专利名称：分泌型抗精子抗体检测试剂盒及使用方法
技术领域：
一种分泌型抗精子抗体酶免检测试剂盒及其检测方法，属于酶免疫分析技术领域。
背景技术：
不孕不育，分为不孕症和不育症，根据发生的原因可分为器质性、免疫性、医源性、感染性、生理性不孕，根据是否有过妊娠史可分为原发性不孕和继发性不孕。还有10% 20%的患者原因不明，在此类患者中，免疫因素占据30 40%起着不可忽视的作用。因此免疫性不孕的临床诊治越来越被人们重视，它将有助于临床的诊断与治疗，为患者带来福音。抗精子抗体(AsAb)主要有IgG、IgM、IgA3种类型，是一个复杂的病理产物，其作用主要表现为精子凝集、精子制动，影响精子的运送，抑制精子穿透宫颈黏液，限制精子与卵透明带粘附，抑制精子顶体的活性，使精子不易穿透包绕卵细胞的放射冠和透明带，阻碍精子与卵细胞膜的融合，阻止精子与卵子结合及影响胚胎的存活，导致死胎和流产等。分泌型IgA抗体(SIgA抗体)可分为血清型和分泌型，血清型多为IgA单体，分泌型多为IgA 二聚体和多聚体，IgA可以单体、二聚体甚至多聚体的形式存在，聚合体不仅结合抗原的能力增强，还可使IgA能结合分泌片，赋于IgA以特殊的活性。IgA型抗体也与习惯性流产密切相关，ASAb还可通过干扰细胞滋养层向合体滋养层的转化，干扰细胞间信息的传播等作用而导致流产。局部免疫SIgA是由J链连接成的双聚IgA与SC(分泌片段)结合后形成的复合物，多为二聚体或多聚体而不易检测。SIgA与IgA在免疫功能上具有不同之处，作用的最大特点是将抗原抗体的反应控制在膜免疫系统的局部，而且是以非炎症的方式限制抗原物质对粘膜表面的侵入。SIgA的重链有一个含额外半胱氨酸的C端结构，可与B细胞产生的J链相结合，使IgA形成二聚体或多聚体。聚合体不仅结合抗原的能力增强，J链对于SIgA的形成有两个重要的功能，除了使IgA形成双聚体，在多聚IgA(多聚免疫球蛋白)与SC/pIgR(多聚免疫球蛋白受体)结合的亲和性方面也起了重要作用，在排除抗原方面发挥了重要的作用，不仅可以通过聚集潜在入侵的病原体使之易于蠕动和粘液纤毛运动将其清除，而且SC能通过其糖类残基使SIgA能与沿着表皮表面的粘膜抗体锚着于适当的组织处，破坏抗原的定位，进而清除抗原，SC上的N-糖基为抗原粘附和凝集素的结合提供了很多表位，因此，SIgA抗体在生殖免疫中起到重要作用。盐酸氨溴索为粘液溶解剂，临床上用于呼吸病人能增加呼吸道粘膜浆液腺的分泌，从而降低痰液粘度，促进肺表面活性物质的分泌，增加支气管纤毛运动，使痰液易于咳出。本品的巯基(-SH)结构可使粘蛋白的双硫(-S-S-)结构断裂，降低宫腔分泌物粘度，碳酸氢钠也可以降低分泌物的粘稠度，使分泌型抗精子抗体的多聚体转变为单体而易于ELISA法检测。采用聚苯乙烯反应板条固相吸附精子抗原，在反应过程中若被检样本存在抗精子抗体，则与板条中包被的精子抗原结合，形成抗原-抗体复合物，再与酶标记的二抗形成抗原-抗体-抗抗体复合物，并结合在微孔壁表面，通过底物作用在相应检测孔中出现蓝色，用以特异性的检测分泌物中的抗精子抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种样品前处理简单，提取后可直接测定，简便、快速、灵敏、准确的检测分泌型抗精子抗体的方法。本发明试剂盒主要由盒体(I)，酶标板⑵中设有反应孔⑶的板条，A试剂瓶(分泌物前处理液)(4)，B试剂瓶(酶标记的抗精子二抗)(5)，C试剂瓶(含吐温-20的磷酸盐PBS溶液)(6)，D试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(7)，E试剂瓶(H2O2) (8)，F试剂瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶标板(2)均放在盒体(I)内。本发明的原理是采用盐酸氨溴索分解宫腔分泌物分泌型抗体，然后采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测分泌型抗精子抗体。
具体实施例方式一、抗精子抗体酶标板的制备将精子抗原用包被液稀释成1: 200倍，加入IOOu I包被微孔反应板的微孔，力口入含1%小牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液350 Ul/每孔，室温封闭2小时，4°C过夜。甩尽孔内液体后，用洗涤液洗3次，每次3分钟。二、酶标记抗体的制备(I)将辣根过氧化物酶5mg溶于0. 5ml 0. 2mol/L pH5. 6HAC-NaAc缓冲液中，滴入0. lmol/L NaIO4 0. 25ml,4°C 30 分钟。(2)加入 2. 5% 乙二醇 0. Sml，室温下 30min。(3)加入抗精子抗体5 IOmg,用1. Ommol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液调整反应液的pH至9.0左右，4°C过夜。(4)加入 NaHB4 0.1ml 混匀，4°C 2 小时后对 0. 01mol/L pH7. 4PBS 透析，4°C过夜。加入适量中性甘油后小量分装。三、洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)配置:0. 15M KH2PO4 0. 2 克，Na2HPO4 12H20 2. 9 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，Tween-20 0. 05% 0. 5ml 加蒸馏水至 1000ml。四、前处理液的配置在IL洗涤液中加入盐酸氨溴索30g，碳酸氢钠IOg即为前处理液。
图1分泌型抗精子抗体试剂盒示意图。图2酶标板示意图。图3酶标板条与反应孔示意图。
具体实施例方式实施例I1.样品处理取待检患者宫颈分泌物拭子，加入到2ml前处理液中剧烈震荡，静至60min，待用。2.检测方法使用前，将分泌型抗精子抗体试剂盒平衡至室温，取IOOiU经盐酸氨溴索溶解剂处理的分泌物溶液、阴阳性对照加入到酶标板孔中，震荡混匀后，至37°C水浴箱水浴20min，应用洗涤液洗涤5次，拍干，每孔加入酶标液50 yl，至37 °C水浴箱水浴20min，应用洗涤液洗涤5次，拍干，加入试剂D、试剂E各50 yl，至37°C水浴箱水浴lOmin，加I滴终止液，酶标仪读取结果。3.结果判定可于白色背景上，直接用肉眼观察结果反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测OD值在ELISA检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
权利要求
1.一种分泌型抗精子抗体酶免疫检测试剂盒，其特征在于由盒体(1)，酶标板(2)中设有反应孔(3)的板条，A试剂瓶(分泌物前处理液)(4)，B试剂瓶酶(酶标记的抗精子二抗)(5)，C试剂瓶(含吐温-20的磷酸盐PBS溶液)(6)，D试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(7)， E试剂瓶(H2O2) (8)，F试剂瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶标板(2)均安放在盒体(I)内。
2.根据权利要求I所述的分泌型抗精子抗体酶免疫检测试剂盒，其特征在于所述的塑料托架(10)上制有孔和凹槽。
3.根据权利要求I所述的分泌型抗精子抗体酶免疫检测试剂盒，其特征在于所述的酶标板(2)有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成均放在盒体(I)内。
4.一种分泌型抗精子抗体检测方法，其特征在于取待检患者宫颈分泌物拭子，加入到 2ml含有30g/L盐酸氨溴索-PBS缓冲液中剧烈震荡，静至60min，分别取100 μ I经盐酸氨溴索-PBS缓冲液液处理的分泌物溶液、阴阳性对照加入抗精子抗体ELISA反应孔中，震荡混匀后，至37°C水浴箱水浴20min，应用洗涤液洗涤5次，拍干，每孔加入酶标液50 μ 1，至 37°C水浴箱水浴20min，应用洗涤液洗涤5次，拍干，加入试剂D、E各50 μ 1，至37°C水浴箱水浴IOminJP I滴终止液酶标仪测定A49tlnm值。
5.按照权利要求4所述的分泌型抗精子抗体检测方法，其特征在于所述的A试剂瓶 (分泌物前处理液)为含有30mg/L盐酸氨溴索PBS-Tween缓冲液。
6.按照权利要求4所述的分泌型抗精子抗体检测方法，其特征在于所述的B试剂瓶，为辣根过氧化物酶标记的抗精子二抗。
7.按照权利要求4所述的分泌型抗精子抗体检测方法，其特征在于所述的酶底物液，D 试剂瓶为邻苯二胺(OPD)试剂，E试剂瓶为比02。
全文摘要
本发明公开了一种分泌型抗精子抗体酶免疫检测试剂盒及其检测方法，属于酶免疫分析技术领域，本发明配制的试剂盒，通过盐酸氨溴索使宫颈分泌物中分泌型IgA抗精子抗体多聚体的双硫键(-S-S-)结构断裂转变成可溶性单体，加入到抗精子抗体检测酶标板上，采用酶免疫吸附(ELISA)法检测分泌型抗精子抗体，经温浴、洗涤、加酶标二抗，使两者进行反应、洗涤、加入酶底物显色。本发明前处理简单，快速、灵敏、准确、廉价的检测方法，适用于宫腔分泌物分泌型抗精子抗体检测，可以作为不孕不育的重要检查指标。
文档编号G01N33/53GK102980994SQ20121046003
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者李立和, 常玉芝, 杨帅, 尹振宇 申请人:天津市宝坻区人民医院