专利名称：一种铁蛋白的示踪标记检测试剂盒的制作方法
技术领域：
一种铁蛋白的示踪标记检测试剂盒，可用于对铁蛋白含量的检测，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域。
背景技术：
在自然界中，多数动植物及微生物机体中均存在着一种高效维持体内铁平衡的蛋白质，简称铁蛋白(ferritin，FER)，分子量约450000，含铁17°/Γ23%，是铁的主要贮存形式之一，几乎所有真核细胞都含有FER。血清FER浓度降低常见于缺铁性贫血，隐性缺铁性贫血。溶血性贫血患者血清FER增加，巨幼红细胞贫血、再生障碍性贫血及急性造血停滞等血清FER显著增加。肝炎、肝硬化伴有肝细胞受损时血清FER明显升高。恶性肿瘤血清FER常见增高。慢性肾病患者和肺·结核患者也可以引起血清FER明显升高。测定孕妇血清FER可作防治孕期缺铁及贫血的有效指标。目前FER的检测方法包括以同位素标记的放射免疫分析、以酶标记的酶联免疫分析法、以稀土离子铕标记的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等等，其中TRFIA是采用稀土元素铕(Eu)标记抗体。基于Eu3+独特的光谱学性质，配合荧光检测仪的时间门电路的使用，大大提高了免疫分析的灵敏度(IO-17HK)I / L)，且没有放射性危害和放射性废物，具有测量范围宽、特异性强、标记物稳定及货架寿命长、检测速度快、操作较简便等优点。现有的FER时间分辨荧光免疫分析法是基于微孔板双抗体夹心原理的固相时间分辨荧光免疫分析，Eu离子通过双功能螯合剂DTTA标记在FER的特异性抗体。本方法提供一种新的标记方法，不需要借助螯合剂，利用FER的自然属性进行标记。FER由含24个亚单位的空蛋白壳和4500个铁原子组成。FER的24亚基分H和L两类，在pH 2. O条件下，FER蛋白壳能解离成游离的亚基并释放出铁离子，随着pH值递增，游离的亚基可重新组装成FER。采用类似方式，FER可通过亚基解离途径直接捕获一些其他的金属离子及各类有机小分子。利用FER的自组装的特性，不需双功能螯合剂，直接将稀土离子Eu包埋在FER分子里面，可用于建立竞争的FER时间分辨荧光免疫分析法等。
实用新型内容本实用新型的目的在于提供一种检测铁蛋白的试剂盒及其检测方法，利用FER的24个亚基自组装形成中空的球形壳可以包裹金属离子的特性，在pH2. O附近将FER解离后与EuCl3混合30分钟，再用Na2CO3将pH调到8. 0，游离的亚基可重新组装成FER分子，同时将Eu包裹在FER里面。通过超滤分离，去除没有包裹进去的EiuFe等离子，得到Eu标记的FER0本发明标记方法简单，使用方便。本实用新型的技术方案一种铁蛋白FER的示踪标记检测试剂盒，采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测铁蛋白，该检测铁蛋白的试剂盒是由96或48孔包被羊抗鼠抗体的包被板(I)，工作缓冲液(2 )，铁蛋白标准(3 )，铁蛋白单克隆抗体冻干品(4)，包裹Eu的铁蛋白标记物(5 )，洗涤液(6 )和增强液(7 )所组成。所述96或48孔包被羊抗鼠抗体的包被板(I):用pH9. 6、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液将亲和层析提纯的羊抗鼠IgG稀释至10mg/L，ΙΟΟμ ν孔包被，4°C过夜，弃包被液，拍干板，每孔加250μ 封闭液封闭2h，弃封闭液，真空抽干，密封，_20°C保存。所述封闭液pH9. 6、含 2%BSA 的 50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 缓冲液。所述工作缓冲液(2):ρΗ7·8、含 8mmol/L NaCUO. 1%BSA、50 μ mol/L 二乙烯三胺五 乙酸(DTPA)、0. lml/L Tween-80 和 0. l%NaN3 的 Tris-HCl。所述铁蛋白标准(3) :6XFER标准液，I. OmL/瓶，铁蛋白标准液浓度分别为0ng/mL, 5ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL, 500ng/mL, 100 Ong/mL,从 FER 纯品中稀释得到，稀释液为
工作缓冲液。所述铁蛋白单克隆抗体冻干品(4):购于天津协和医药科技有限公司。所述包裹Eu的铁蛋白标记物(5):将IOOPg FER溶解在200μ pH 2. 0,0. lmol/L的HCl溶液中，将FER解离，加入10μ 0. lMmol/L的EuCl3溶液，混合30分钟，再用Na2CO3将PH调到8. O,游离的亚基重新组装成FER分子，同时将Eu包裹在FER里面，通过超滤分离，去除没有包裹进去的EiuFe离子，得到Eu标记的FER。所述洗涤液(6)pH7. 8、含 14. 5mmol/L NaCl.O. 2ml/LTween_80 和 0. 2%NaN3 的SOmmoI/T, Tris-HCl。所述增强液(7):1升pH 3.2、含15Mmol β -萘甲酰三氟丙酮β _NTA，50Mmol三正辛基氧化膦Τ0Ρ0，ImL曲拉通X-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。用所述的试剂盒检测FER的方法，取包被有羊抗鼠抗体的微孔包被板，加入25μ 的FER标准或样品到各自的微孔中，加25μ 以缓冲液稀释的抗FER单克隆抗体，加以pH7. 8 的 50mmol/L Tris-HCl (含 0. l%NaN3、0. 2%BSA、0. 9% NaCl)稀释的 50μ Eu3+-FER, 25°C振荡I小时，用洗涤液洗六次，加200μ 增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的FER的含量。本实用新型的有益效果本实用新型配制的试剂盒，采用TRFIA检测铁蛋白，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有羊抗鼠抗体，加入铁蛋白标准或样品，再加入包裹Eu的铁蛋白标记物及抗铁蛋白单克隆抗体。游离的铁蛋白与标记铁蛋白竞争铁蛋白抗体，没有连接的铁蛋白被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的铁蛋白浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中铁蛋白的含量。该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高。
图I检测铁蛋白的试剂盒。图2 FER-TRFIA的标准曲线。
具体实施方式
实施例I检测血清中的FEREu 标记的 FER :将 IOOPg FER 溶解在 200μ pH 2. 0、0· lmol/L 的 HCl 溶液中，将FER解离，加入10μ 0. lMmol/L的EuCl3溶液，混合30分钟，再用Na2CO3将pH调到8. 0，游离的亚基可重新组装成FER分子，同时将Eu包裹在FER里面。通过超滤分离，去除没有包裹进去的Eu、Fe等离子,得到Eu标记的FER。微孔板包被羊抗鼠抗体用pH9. 6、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液将亲和层析提纯的羊抗鼠IgG稀释至10mg/L，ΙΟΟμ ν孔包被，4°C过夜。弃包被液，拍干板，每孔加250μ 封闭液封闭2h，弃封闭液，真空抽干，密封，-20°C保存。抗FER 单克隆抗体的稀释用 pH7. 8、含 O. l%NaN3>0. 2%BSA、0. 9% NaCl 的 50mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释抗FER单克隆抗体至100ng/mL。试剂的配制工作缓冲液ρΗ7·8、含 8mmol/L NaCUO. 1%BSA、50 μ mol/L 二乙烯三胺五乙酸(DTPA),0. lml/LTween-80 和 0. l%NaN3 的 Tris-HCl。FER标准(0ng/mL, 55ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL, 500ng/mL, lOOOng/mL),从FER纯·
品中稀释得到，稀释液为工作缓冲液。洗涤液pH7.8、含 14. 5mmol/L NaCl.O. 2ml/LTween_80 和 O. 2%NaN3 的 50mmol/LTris-HCl。增强液的配制1升pH 2、含15Mmol β -萘甲酰三氟丙酮(β _NTA)，50Mmol三正辛基氧化膦(TOPO)，ImL曲拉通x-100 (Triton X-100)的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。试剂盒提供的试剂每一个试剂盒中的试剂足够进行96个测量，试剂盒中的材料如下(I)、1X96孔板(8条X 12孔，可以拆分为单孔)包被有羊抗鼠抗体。(2)、6XFER标准液，I. OmL/瓶，铁蛋白标准液浓度分别为0ng/mL，5ng/mL，IOng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mLo(3)、I X FER抗体冻干品，用时0. 5mL蒸馏水溶解。(4)、I X Eu3+-FER, 0. 5mL。(5)、1X 增强液15mL。(6)、1 X洗涤液30 mL，用时以蒸馏水I : 25稀释。(7)、I X 工作缓冲液30 mL。蒸馏水或去离子水。测定之前注意事项I、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30°C )。2、使用之后立即将所有试剂放回2-8 °C。3、如果样品量大建议使用多通道移液器。4、在所有恒温孵育过程中避免光线照射，用盖子盖住微孔。5、取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2_8°C。TRFIA分析步骤取包被有羊抗鼠抗体的微孔包被板，加入25μ 的FER标准或样品到各自的微孔中，加25μ 以缓冲液稀释的抗FER单克隆抗体，加以ρΗ7. 8的50mmol/LTris-HCl (含 0. l%NaN3、0. 2%BSA、0. 9% NaCl)稀释的 50μ Eu3+-FER, 25°C振荡 I 小时，用洗涤液洗六次，加200μ 增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的FER的含量。见表1，该例的样品浓度为122ng/mL。[0046]表I
权利要求1.一种铁蛋白的示踪标记检测试剂盒，其特征在于采用时间分辨荧光免疫分析法TRFIA检测铁蛋白，该检测铁蛋白的试剂盒是由96或48孔包被羊抗鼠抗体的包被板(I)，工作缓冲液(2),铁蛋白标准(3),铁蛋白单克隆抗体冻干品(4),包裹Eu的铁蛋白标记物(5 )，洗涤液(6 )和增强液(7 )所组成。
专利摘要一种铁蛋白的示踪标记检测试剂盒，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对血清中铁蛋白含量的检测。本实用新型配制的试剂盒，采用TRFIA检测铁蛋白，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有羊抗鼠抗体，加入铁蛋白标准或样品，再加入包裹Eu的铁蛋白标记物及抗铁蛋白单克隆抗体。游离的铁蛋白与标记铁蛋白竞争铁蛋白抗体，没有连接的铁蛋白被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的铁蛋白浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中铁蛋白的含量。该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高。
文档编号G01N33/577GK202757942SQ201220073240
公开日2013年2月27日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者黄飚, 张艺, 张凯 申请人:江苏省原子医学研究所