螟杂交膜显色照片对比，判断待测二化螟品系是否产生抗药性，其中，步骤(I)所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为甘露醇250-350mM、EGTA 5-lOmM、tris-HCl 15_20mM、PMSF l_2mM，所述匀浆缓冲液和MgC12溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的3-10倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的0.01-0. I倍。步骤(I)所述的溶解缓冲液中各成分的浓度为甘露醇150mM、EGTA 2. 5mM、tris-HCl 8. 5mM作为优选方案，步骤(I)所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为甘露醇300mM、EGTA 5mM, tris-HCl 17mM、PMSF ImM。作为优选方案，所述匀浆缓冲液和MgC12溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的4. 5倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的O. 04倍。作为优选方案，步骤(I)中所述的匀浆、离心提取的次数为3次。作为优选方案，步骤(3)中所述的生物素标记的CrylAc毒素的加入量为12. 5 μ 1，所述的碱性磷酸酶-生物素抗体的加入量为6 μ I。采用上述优选方案能进一步提高检测的灵敏度和准确性。本发明与现有测定方法相比，其优点和积极效果表现为(I)灵敏度高。低频率抗性等位基因的存在和筛选压力，是产生高水平抗性的关键因子，而生物测定监测方法是一种粗放的检测方法，不能检测早期抗性和低频率抗性等位基因，因此很难应用生物测定监测方法进行抗药性风险预测。本发明根据二化螟对CrylAc产生抗性后出现的靶标变异，设计酶联免疫反应体系，通过对结合位点亮度的度量，可以初步确定某个种群敏感性变异情况，为抗药性监测、抗药性治理和害虫综合防治提供直接的证据。(2)准确性好。生物测定的方法要求试虫标准化，虫体之间的差异对结果影响很大，造成结果的不稳定性。而本发明基于蛋白质互作的检测方法，由于酶联免疫方法日渐成熟和智能化发展迅速，在一定程度上减少了这种不稳定性。另外，生物测定方法中测定一条标准曲线至少需要500头标准试虫，从田间直接采回生长一致的标准试虫并进行生物测定实验难度极大，不能在第一时间检测田间种群敏感性。本发明对一个种群的检测仅需要100头试虫，且允许生长发育不一致。(3)周期短。生物测定检测方法至少需要24小时的观测时间，二本发明从样品提取到酶联免疫检测完成最多需要8小时的工作时间，就可以得到理想的结果。
图I是本发明实施例中二化螟中肠CrylAc结合蛋白的杂交显色图。
具体实施例方式实施例I一种检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，该方法的步骤为 I、二化螟中肠BBMV的提取(I)将收集的中肠样品从超低温冰箱中取出，置于冰上解冻。待中肠解冻后，用镊子小心将中肠取出放入玻璃匀浆器中。(2)加入 9 倍中肠体积的勻衆缓冲液 Buffer A (300mM mannitol+5mM EGTA+17mMtris-HCl+IMm PMSF)、l/25中肠体积的蛋白酶抑制剂(P. I. , Roche, Germany)于玻璃勻衆器中，并于冰上匀浆。匀浆结束后转入50ml离心管中，置于冰上。(3) 4 °〇冰箱取出，取加入9倍中肠质量体积的24mM MgCl20(4)置于冰上静置Ιδπ η。(5)离心(Heal Force, Neofuge 15R), 4°C，2500 转 / 分钟，15min。(6)离心后的上清液转入一新的50ml离心管中，沉淀中加入二化螟幼虫中肠体积
4.5倍的BufferA,4. 5倍的MgCl2、0. 04倍的P. I.，混匀后冰上静置15min。(7)离心(Heal Force, Neofuge 15R), 4°C, 2500 转 / 分钟，15min。(8)重复6、7步骤I次。(9)将收集的上清液配平,离心(Beckman, AVANTI J_E), 4°C, 30000g, 40min。(10)弃上清液，将沉淀置于冰上晾干。(11)取适量预冷的溶解缓冲液Buffer B (150mM甘露糖醇+2. 5mM EGTA+8. 5mMtris-HCl, ρΗ=7·5)溶解蛋白。(12)蛋白质浓度测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定蛋白浓度。(13)分装，备用。2、双向电泳体系(I)蛋白纯化试剂盒(Bio-rad)纯化蛋白。(2)离心(Heal Force, Neofuge 15R), 13200 转 / 分钟，4°C, 5min,去上清。将离心管倒置在滤纸上，空气风干，不超过5min。(3)向沉淀中加入上样缓冲液，即300 μ I IEF溶液(尿素2. lg、硫脲0. 76g、CHAPS
0.2g，用水定容至 5πι1)、6μ I DTT 溶液(98mg，用水定容至 200ul)、L 5μ I Bio-Lyte、
1.5μ I 1% 溴酚蓝，充分混匀，离心(Heal Force, Neofuge 15R)，22 °C，3000 转 / 分钟，5min。(4)取出 IPG 胶条(BI0_RAD，llcm，pH 3-10)，室温放置 lOmin。
(5)将聚焦盘(Bio-Rad)卡到等电聚焦仪(Bio-Rad)上，将样品沿聚焦盘的边缘由左至右线性加入。(6)用镊子轻轻去除IPG胶条上的保护层。(7)轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘样品溶液上，使胶条的正极对应聚焦盘正极，并确保胶条与电极的紧密接触。(8)每根胶条上覆盖l_2ml矿物油(Bio-Rad)。(9)对好正负极，盖好盖子，设置等电聚焦程序。等电聚焦程序与胶条长度有关。聚焦程序主动水化3h·
被动水化50V，12h250V 线性升压 2h ；1000V 快速升压 2h ；8000V 线性升压 3h ；8000V 至 40000Vh 为止；500V 保持。(10)聚焦结束后，取出胶条，使胶面朝上放于2层大滤纸上，吸干矿物油及多余样品O(11)胶条转移至溶胀盘(bio-rad)中，加入适量的平衡缓冲液I (O. 12g DTT溶于6ml胶条平衡母液中；胶条平衡母液尿素36g, SDS 2g，PH8. 8Tris_HCl 25ml，甘油20ml,用MilliQ水定容至100ml，)，摇床轻微震荡12min。(12)用镊子小心取出胶条，使胶面朝上放于2层大滤纸上，吸干缓冲液。(13)胶条转移至溶胀盘中，加入适量的平衡缓冲液II (O. 15g碘乙酰胺溶于6ml胶条平衡母液中)，摇床轻微震荡12min。( 14)用镊子小心取出胶条，使胶面朝上放于2层大滤纸上，吸干缓冲液。(15)胶条转移至溶胀盘中，加入适量电泳缓冲液。(16)配置SDS-PAGE胶。待凝结后于上样槽加入O. 5%低熔点琼脂糖封胶液(低熔点琼脂糖 O. 5g，Tris - Base O. 303g，甘氨酸 I. 44g，10%SDS lml, 1% 溴酚蓝 100 m 1，定容至 100ml。)。( 17)将胶条从样品水化盘中取出，用镊子将胶条缓慢插入未凝固的琼脂糖封胶液中。(18)开始SDS-PAGE电泳，上层胶100V下层胶缓慢升至300V。当溴酚蓝到达标记处，停止电泳。3、酶联免疫反应(I)将切下的SDS-PAGE胶片浸泡在转膜缓冲液(tris-base 5. 82g，甘氨酸
2.93g, SDS O. 375g,甲醇 200ml，用水定容至 1L)中 20_60min。(2)将超厚滤纸，印迹膜浸入转膜缓冲液中约5-10min。(3)将滤纸，印迹膜，PAGE胶按从上而下超厚滤纸、胶、印迹膜、超厚滤纸的顺序剪切一样大小，放入电转仪(Bio-Rad Trans-Blot SD)中。(4)开通电转仪 15V,60min。
(5)配制 PBST 缓冲溶液(8gNaCl，3. 58gNa2HP04,0. 2gKCl，0. 24g KH2PO4, lml 吐温-20，加水定容至1L)，然后将脱脂奶粉加入上述PBST缓冲溶液中，配成质量浓度为5%的脱脂牛奶溶液。转膜完成后，将印迹膜浸入上述5%的脱脂牛奶溶液中，常温封闭2h。(6) PBST 洗膜，IOminX 3 次。(7)加入 30ml PBST+12. 5μ I biotin-CrylAc (Roche) (I μ g/ul)，常温 2h。(8) PBST 洗膜，IOminX 3 次。(9)加入 30ml PBST+6 μ I AP-anti biotin (Roche) (I μ g/ul),常温 2h。(10) PBST 洗膜，IOminX 3 次。(11)加入IOml显色液(BCIP/NBT显色试剂盒，Roche),暗室显色lOmin。 4、显色图片的分析检测显色结束后，立即拍照，将照片导入photoshop软件(V 7.0)，使用“图像”工具栏读出蛋白杂交点的平均灰度值和平均像素值，与敏感品系的二化螟杂交膜显色照片对比，判断待测二化螟是否产生抗药性。本发明经过多年的重复试验，已成功利用双向电泳反应体系-酶联免疫反应体系首次成功鉴定到二化螟中肠CrylAc结合蛋白。经质谱测定，二化螟中肠CrylAc结合蛋白为碱性磷酸酶(ALP)和氨肽酶(APN)。采集湖北孝感田间二化螟幼虫，带回室内后一部分个体用于解剖中肠，剩余个体用于品系饲养，获得第二代初孵幼虫。同时，收集室内敏感品系的二化螟幼虫，按同样的方法得到中肠和第二代初孵幼虫。以孝感品系和室内敏感品系的第二代初孵幼虫为材料，采用传统的生物测定法测定两品系对CrylAc的敏感性，以致死中浓度(LC50)为衡量指标；同时，以孝感品系和室内敏感品系中肠为材料，采用实施例I中的具体步骤，检测两品系中肠BBMV中CrylAc结合蛋白与毒素的结合能力，以平均灰度值和平均像素为衡量指标。如表I所不，生物测定的结果显不，孝感品系和室内敏感品系对CryIAc的LC50值分别是28. Img (ai)/L和18.3 mg (ai)/L，差异在一倍以内，属于敏感性无差异的范畴；结合力检测结果显示，室内敏感品系和孝感品系的蛋白杂交点的平均灰度值分别为200. 94和203. 90，两品系杂交蛋白点的平均像素值分别为2498和2621，均属于敏感性无差异的范畴。上述结果说明，本方法所得结果与传统生物测定方法所得结果一致。表I. _■化[ 貝孝感品系和敏感品系对CryIAc的敏感性比较。
生物测定方法分子检测方法 品系--
LCq甲.位nig(ai)/L 平均灰度值平均像素 室内敏感品系28.1200,942498 孝感品系18.3203.90262权利要求
1.一种检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，该方法包括以下步骤 (O 二化螟中肠刷状缘膜囊泡的提取收集二化螟幼虫中肠，依次加入匀浆缓冲液、蛋白酶抑制剂和20-30mM MgCl2溶液，匀浆、离心提取1_5次，将离心后的沉淀风干，加入溶解缓冲液，得中肠蛋白溶液； (2)双向电泳分离用蛋白质纯化试剂盒纯化中肠蛋白溶液，纯化后的蛋白溶解于上样缓冲液，离心，上清液加入聚焦盘中，IPG胶条按正负极方向反向置于上清液中，覆盖矿物油，设置等电聚焦程序，在聚焦好的胶条槽内加入平衡缓冲液冲洗胶条，冲洗完毕后进行SDS-PAGE 电泳； (3)酶联免疫反应=SDS-PAGE电泳结束后，将切下的胶在转膜缓冲液中浸泡20-60分钟，同时将超厚滤纸、印迹膜浸入转膜缓冲液中浸泡5-10分钟，按超厚滤纸-凝胶-印迹膜-超厚滤纸的顺序于电转仪上转膜，转膜完成的印迹膜浸入质量浓度为5%的脱脂牛奶溶液中，常温封闭1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，然后加入30ml PBST缓冲液、10-15 μ I生物素标记的CrylAc毒素，常温下反应1_5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，最后再加入30ml PBST缓冲液、5_10 μ I碱性磷酸酶-生物素抗体，常温下反应1_5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，应用BCIP/NBT显色试剂盒进行显色，拍照得杂交膜显色照片; (4)photoshop软件分析应用photoshop软件得出杂交膜照片上结合蛋白点的平均灰度值和平均像素值，与敏感品系的二化螟杂交膜显色照片对比，判断待测二化螟是否产生抗药性， 其中，步骤(I)所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为甘露醇 250-350mM、EGTA 5_10mM、tris-HCl 15_20mM、PMSF l_2mM， 所述匀浆缓冲液和MgCl2溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的3-10倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的O. 01-0. I倍， 步骤(I)所述的溶解缓冲液中各成分的浓度为甘露醇 150mM、EGTA 2. 5mM, tris-HCl 8. 5mM。
2.如权利要求I所述的检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，其中，步骤(I)所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为 甘露醇 300mM、EGTA 5mM、tris_HCl 17mM、PMSF ImM。
3.如权利要求I或2所述的检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，其中，所述匀浆缓冲液和MgCl2溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的4. 5倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的O. 04倍。
4.如权利要求I所述的检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，其中，步骤(I)中所述的匀浆、离心提取的次数为3次。
5.如权利要求I所述的检测二化螟对CrylAc毒素抗药性的方法，其中，步骤(3)中所述的生物素标记的CrylAc毒素的加入量为12. 5 μ 1，所述的碱性磷酸酶-生物素抗体的加入量为6 μ I。
全文摘要
本发明公开了一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，该方法包括二化螟中肠刷状缘膜囊泡的提取、双向电泳分离、酶联免疫反应、显色后拍照并进行photoshop软件分析等步骤。与现有技术相比，本发明具有灵敏度高、准确性好、检测周期短等优点，可以初步检测某个二化螟种群对Cry1Ac毒素敏感性变异情况，为二化螟抗药性监测、治理和害虫综合防治提供直接的证据。
文档编号G01N33/68GK102914659SQ201210413030
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者马伟华, 陈龙佳, 邱琳, 侯蕾蕾, 张宗磊, 张志林, 牛林 申请人:华中农业大学