专利名称：一种时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17α-OHP的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种时间分辨免疫时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17 a-羟孕酮(1-a-hydoxy progesterone, 17 a -0ΗΡ)的试剂盒,特别涉及竞争免疫时间分辨免疫突光法快速检测新生儿体内17 a-OHP浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的17 a -OHP浓度水平进行快速检测，从而辅助新生儿先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,CAH)的诊断。
背景技术：
新生儿筛查是指在新生儿群体中，用快速、敏感的实验室方法对新生儿的遗传代谢病、先天性内分 泌异常以及某些危害严重的遗传性疾病进行筛查的总称，其目的是对那些患病的新生儿在临床症状尚未表现之前或表现轻微时通过筛查，得以早期诊断、早期治疗，防止机体组织器官发生不可逆的损伤。避免患儿发生智力低下、严重的疾病或死亡。新生儿筛查一般是在婴儿出生后三天采取脐血或足跟血的纸片进行。先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia, CAH)是一组常染色体隐性遗传、内分泌代谢失调病，分别由21-羟化酶、Ilb羟化酶、3b类固醇脱氢酶、17a羟化酶等缺陷所造成的，其中21-羟化酶缺乏症是CAH中最为多见的一种(90% 95% )，其共同特点是皮质醇合成障碍，引起促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌增加导致肾上腺增生，出现脱水、失盐、外生殖器性别不清、生长加速、皮肤黏膜色素沉着、不同程度的男性化等各种不同临床表现。但可通过检测新生儿17 a -OHP浓度水平筛查出大部分CAH患儿，并经过及时及早的治疗，病情可以得到有效的控制。17 α -轻孕酮(l-α-hydoxy progesterone,17 α -0ΗΡ)是一种内源性孕激素，由肾上腺皮质及性腺产生，目前是最常用的筛查CAH的敏感指标。CAH发病率在不同人群中差异很大。有学者对无锡地区新生儿CAH发病率进行统计，其结果为1/15321 (4/61284)(吴志君，朱云霞，陈道桢.无锡地区新生儿先天性肾上腺皮质增生症的发病情况探讨[J].中国优生与遗传杂志，2006，14 (10):72)。孙亦骏等亦对南京地区新生儿CAH发病率进行过调查，发现该地区的CAH发病率为1/25000 (2/50000)(孙亦骏，张瑾，张汝帆.新生儿疾病筛查中先天性肾上腺皮质增生症的检出[J].中国优生与遗传杂志，2000，8 (I):74-80)。据新生儿筛查资料统计，经典型(21-羟化酶缺乏症)CAH 的发病率在欧洲为 I: 14000 I: 10000 (Therrell BL Jr, Berenbaum SA,Manter-Kapanke V，et al.Results of screeningl.9million Texas newborns for21-hydroxylase-deficient congenital adrenal hyperplasia[J].Pediatrics.1998Apr ；101 (4Pt I):583-90.)，日本为 I: 15000 (Tajima TiFujieda KiNakae J，et al.Molecularbasis of nonelassical steroid 21-hydroxylase deficiency detected by neonatalmassscreening in Japan[J].J Clin Endocrinol Metab.1997Jul ；82 (7):2350-6.)
近年由于环境污染、食品卫生等问题导致该病发病率呈一定上升趋势。我国是世界上人口最多的国家，进行新生儿筛查的人群基数很大，开发本项目具有较大的市场前景。目前常用的新生儿血片筛查主要是雷勃公司(Ani Labsystems)的新生儿17 a-OHP检测试剂盒(荧光酶免疫分析法)，但酶标记物不稳定、反应本底较高，另外实验耗时较长，约需18-20小时，且价格昂贵，购买周期长，不利于大规模的新生儿筛查工作的进行。本发明人利用时间分辨免疫时间分辨免疫突光法(Time-resolved fluorescenceimmunoassay, TRFIA)技术发明一种定量测定新生儿17 a -OHP的试剂盒,应用于新生儿体内17 a-OHP含量的检测，辅助新生儿先天性肾上腺皮质增生症(CAH)的诊断。TRFIA具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、多标记、无放射性污染等优点，灵敏度超过放射免疫(RIA)2 3个数量级。现已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。有利于疾病筛查工作的大规模顺利开展。本发明的试剂盒作为国内首个新生儿17 a-OHP定量测定的试剂盒，选用新生儿足跟血滤纸干血片为检测样本,并利用时间分辨免疫荧光法,其性能已达到并超过对照同类雷勃公司(Ani Labsystems)和PE公司的进口新生儿筛查17 a -OHP定量测定试剂盒，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便及成本低廉等显著优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用时间分辨免疫荧光分析技术进行新生儿17 a -OHP定量测定的试剂盒。时间分辨免疫荧光法(TRFIA)定量测定17 a -OHP (17 a -hydoxy progesterone)试剂盒是应用竞争免疫时间分辨免疫荧光法，采用羊抗兔IgG的多克隆抗体包被反应板，捕获定量加入的抗17 a -OHP的抗体，检测时加入参考标准品或待测样品和17 a -OHP-BSA-Eu，标本中的17 a -OHP和17 a -OHP-BSA-Eu竞争结合被羊抗兔IgG捕获的抗17 a -OHP抗体，形成二抗-抗17 a -OHP-17 a -0HP-BSA-DTTA-Eu复合物。当铕在增强液中从复合物上解离后发出强的荧光，荧光强度与样品中的17 a -OHP浓度成反比。通过标准曲线拟合，从而`对新生儿体内17 a-OHP含量进行定量测定。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案:I)根据和对照同类进口试剂盒进行临床测值比较:为了实现本发明，需要对试剂盒所使用的原料进行筛选，从而确定最佳的原料，这一筛选过程包括校准品配制原料纯度、校准品配制基质、抗体的稀释比例、铕标记物的稀释比例以及包被反应板的本底及变异大小等。2)确定试剂盒的组分及配方，包括:分析缓冲液配方等，并公开了浓缩洗液配方。本发明提供的一种时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17 a -OHP试剂盒，包括:I)校准品滤纸干血片2)质控品滤纸干血片3)抗体4)铕标记物5)分析缓冲液6)浓缩洗液
7)包被反应板，和分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒。根据本发明一个优选的实施方案，校准品滤纸干血片和质控品滤纸干血片由17 a -OHP溶解在校准品和质控品基质中，并滴在市售滤纸上。校准品和质控品滤纸干血片根据17 a-OHP浓度不同分别编号A-F和Cl、C2、C3，其中17 a-OHP可使用市售产品，市售滤纸优选Whatman903#滤纸。编号A-F的校准品滤纸干血片和C1-C3的质控品干血片加入17 a -OHP如表I所示:
权利要求
1.一种时间分辨免疫突光法定量测定新生儿17 α -轻孕酮(1- a -hydoxyprogesterone, 17 a -OHP,)的试剂盒,试剂盒包括:分别装有分析缓冲液、抗体、铕标记物、浓缩洗液、增强液等多个试剂瓶，96孔包被反应板、校准品滤纸干血片、质控品滤纸干血片，和分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于分析缓冲液由Tris-HCl(50mmol/L),NaCl (0.9% ), BSA (0.1% )与 Danazol (I μ g/ml)，pH 7.8 组成。
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于抗体为兔抗-17a -OHP,为液态，分析缓冲液的主要组分为 Tris-HCl (50mmol/L)，NaCl (0.9% ), BSA(0.1% )与 Danazol (I μ g/ml)，pH 7.8。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于铕标记物由17a -OHP-BSA-Eu组成，为液态,稀释比例为 I: 1000，稀释液组分为:Tris-HCl(50mmol/L)、Procline-300 (0.05% )与BSA(0.02% )，pH = 7.4。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于浓缩洗液25X为Tris-base(7.5% )，NaCl (21% ), Tween-20 (1.5% )，pH = 7.8。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于校准品滤纸干血片制备方法为:脱纤维绵羊全血，使用无菌生理盐水洗涤5-6次后调整红细胞压积至0.55，加入17 a -OHP原料，配制不同浓度的校准品，60 μ I/滴滴到Whatman903#滤纸上，滤纸平放室温自然晾干，2_8°C保存，各点校准品浓度如下:
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于质控品滤纸干血片制备方法为:脱纤维绵羊全血，使用无菌生理盐水洗涤5-6次后调整红细胞压积至0.55，加入17 a -OHP原料，配制不同浓度的质控品，60 μ I/滴滴到Whatman903#滤纸上，滤纸平放室温自然晾干，2_8°C保存，各点质控品浓度如下:
8.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于采用样本类型为新生儿足跟血滤纸干血片。
全文摘要
本发明涉及一种时间分辨免疫荧光分析法定量测定新生儿17α-羟孕酮(1-α-hydoxyprogesterone，17α-OHP)的试剂盒，特别涉及竞争时间分辨免疫荧光分析法快速检测新生儿体内17α-OHP浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的17α-OHP浓度水平进行快速检测，从而辅助新生儿先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)的诊断。
文档编号G01N33/74GK103235143SQ201210589808
公开日2013年8月7日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者吴英松, 李明, 邓传欢, 董志宁, 江剑辉, 何蕴韶 申请人:中山大学达安基因股份有限公司