专利名称：基于dna电荷传递量子点电化学发光电极的制备方法
技术领域：
本发明涉及在金电极表面直接连接量子点帽化的双链DNA电化学发光传感器的制备方法，属于电化学发光领域。
背景技术：
近年来，由于电化学发光方法不仅具有化学发光灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点，而且具有电化学分析控制性强、选择性好等优点，已应用于药物分析、 环境分析、免疫分析和DNA分析等方面。
目前，纳米技术己经广泛渗透到化学、生物、医学、材料、电子等学科领域，形成了一个融前沿基础学科和高科技为一体的完整体系。半导体纳米晶粒，即量子点是一种新兴的发光材料，有着独特的发光性质和光学稳定性，其发光性质与表面状态和尺寸有着较大的关系。量子点的合成方法主要包括沉淀法、水热合成法、微波辅助法、模板法、电沉积法等。但是在目前的研究报道中，多为采用利用一定的方法直接在电极上连接量子点作为检测传感器，而关于利用量子点的发光信号变化对DNA电荷传递的影响研究报道很少见。另外，目前，硒化镉量子点修饰的电化学发光传感器的制备主要包括将已经制备好的水溶性硒化镉量子点直接滴涂到电极表面、通过层层自组装将已经制备好的水溶性的硒化镉量子点组装到碳纳米管修饰的玻碳电极上和 通过核素_亲和素将硒化镉量子点连接到电极表面等方法(参见 a) Guifen Jie, Lingling Li, Chao Chen, Jie Xuan, Jun-Jie Zhu., Biosens. Bioelectro, 2009, 24, 3352. b) Xiaofei Hu, Rongyue Wang, Yi Ding, Xiaoli Zhang, Wenrui Jin., Talanta, 2010, 80, 1737. c) Yanfen Li, Lili Liu, Xuelin Fang, Jianchun Bao, Min Han, Zhihui Dai. , Electrochimica Acta, 2012, 65, I. d) Teng Wang, Shengyi Zhang, Changjie Mao, Jiming Song, Helin Niu, Adv., Biosens. Bioelectro, 2012, 31, 369. e)Xuelin Fang, Min Han, Guofei Lu, Wenwen Tu, Zhihui Dai. , Sensors and Actuators B, 2012, 168, 271.)。以上这些方法，均为利用一定的方法在电极上连接量子点制作检测传感器，本发明的研究较为独特。发明内容
本发明旨在提供金电极表面直接连接量子点帽化的双链DNA电化学发光传感器的制备方法，主要用于研究持久性有机污染物对DNA的损伤作用。其创新点在于，利用量子点的发光变化研究DNA电荷传递作用的机理，进而研究持久性有机污染物对DNA的损伤。
基于DNA电荷传递量子点电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤
I)双链dsDNA的杂交将冷冻保存的两条单链ssDNA储备液在摇床中室温融化， 两条单链 ssDNA 的序列分别如下5’-SH-GACTGACCTCGGACG 和 5’-NH2_CGTCCGAGGTCAGTC。 分别取相同摩尔数的ssDNA储备液混合，将混合液于90°C恒温水浴5min，自然环境中冷却至室温，形成杂交的双链dsDNA，_20°C冷冻保存备用；
2) ImM 6_巯基己_1_醇MCH的配制首先配制质量百分比浓度为5%的甘油磷酸缓冲液，然后用上述甘油磷酸缓冲液配制ImM 6-巯基己-I-醇MCH;
3) CdSe量子点的合成将CdC12和巯基乙酸TGA混合后，用NaOH调节pH至10，注入硒源得到亮黄色澄清溶液，其中Cd2+:TGA:Se2+的摩尔比为1:2. 5:0. 5。将所得的亮黄色澄清溶液于100°C冷凝回流4h，并将产物离心，所得的上清液即为量子点溶液，4°C避光保存；
4)金电极在绒布上打磨至表面光滑成镜面，依次在水-丙酮-水中分别超声，以去除电极表面的无机物和有机物；其中水的参数为以下，电阻率18.2，总有机碳< 10，颗粒物< Ι/ml，微生物< I ;
5)以表面清洗干净的金电极为工作电极，钼丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用循环伏安方法在硫酸溶液中活化电极，活化40圈后结束立即取出电极，用水冲洗， 备用;
6)滴加dsDNA和MgC12的混合液在金电极表面,室温下保湿自组装16h,此电极记为dsDNA/Au电极；
7)电极的清洗用移液枪移取5mM pH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到dsDNA/Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作，以除去未连接牢固的dsDNA分子；
8)电极表面的封闭在清洗后的dsDNA/Au电极的表面滴加ImM 6_巯基己_1_醇 MCH,室温下保湿组装Ih ；
9)电极的清洗用移液枪移取5mM pH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到dsDNA/Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作，以除去电极表面未连接牢固的MCH， 此电极记为MCH封闭的dsDNA/Au电极；
10)DNA与量子点的连接在量子点溶液中加入乙基-3-二甲基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS得到混合溶液，其中EDC和NHS的质量比例为2:1，将MCH 封闭的dsDNA/Au电极浸入混合溶液中，反应30min。
11)将电极冲洗干净，置于 O. IM ρΗ=7· 4 PB + O. IM K2S2O8 + O. IM KCl 溶液中，以修饰好的电极作为工作电极，以钼丝为对电极，以甘汞电极为参比电极进行循环伏安扫描， 并用光电倍增管PMT收集光信号。
上述实验用水的参数为以下，电阻率18. 2，总有机碳彡10，颗粒物< 1/ml，微生物< I。
与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果
本发明在活化的金电极上直接连接dsDNA后再连接CdSe量子点，所制备的电极可以直观的研究DNA的电荷传递作用，并且具有良好的电化学发光性能，条件温和。
图I为实施例I和对比例I所制备的电极的电化学发光曲线；
曲线a对应实施例I、曲线b对应对比例I ;
图中，电化学发光强度/V为电化学发光信号，电位/V为相对于甘萊参比电极的电压；
图2为实施例2和对比例2所制备的电极的电化学循环伏安曲线；CN 102928489 A书明说3/4页
曲线a对应实施例2、曲线b对应对比例2 ；
由图一及图二对比可知，电化学发光的效果比现有的电化学方法灵敏度高。
图3量子点电化学发光电极的制备过程示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步的说明。
实施例I :
I)双链dsDNA的杂交将冷冻保存的两条单链ssDNA储备液在摇床中室温融化， 两条单链 ssDNA 的序列分别如下5’ -SH-GACTGACCTCGGACG 和 5’ -NH2_CGTCCGAGGTCAGTC。 分别取相同摩尔数的ssDNA储备液混合，将混合液于90°C恒温水浴5min，自然环境中冷却至室温，形成杂交的双链dsDNA，_20°C冷冻保存备用；
2) ImM 6_巯基己-I-醇MCH的配制首先配制5%的甘油磷酸缓冲液用5. OmM pH=7. O磷酸盐缓冲液定容，定容后振荡器上震动均匀，保存备用；然后配制ImM MCH:用配置好的甘油磷酸缓冲溶液定容，定容后振荡器上震动均匀，保存备用；
3) CdSe量子点的合成将CdCl2和巯基乙酸TGA混合后，用NaOH调节pH至10，注入硒源，硒源是在氮气氛围下，通过Se粉与NaBH4之间的反应来获得，最终保持Cd2+:TGA: Se2+ 的摩尔比为1:2. 5:0. 5。将所得的亮黄色澄清溶液于100°C冷凝回流4h，并将产物离心，所得的上清液即为量子点溶液，4°C避光保存；
4)金电极在绒布上打磨至表面光滑成镜面，依次在水-丙酮-水中分别超声 3min,以去除电极表面的无机物和有机物；其中水的参数为以下，电阻率18. 2，总有机碳 (10，颗粒物< Ι/ml，微生物< I ;
5)以表面清洗干净的金电极为工作电极，钼丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用循环伏安方法在O. 5mol/L H2SO4溶液中活化电极，电位范围为-O. 3 1.5V，速率为O. 1V/S，活化圈数为40圈；活化结束立即取出电极，用水冲洗，氩气吹干；
6)滴加 25μ dsDNA 在金电极表面，其中 dsDNA 为 25μ dsDNA+2. 5μ IM MgCl2 的混合液，室温下保湿自组装16h，此电极记为dsDNA/Au电极；
7)电极的清洗用移液枪移取20μ 5mM pH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到dsDNA/ Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作10次，以除去未连接牢固的 dsDNA分子；
8)电极表面的封闭在dsDNA/Au电极的表面滴加25PL ImM 6_巯基己_1_醇MCH， 室温下保湿组装Ih ；
9)电极的清洗用移液枪移取20μ 5mM pH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到dsDNA/ Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作10次，以除去电极表面未连接牢固的MCH，此电极记为MCH封闭的dsDNA/Au ；
10)DNA与量子点的连接在量子点溶液中加入乙基_3_ 二甲基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC混合均匀后加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS，其中EDC和NHS的质量比例为2:1， 将dsDNA/Au电极浸入混合溶液中，震荡反应30min ;量子点溶液与EDC的质量体积比为O.05g/ml。
11)将电极冲洗干净，置于 O. IM pH=7. 4 PB + O. IM K2S2O8 + O. IM KCl 溶液中，以5CN 102928489 A书明说4/4页修饰好的电极作为工作电极，以钼丝为对电极，以甘汞电极为参比电极进行循环伏安扫描， 并用光电倍增管PMT收集光信号，PMT的电阻设置为1ΚΩ，电位扫描范围为0.8疒-1.8 V, 扫描速度为100 mV/s。
对比例I :
步骤2) 3) 4) 5)同实施例I;
I)单链ssDNA的准备将冷冻保存的单链ssDNA储备液在摇床中室温融化，备用； 其中单链 ssDNA 的序列如下5’ -SH-GACTGACCTCGGACG-NH2 ；
6)滴加 25μ ssDNA 在金电极表面，其中 ssDNA 为 25μ ssDNA + 2. 5μ IM MgCl2 的混合液，室温下保湿自组装16h，此电极记为ssDNA/Au电极；
7)电极的清洗用移液枪移取20μ 5mM pH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到ssDNA/ Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作10次，以除去未连接牢固的 ssDNA分子；
8)电极表面的封闭在ssDNA/Au电极的表面滴加25PL ImM 6_巯基己_1_醇MCH， 室温下保湿组装Ih ；
9)电极的清洗用移液枪移取20μ 5mM pH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到ssDNA/ Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作10次，以除去电极表面未连接牢固的MCH，此电极记为MCH封闭的ssDNA/Au ；
10)DNA与量子点的连接在量子点溶液中加入乙基_3_ 二甲基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC混合均匀后加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS，其中EDC和NHS的质量比例为2:1，将 ssDNA/Au电极浸入混合溶液中，震荡反应30min ；
11)将电极冲洗干净，置于 O. IM ρΗ=7· 4 PB + O. IM K2S2O8 + O. IM KCl 溶液中，以修饰好的电极作为工作电极，以钼丝为对电极，以甘汞电极为参比电极进行循环伏安扫描， 并用光电倍增管PMT收集光信号，PMT的电阻设置为1ΚΩ，电位扫描范围为0.8疒-1.8 V, 扫描速度为100 mV/s。
实施例2
步骤I) 2) 3) 4) 5) 6)7)8)9)10)同实施例 I ;
11)将电极冲洗干净，置于O. IM ρΗ=7· 4 ΡΒ+0. IM K2S2O8 +0. IM KCl溶液中，以修饰好的电极作为工作电极，以钼丝为对电极，以甘汞电极为参比电极进行循环伏安扫描，电位扫描范围为O. 8 V -1.8 V，扫描速度为100 mV/s。
对比例2
步骤I) 2) 3) 4) 5) 6)7)8)9)10)同对比例 I ;
11)将电极冲洗干净，置于O. IM pH=7. 4 PB+0. IM K2S2O8 +0. IM KCl溶液中，以修饰好的电极作为工作电极，以钼丝为对电极，以甘汞电极为参比电极进行循环伏安扫描，电位扫描范围为O. 8 V -1.8 V，扫描速度为100 mV/s。权利要求
1 .基于DNA电荷传递量子点电化学发光电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)双链dsDNA的杂交将冷冻保存的两条单链ssDNA储备液在摇床中室温融化，两条单链 ssDNA 的序列分别如下5’-SH-GACTGACCTCGGACG 和 5’_NH2_CGTCCGAGGTCAGTC ;分别取相同摩尔数的ssDNA储备液混合，将混合液于90°C恒温水浴5min，自然环境中冷却至室温，形成杂交的双链dsDNA，_20°C冷冻保存备用； 2)ImM 6-巯基己-I-醇MCH的配制首先配制质量百分比浓度为5%的甘油磷酸缓冲液，然后用上述甘油磷酸缓冲液配制ImM 6-巯基己-I-醇MCH; 3)CdSe量子点的合成将CdCl2和巯基乙酸TGA混合后，用NaOH调节pH至10，注入硒源得到亮黄色澄清溶液，其中Cd2+ = TGA:Se2+的摩尔比为1:2. 5:0. 5 ;将所得的亮黄色澄清溶液于100°C冷凝回流4h，并将产物离心，所得的上清液即为量子点溶液，4°C避光保存； 4)金电极在绒布上打磨至表面光滑成镜面，依次在水-丙酮-水中分别超声，以去除电极表面的无机物和有机物；其中水的参数为以下，电阻率18. 2，总有机碳< 10，颗粒物< Ι/ml，微生物< I ; 5)以表面清洗干净的金电极为工作电极，钼丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用循环伏安方法在硫酸溶液中活化电极，活化40圈后结束立即取出电极，用水冲洗，备用； 6)滴加dsDNA和MgCl2的混合液在金电极表面，室温下保湿自组装16h,此电极记为dsDNA/Au 电极； 7)电极的清洗用移液枪移取5mMpH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到dsDNA/Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作，以除去未连接牢固的dsDNA分子； 8)电极表面的封闭在清洗后的dsDNA/Au电极的表面滴加ImM6-巯基己-I-醇MCH，室温下保湿组装Ih ； 9)电极的清洗用移液枪移取5mMpH=7. O磷酸盐缓冲溶液滴加到dsDNA/Au电极的表面，再移走此磷酸盐缓冲溶液，这一步骤反复操作，以除去电极表面未连接牢固的MCH，此电极记为MCH封闭的dsDNA/Au电极； 10)DNA与量子点的连接在量子点溶液中加入乙基-3- 二甲基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS得到混合溶液，其中EDC和NHS的质量比例为2:1，将MCH封闭的dsDNA/Au电极浸入混合溶液中，反应30min。
全文摘要
一种基于DNA电荷传递量子点电化学发光电极的制备方法，属于电化学发光领域。将打磨光滑、清洗干净的金电极在硫酸溶液中采用循环伏安方法活化；将DNA滴加在金电极表面，并以6-巯基己-1-醇MCH做封闭，再将DNA/Au电极浸泡在硒化镉量子点、乙基-3-二甲基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合溶液中剧烈震动反应30min；以修饰好的金电极为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在电解液中用循环伏安方法扫描，并用光电倍增管PMT收集光信号，PMT的电阻设置为1KΩ，电位扫描范围为0.8 V~ -1.8 V，扫描速度为100 mV/s。本发明的电极可以直观的研究DNA的电荷传递作用，并且具有良好的电化学发光性能，条件温和。
文档编号G01N27/327GK102928489SQ201210452679
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者李萌, 鲁理平 申请人:北京工业大学